一種測定血液中循環(huán)上皮腫瘤細胞數(shù)量的方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及涉及量化上皮腫瘤患者血液中重要上皮腫瘤細胞的濃度的測定，具體來說是一種測定血液中循環(huán)上皮腫瘤細胞數(shù)量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]人類記載腫瘤的存在已有3000多年的歷史。據(jù)統(tǒng)計有100多種腫瘤已被人們所發(fā)現(xiàn)。人體的任何部位均可能受到腫瘤的侵襲，惡性腫瘤已成為人類致死的第1或第2位原因。上皮性惡性腫瘤是癌癥實體瘤的最常見形式。大多數(shù)腫瘤患者的病故原因并不是原發(fā)性腫瘤，而是腫瘤的轉(zhuǎn)移。然而早期轉(zhuǎn)移與復發(fā)在初期診斷時常常被忽略。
[0003]本發(fā)明涉及指示實體瘤的存在。實體瘤的轉(zhuǎn)移與復發(fā)是癌癥高死亡率的主要原因。它是由散播在淋巴結(jié)或外周血中的腫瘤細胞引起的。不少文獻證據(jù)表明，循環(huán)上皮腫瘤細胞代表了轉(zhuǎn)移的最早指征。在某種環(huán)境條件下，一些循環(huán)腫瘤細胞可以到達機體遠端移植生長。在一些腫瘤案例中，移植部位是已知的。乳腺癌、大腸癌的一個移植部位即骨髓，正常骨髓細胞中腫瘤細胞的發(fā)病率至多10-3到10-7。獲取樣本用于骨髓診斷需要一個特殊的步驟，跟手術(shù)同步進行或手術(shù)后進行。常規(guī)診斷要求重復這個步驟?？紤]到帶給患者的不便以及費用和時間支出，力圖盡可能地減少手術(shù)，我們致力于一種更加便捷又有效的方法檢測循環(huán)上皮腫瘤細胞。
[0004]在樣本的獲取中，外周血的獲取較容易實現(xiàn)，檢測外周血就有很大的可能性。問題在于，外周血中存在的腫瘤細胞數(shù)量極少。而另一個困難之處在于高劑量化療或自體外周血干細胞移植時循環(huán)腫瘤細胞會傳染。因此，要求有高靈敏度的系統(tǒng)來檢測如此少量的殘留腫瘤細胞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中循環(huán)腫瘤細胞的富集過程容易因為多種原因造成循環(huán)腫瘤細胞的丟失或破壞的缺陷，提供一種測定血液中循環(huán)上皮腫瘤細胞數(shù)量的方法來解決上述問題。
[0006]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0007]—種測定血液中循環(huán)上皮腫瘤細胞數(shù)量的方法，所述方法包括以下步驟:
[0008]A、從測試對象處獲得測試項目的血液樣本，樣本為抗凝全血，懷疑其中含有上皮腫瘤細胞；
[0009]B、陰性富集去除血液樣本中的非目的細胞，它們包括紅細胞和絕大多數(shù)白細胞；
[0010]C、將富集后血樣與熒光標記抗體混合，孵育使得目的細胞與熒光抗體充分結(jié)合；
[0011]D、將熒光標記細胞懸液涂于防脫玻片上，靜置片刻，與熒光顯微鏡下觀察、分析樣品，以便確定循環(huán)上皮腫瘤細胞的存在與數(shù)量；
[0012]E、將觀察到的目的細胞保存為直接可視圖像。
[0013]優(yōu)選地，所述抗凝全血用檸檬酸葡萄糖溶液抗凝保存，不超過24小時。
[0014]優(yōu)選地，所述紅細胞去除通過裂解液裂解后離心分離上清和沉淀，棄去上清，沉淀重懸成細胞懸液，懸液中含有白細胞與上皮腫瘤細胞。
[0015]優(yōu)選地，所述白細胞通過免疫磁性方法去除，包括以下步驟包括:
[0016]A、將細胞懸液與包被抗白細胞表面抗原抗體的磁珠混勻，孵育使得白細胞與免疫磁珠充分結(jié)合；
[0017]B、混合液通過磁場中的磁性分選柱，去除絕大多數(shù)白細胞，收取過柱后懸液，懸液中含有少量白細胞與上皮腫瘤細胞。
[0018]優(yōu)選地，所述熒光標記抗體包括:
[0019]a) FITC標記抗上皮腫瘤細胞特異性抗體；
[0020]b)PE、PE-TaxRed或APC標記抗白細胞表面抗原抗體。
[0021]優(yōu)選地，所述FITC標記抗上皮腫瘤細胞特異性抗體包括抗EpCAM抗體、抗CK抗體。
[0022]優(yōu)選地，所述PE、PE-TaxRed或APC標記抗白細胞表面抗原抗體為抗⑶45抗體。
[0023]優(yōu)選地，所述熒光標記抗EpCAM抗體與抗⑶45抗體應用細胞表面染色技術(shù)，熒光標記抗CK抗體應用細胞內(nèi)染技術(shù)。
[0024]優(yōu)選地，所述防脫玻片為多聚賴氨酸包被玻片。
[0025]優(yōu)選地，確定上皮腫瘤細胞的步驟包括:
[0026]a) DAPI標記陽性，藍色，標記核；
[0027]b)FITC標記陽性，綠色，標記細胞表面或骨架；c)PE、PE-TaxRed或APC標記陽性，標記白細胞。
[0028]優(yōu)選地，所述可視圖像為藍、綠、紅三色圖像。
[0029]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:其檢測將有助于腫瘤早期診斷、轉(zhuǎn)移及復發(fā)監(jiān)測、療效及預后評估、耐藥監(jiān)測、及個體化治療的指導等。在局部疾病患者的外周血中若檢測到腫瘤細胞，不僅具有較早檢測腫瘤的潛力，而且能夠提供潛在腫瘤入侵的指征。若在腫瘤患者術(shù)后檢測到循環(huán)腫瘤細胞，如果是復發(fā)跡象，可以及時開始用藥治療。治療過程監(jiān)測中，若循環(huán)腫瘤細胞數(shù)量改變，可以預測進展(增加)或反應(減少)來判斷療效。
【具體實施方式】
[0030]為使對本發(fā)明的結(jié)構(gòu)特征及所達成的功效有更進一步的了解與認識，用以較佳的實施例詳細的說明，說明如下:
[0031]—種測定血液中循環(huán)上皮腫瘤細胞數(shù)量的方法，所述方法包括以下步驟:
[0032]A、從測試對象處獲得測試項目的血液樣本，樣本為抗凝全血，懷疑其中含有上皮腫瘤細胞、陰性富集去除血液樣本中的非目的細胞，它們包括紅細胞和絕大多數(shù)白細胞；
[0033]C、將富集后血樣與熒光標記抗體混合，孵育使得目的細胞與熒光抗體充分結(jié)合；
[0034]D、將熒光標記細胞懸液涂于防脫玻片上，靜置片刻，與熒光顯微鏡下觀察、分析樣品，以便確定循環(huán)上皮腫瘤細胞的存在與數(shù)量；
[0035]E、將觀察到的目的細胞保存為直接可視圖像。
[0036]血樣來自腫瘤患者和正常捐獻者。正常捐獻者血中混入人宮頸癌細胞株Hela229(中國科學院細胞所)。Hela229用Mitotracker預染。外周血白細胞和腫瘤細胞用血球計數(shù)板計數(shù)。細胞株細胞數(shù)10-100不等，并與1ml健康全血混勻。
[0037]正常捐獻者混腫瘤細胞株細胞測試:lml全血中加入10ml紅細胞裂解液(Qiagen)冷藏反應8-10min。800g離心獲取白細胞團，并用lml Buffer重懸。離心清洗后棄上清至100 μ 1。(加磁珠略)，加入lml Buffer混勾，(靠磁力架略)，離心清洗后棄上清至lOOul，(加焚光抗體略)，加入lml Buffer混勾，棄上清至100 μ 1，加入DAPI 5ul反應10_15min，體積增至600 μ 1，涂片兩張計數(shù)腫瘤細胞數(shù)。回收率平均值達80%以上。
[0038]腫瘤患者血測試:9ml (全血7.5ml)血樣分管裂解細胞，每毫升血樣用10ml裂解液處理，冷藏反應8-10min。800g離心獲取白細胞團，各管用lml Buffer重懸，轉(zhuǎn)移至同一支離心管。離心清洗后棄上清至200 μ 1。重懸至800 μ 1加入40 μ 1抗⑶45抗體(STEMCELL EasySep)，混勻孵育15min，再加入配套磁珠80 μ 1，混勻孵育lOmin。將反應液轉(zhuǎn)移到2ml EP管靠磁力架兩次去除磁珠(即去除與磁珠結(jié)合的白細胞)。離心獲取剩余細胞，重懸至400ul進行細胞表面染色，加入40 μ抗EpCAM熒光抗體和40 μ 1抗⑶45熒光抗體，冷藏反應30_40min。離心清洗后棄上清至100 μ 1，重懸至400 μ 1，加入400 μ 1固定液固定20min。離心清洗后棄上清至100 μ 1，加入300 μ 1抗體混合液(內(nèi)含40 μ 1抗CK熒光抗體)冷藏反應30min。加入lml Buffer混勻離心清洗細胞，棄上清后重懸至400 μ 1，加入10 μ 1 DAPI，反應10-15min后涂片計數(shù)腫瘤細胞。因患者情況差異，檢測值少時可得1_10個，多時可達1000以上。
[0039]以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明要求的保護范圍由所附的權(quán)利要求書及其等同物界定。
【主權(quán)項】
1.一種測定血液中循環(huán)上皮腫瘤細胞數(shù)量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: A、從測試對象處獲得測試項目的血液樣本，樣本為抗凝全血，懷疑其中含有上皮腫瘤細胞、陰性富集去除血液樣本中的非目的細胞，它們包括紅細胞和絕大多數(shù)白細胞； C、將富集后血樣與熒光標記抗體混合，孵育使得目的細胞與熒光抗體充分結(jié)合； D、將熒光標記細胞懸液涂于防脫玻片上，靜置片刻，與熒光顯微鏡下觀察、分析樣品，以便確定循環(huán)上皮腫瘤細胞的存在與數(shù)量； E、將觀察到的目的細胞保存為直接可視圖像。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定血液中循環(huán)上皮腫瘤細胞數(shù)量的方法，其特征在于，所述抗凝全血用檸檬酸葡萄糖溶液抗凝保存，不超過24小時。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定血液中循環(huán)上皮腫瘤細胞數(shù)量的方法，其特征在于，所述紅細胞去除通過裂解液裂解后離心分離上清和沉淀，棄去上清，沉淀重懸成細胞懸液，懸液中含有白細胞與上皮腫瘤細胞。4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的測定血液中循環(huán)上皮腫瘤細胞數(shù)量的方法，其特征在于，所述白細胞通過免疫磁性方法去除，包括以下步驟包括: A、將細胞懸液與包被抗白細胞表面抗原抗體的磁珠混勻，孵育使得白細胞與免疫磁珠充分結(jié)合； B、混合液通過磁場中的磁性分選柱，去除絕大多數(shù)白細胞，收取過柱后懸液，懸液中含有少量白細胞與上皮腫瘤細胞。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定血液中循環(huán)上皮腫瘤細胞數(shù)量的方法，其特征在于，所述焚光標記抗體包括: a)FITC標記抗上皮腫瘤細胞特異性抗體； b)PE、PE-TaxRed或APC標記抗白細胞表面抗原抗體。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的測定血液中循環(huán)上皮腫瘤細胞數(shù)量的方法，其特征在于，所述FITC標記抗上皮腫瘤細胞特異性抗體包括抗EpCAM抗體、抗CK抗體。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的測定血液中循環(huán)上皮腫瘤細胞數(shù)量的方法，其特征在于，所述PE、PE-TaxRed或APC標記抗白細胞表面抗原抗體為抗CD45抗體。8.根據(jù)權(quán)利要求1或5或6或7所述的測定血液中循環(huán)上皮腫瘤細胞數(shù)量的方法，其特征在于，所述熒光標記抗EpCAM抗體與抗CD45抗體應用細胞表面染色技術(shù)，熒光標記抗CK抗體應用細胞內(nèi)染技術(shù)。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定血液中循環(huán)上皮腫瘤細胞數(shù)量的方法，其特征在于，所述防脫玻片為多聚賴氨酸包被玻片。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定血液中循環(huán)上皮腫瘤細胞數(shù)量的方法，其特征在于，確定上皮腫瘤細胞的步驟包括: a)DAPI標記陽性，藍色，標記核； b)FITC標記陽性，綠色，標記細胞表面或骨架；c) PE、PE-TaxRed或APC標記陽性，標記白細胞。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種測定血液中循環(huán)上皮腫瘤細胞數(shù)量的方法，所述方法包括以下步驟：A、從測試對象處獲得測試項目的血液樣本，樣本為抗凝全血，懷疑其中含有上皮腫瘤細胞；B、陰性富集去除血液樣本中的非目的細胞，它們包括紅細胞和絕大多數(shù)白細胞；C、將富集后血樣與熒光標記抗體混合，孵育使得目的細胞與熒光抗體充分結(jié)合；D、將熒光標記細胞懸液涂于防脫玻片上，靜置片刻，與熒光顯微鏡下觀察、分析樣品，以便確定循環(huán)上皮腫瘤細胞的存在與數(shù)量；E、將觀察到的目的細胞保存為直接可視圖像。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：其檢測將有助于腫瘤早期診斷、轉(zhuǎn)移及復發(fā)監(jiān)測、療效及預后評估、耐藥監(jiān)測、及個體化治療的指導等。
【IPC分類】G01N33/533, G01N33/569
【公開號】CN105277697
【申請?zhí)枴緾N201510707696
【發(fā)明人】王超, 郜恒駿, 張寶峰, 周雁霞, 張小燕
【申請人】上海芯超生物科技有限公司
【公開日】2016年1月27日
【申請日】2015年10月27日