銳達生物科技有限公司)，流式細胞細胞洗滌液。在本實施例中，細胞通透劑為體積分數(shù)為1 %的Triton-XlOO溶液。所述細胞洗滌液為PBST(lX,pH7.4)
[0035]實施例3:人呼吸道病原體的流式細胞檢測方法
[0036]本實施例為利用實施例2中的流式細胞檢測試劑盒進行單項病原體(Adv)感染檢測的方法，按如下步驟進行:
[0037]1、支氣管肺泡灌洗液標本采集和細胞固定:由專業(yè)醫(yī)護人員采集，采樣完畢后，取3ml放入采樣管中。將所述采樣管500g離心8分鐘，棄去上清，注意不要吸走細胞層。加入3ml細胞固定液并重懸細胞，旋緊管蓋。將所述采樣管正立置于一 20°C保存。
[0038]2、單細胞懸液的制備:將上述含有標本的采樣管置于振蕩器上振蕩10 - 15秒，取出并棄掉拭子。將上述采樣管500g離心8分鐘，棄去上清，注意不要吸走細胞層。再加入lOOul細胞洗滌液，用移液器輕輕吹打細胞層以重懸細胞，得到單細胞懸液。
[0039]3、加入細胞通透劑和熒光素標記的抗體進行染色:
[0040]以Triton-XlOO溶液作為細胞通透劑，和熒光素標記的抗體進行染色。
[0041]本發(fā)明所提供的細胞固定液可將細胞內的蛋白成分進行很好的固定，固定使組織和細胞的蛋白質凝固，終止內源性或外源性酶反應，防止組織自溶或異溶，以保持原有結構和形態(tài)。具有很好的原位保存抗原的作用，避免抗原失活或彌散。以Triton-XlOO溶液作為細胞通透劑，其主要作用是使抗體能進入細胞，與胞內抗原結合。
[0042]將上述單細胞懸液轉入96孔板內，一個標本對應一個孔，再用水平離心機500g離心8分鐘，用移液器小心吸去上清。再加入25ul含有體積分數(shù)為1%的Triton-XlOO和2ug/ml FITC標記的針對Adv抗原的單抗溶液，于室溫避光孵育30分鐘。之后500g離心8分鐘，用移液器小心吸去上清。在其他實施例里，根據(jù)檢測要求，F(xiàn)ITC標記的針對Adv抗原的抗體可以替換為包括FITC標記的分別針對呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型和副流感病毒3型、偏肺病毒、博卡病毒、冠狀病毒、鼻病毒、腸道病毒、支原體、衣原體抗原的抗體的任一種。
[0043]4、洗去抗體:再加入100ul細胞洗滌液，用移液器將細胞輕輕吹打以重懸細胞。再500g離心8分鐘，用移液器小心吸去上清。再加入100ul細胞洗滌液，用移液器將細胞輕輕吹打以重懸細胞。
[0044]5、上流式細胞儀進行分析。用流式細胞儀(艾森生物，NovoCyte 2060R)檢測。
[0045]結果分析方法:根據(jù)前向散射光信號和側向散射光信號，劃出細胞門。再根據(jù)所述細胞門，作出細胞熒光信號的柱形圖。在所述柱形圖上設定陽性門，其百分比為陽性百分比。所述陽性百分比作為診斷依據(jù)，大于臨界值的判為該呼吸道病原體感染陽性，小于或等于臨界值的判為該呼吸道病原體感染陰性。所述陽性門臨界值根據(jù)大量正常人呼吸道標本染色結果劃定。
[0046]結果如圖1所示，圖1是本實施例的方法檢測Adv感染的結果圖，標本為分別采自8位臨床疑似呼吸道病原體感染患者的支氣管肺泡灌洗液標本。如圖1中的A部分所示，根據(jù)前向散射光信號(FSC-Η)和側向散射光信號(SSC-H)，劃出細胞門(P2)。如圖1中的B部分所示，根據(jù)所述細胞門，作出細胞熒光信號(FITC-Η)的柱形圖。在所述柱形圖上設定陽性門(M3)，其百分比(M3%)為陽性百分比。所述陽性百分比作為診斷依據(jù)，本實施例臨界值設為0.20%，大于0.20%的標本判為腺病毒感染陽性，小于或等于0.20%的標本判為腺病毒感染陰性。這樣，所述檢測的8個咽拭子標本中，標本1、2、4流式檢測為Adv陽性(分別如圖1-1、圖1-2、圖1-4所示)，而標本3、5、6、7、8流式檢測為Adv陰性(分別如圖1_3、圖1-5、圖1-6、圖1-7、圖1-8所示)。上述結果與使用七項呼吸道病毒檢測試劑盒(玻片直接免疫熒光法，購自上海貝西生物科技有限公司)對上述標本的檢測結果一致。
[0047]實施例4:人呼吸道病原體感染的流式細胞檢測方法與玻片直接免疫熒光法比較實驗
[0048]本實施例的對比例為本發(fā)明的流式細胞檢測方法與玻片直接免疫熒光法的比較實驗。
[0049]利用玻片直接免疫熒光法進行四項呼吸道病原體(RSV、IA、IB和Adv)感染檢測，按如下步驟進行:
[0050]1、口咽拭子采集:囑病人直立或坐位，囑病人張口發(fā)“啊”音，用醫(yī)用一次性壓舌板壓舌，暴露出病人口咽部，用醫(yī)用一次性尼龍植絨拭子迅速擦拭兩次腭弓、咽及扁桃體上的分泌物，取出拭子。將所述拭子放入含3ml運送培養(yǎng)基的采樣管中，攪拌拭子混勻采樣液，折斷拭子桿，旋緊管蓋。將所述采樣管正立置于4°C保存。
[0051]上述標本可制備為單細胞懸液:將上述含有標本的采樣管置于振蕩器上振蕩10 - 15秒，取出并棄掉拭子。將上述采樣管500g離心8分鐘，棄去上清，注意不要吸走細胞層。再加入0.5 — lml PBS緩沖液，用移液器輕輕吹打細胞層以重懸細胞，得到單細胞懸液。
[0052]2、四項呼吸道病原體感染篩查步驟:
[0053](1)在8孔玻片上點樣，每個點加25ul單細胞懸液。
[0054](2)電吹風冷風下風干10-15分鐘至干燥。
[0055](3)浸沒在冷丙酮溶液固定10分鐘。丙酮的固定原理是使蛋白質沉淀，溶解膜磷脂及脫水。
[0056](4)取出玻片，風干。
[0057](5)在標本片的每個細胞點加上1滴篩查試劑(FITC標記的針對RSV抗原的單抗、FITC標記的針對IA的單抗、FITC標記的針對IB的單抗和FTIC標記的針對Adv的單抗及生物染色劑Evans Blue的混合溶液，購自上海貝西生物科技有限公司)。
[0058](6)在37°C濕盒孵育15-30分鐘。
[0059](7) PBS沖洗一遍，然后浸沒入PBS中洗兩遍(PBS不能重復使用)。
[0060](8)除去多余的洗液，每個細胞點加上一滴含50%甘油的PBS。最后覆上蓋玻片。
[0061](9)在焚光顯微鏡下觀察結果。
[0062](10)結果判斷:200倍顯微鏡下每視野找到彡2個綠色熒光細胞即為陽性，否則為陰性。陰性細胞被Evans Blue染成紅色。
[0063]3、四項呼吸道病原體感染鑒定步驟(對篩查步驟陽性的標本進行此步驟)
[0064](1)在8孔玻片上的孔內滴加25ul的單細胞懸液，每樣本需滴加四孔。
[0065](2)樣本完全風干。
[0066](3)在20°C到25°C，用預冷的100%丙酮固定細胞約5-10分鐘。
[0067](4)從丙酮中取出載玻片并風干。
[0068](5)在固定并風干的細胞上，每孔分別滴加一滴不同的鑒定染色試劑(分別含有FITC標記的針對RSV抗原的單抗、FITC標記的針對IA抗原的單抗、FITC標記的針對IB抗原的單抗或FTIC標記的針對Adv抗原的單抗的生物染色劑Evans Blue溶液，購自上海貝西生物科技有限公司)，試劑要完全覆蓋細胞。
[0069](6)將載玻片放于35°C到37°C的恒溫箱內孵育15到30分鐘，為保持其濕潤最好放置于帶蓋的盒子內。
[0070](7)用PBS漂洗染色細胞。為了更有效地洗滌，請將玻片在洗液中反復浸蘸4次左右。
[0071](8)使用新的PBS再洗一次。
[0072](9)用去離子水再洗一遍。
[0073](10)滴加2到3滴含50%甘油的PBS，并加蓋蓋玻片，要注意避免產生氣泡。在200倍放大熒光顯微鏡下觀察結果。
[0074](11)結果判斷:200倍顯微鏡下每視野找到彡2個綠色熒光細胞即為陽性，