否則為陰性。陰性細(xì)胞被Evans Blue染成紅色。篩查和鑒定步驟結(jié)果均為陽性的才能判為陽性，否則應(yīng)判為陰性。
[0075]陽性結(jié)果如圖2所示，圖2是利用玻片直接免疫熒光法檢測RSV、IA、IB和Adv感染的陽性結(jié)果圖，標(biāo)本為分別采自3位臨床疑似呼吸道病原體感染患者的口咽拭子標(biāo)本。圖2-1A、圖2-1B、圖2-2和圖2_3分別所示標(biāo)本9RSV陽性、標(biāo)本9Adv陽性、標(biāo)本10IA陽性和標(biāo)本11 IB陽性(圖中白色發(fā)亮的細(xì)胞為陽性細(xì)胞)。
[0076]本實施例所用的人呼吸道病原體感染的流式細(xì)胞檢測試劑盒與實施例2的組成大部分相同，不同的是標(biāo)記的抗體不同，本實施例具體的試劑盒中，熒光素標(biāo)記的抗體為:FITC標(biāo)記的針對RSV抗原的單抗、PE(藻紅蛋白)標(biāo)記的針對IA抗原的單抗、PE-Cy7標(biāo)記的針對Adv抗原的單抗及PE-Cy5標(biāo)記的針對IB抗原的單抗的混合溶液，檢測方法如下:
[0077]1、口咽拭子標(biāo)本采集和細(xì)胞固定:囑病人直立或坐位，囑病人張口發(fā)“啊”音，用醫(yī)用一次性壓舌板壓舌，暴露出病人口咽部，用醫(yī)用一次性尼龍植絨拭子迅速擦拭兩次腭弓、咽及扁桃體上的分泌物，取出拭子。將所述拭子放入含3ml細(xì)胞固定液中，攪拌拭子混勻采樣液，折斷拭子桿，旋緊管蓋。將所述采樣管正立置于一 20°C保存。
[0078]2、單細(xì)胞懸液的制備:將上述含有標(biāo)本的采樣管置于振蕩器上振蕩10 - 15秒，取出并棄掉拭子。將上述采樣管500g離心8分鐘，棄去上清，注意不要吸走細(xì)胞層。再加入lOOul細(xì)胞洗滌液，用移液器輕輕吹打細(xì)胞層以重懸細(xì)胞，得到單細(xì)胞懸液。
[0079]3、加入細(xì)胞通透劑和熒光素標(biāo)記的抗體進(jìn)行染色
[0080]以Triton二X100溶液作為細(xì)胞通透劑，和熒光素標(biāo)記的抗體進(jìn)行染色。
[0081]將上述單細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入96孔板內(nèi)，一個標(biāo)本對應(yīng)一個孔，再用水平離心機500g離心8分鐘，用移液器小心吸去上清。再加入25ul抗體(含有體積分?jǐn)?shù)為1 %的Triton-XlOO和濃度分別為2ug/ml的FITC標(biāo)記的針對RSV抗原的單抗、PE標(biāo)記的針對IA抗原的單抗、PE-Cy7標(biāo)記的針對Adv抗原的單抗及PE_Cy5標(biāo)記的針對IB抗原的單抗的混合溶液)，于室溫避光孵育30分鐘。之后500g離心8分鐘，用移液器小心吸去上清。
[0082]4、洗去抗體:再加入lOOul細(xì)胞洗滌液，用移液器將細(xì)胞輕輕吹打以重懸細(xì)胞。再500g離心8分鐘，用移液器小心吸去上清。再加入lOOul細(xì)胞洗滌液，用移液器將細(xì)胞輕輕吹打以重懸細(xì)胞。
[0083]5、上流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。用流式細(xì)胞儀(艾森生物，NovoCyte 2060R)檢測。
[0084]結(jié)果分析方法:根據(jù)前向散射光信號和側(cè)向散射光信號，劃出細(xì)胞門。再根據(jù)所述細(xì)胞門，作出細(xì)胞熒光信號的柱形圖。在所述柱形圖上設(shè)定陽性門，其百分比為陽性百分比。所述陽性百分比作為診斷依據(jù)，大于臨界值的判為該呼吸道病原體感染陽性，小于或等于臨界值的判為該呼吸道病原體感染陰性。陽性門和臨界值根據(jù)大量正常人呼吸道標(biāo)本染色結(jié)果劃定。
[0085]結(jié)果如圖3所示，圖3是本發(fā)明方法檢測本實施例收集的標(biāo)本中呼吸道合胞病毒、流感病毒A型、流感病毒B型和腺病毒感染情況的結(jié)果圖。如圖3-1、圖3-2、圖3-3所示，根據(jù)前向散射光信號(FSC-Η)和側(cè)向散射光信號(SSC-H)，劃出細(xì)胞門(P2)。根據(jù)所述細(xì)胞門，作出細(xì)胞熒光信號(RSV-H、IA-H、Adv-H、IB-Η)的柱形圖。在所述柱形圖上設(shè)定陽性門(M3、M4、M5、M6)，其百分比(M3%、M4%、M5%、M6% )為陽性百分比。所述陽性百分比作為診斷依據(jù)，本例各臨界值均設(shè)為0.20%，大于0.20%的標(biāo)本判為相應(yīng)病毒感染陽性，小于或等于0.20%的標(biāo)本判為相應(yīng)病毒感染陰性。這樣，所述檢測的咽拭子標(biāo)本9 一 11中，標(biāo)本9流式檢測為呼吸道合胞病毒和腺病毒感染雙陽性(圖3-1)，而標(biāo)本10和標(biāo)本11流式檢測分別為流感病毒A型陽性(圖3-2)和流感病毒B型陽性(圖3-3)。
[0086]從以上的舉例可以看出，本發(fā)明所述的人呼吸道病原體的流式細(xì)胞檢測試劑盒能很好地實現(xiàn)相應(yīng)的人呼吸道病原體檢測，更為重要的，要反映病原體感染情況，相比于玻片直接免疫熒光法以鏡下觀察到絕對量的熒光染色的細(xì)胞來反映，本發(fā)明所述檢測方法以相對的陽性百分比來反映更為準(zhǔn)確。
[0087]以上所述實施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。
[0088]以上所述實施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【主權(quán)項】
1.一種細(xì)胞固定液，其特征在于，其為含有體積分?jǐn)?shù)為0.1 % — 1 %甲醛和體積分?jǐn)?shù)為60% — 80% 甲醇的 PBS 溶液，pH 為 7.2-7.4。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞固定液，其特征在于，所述甲醛的體積分?jǐn)?shù)為0.3% -0.8%,所述甲醇的體積分?jǐn)?shù)為60% — 65%。3.一種人呼吸道病原體的流式細(xì)胞檢測試劑盒，其特征在于，包括有:權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞固定液、細(xì)胞通透劑和至少一種待檢測人呼吸道病原體的單克隆抗體，每種待檢測人呼吸道病原體的單克隆抗體標(biāo)記有熒光素，且針對不同待檢測人呼吸道病原體的熒光素不同。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的人呼吸道病原體的流式細(xì)胞檢測試劑盒，其特征在于，所述人呼吸道病原體為呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型和副流感病毒3型、偏肺病毒、博卡病毒、冠狀病毒、鼻病毒、腸道病毒、支原體或衣原體中的至少一種。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的人呼吸道病原體的流式細(xì)胞檢測試劑盒，其特征在于，所述細(xì)胞通透劑為Triton-XlOO溶液。6.根據(jù)權(quán)利要求3-5任一項所述的人呼吸道病原體的流式細(xì)胞檢測試劑盒，其特征在于，所述細(xì)胞洗滌液為PBST緩沖液。7.—種人呼吸道病原體的流式細(xì)胞檢測方法，其特征在于，使用權(quán)利要求3-7任一項所述的人呼吸道病原體的流式細(xì)胞檢測試劑盒，包括如下步驟: (1)標(biāo)本采集和細(xì)胞固定:收集呼吸道的標(biāo)本中的上皮細(xì)胞到細(xì)胞固定液內(nèi)； (2)單細(xì)胞懸液的制備:洗去所述細(xì)胞固定液； (3)加入細(xì)胞通透劑和熒光素標(biāo)記的待檢測的人呼吸道病原體的單克隆抗體進(jìn)行染色，針對不同人呼吸道病原體的單克隆抗體所標(biāo)記的熒光素不同； (4)洗去多余的單克隆抗體； (5)上流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的人呼吸道病原體的流式細(xì)胞檢測方法，其特征在于，所述標(biāo)本為咽拭子或肺泡支氣管灌洗液。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種人呼吸道病原體感染的流式細(xì)胞檢測的細(xì)胞固定液、試劑盒和方法，所述細(xì)胞固定液，其為含有體積分?jǐn)?shù)為0.1％－1％甲醛和體積分?jǐn)?shù)為60％－80％甲醇的PBS溶液，pH為7.2-7.4。所述試劑盒包括有上述細(xì)胞固定液、細(xì)胞通透劑和至少一種待檢測人呼吸道病原體的單克隆抗體，每種待檢測人呼吸道病原體的單克隆抗體標(biāo)記有熒光素，且針對不同待檢測人呼吸道病原體的熒光素不同。本發(fā)明所述方法檢測過程自動化，節(jié)省人力成本、結(jié)果客觀準(zhǔn)確，并可實現(xiàn)單樣本多重檢測，能更好的反映病原體感染情況。
【IPC分類】G01N33/533, G01N33/569
【公開號】CN105388288
【申請?zhí)枴緾N201510697330
【發(fā)明人】李小鋒, 李晨陽, 劉銘龍
【申請人】廣東和信健康科技有限公司
【公開日】2016年3月9日
【申請日】2015年10月21日