一種免疫組化檢測水稻條紋病毒在植株中分布的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] -種免疫組化檢測水稻條紋病毒在植株的方法，運用帶毒灰飛虱接種植株（水 稻、擬南芥等），感病植物不同組織（根、莖、葉等）經(jīng)過脫水、透明、石蠟包埋以及超薄切片 等過程獲得組織石蠟切片，然后利用高度特異性水稻條紋病毒多克隆抗體，通過兩步免疫 組化檢測水稻條紋病毒在植物不同組織內(nèi)的分布情況。
【背景技術(shù)】：
[0002] 由水稻條紋病毒（rice strip virus，RSV)引起的水稻條紋葉枯病是水稻重要病 害之一，主要發(fā)生在東亞的溫帶、亞熱帶地區(qū)，近年來在我國廣大稻區(qū)大面積爆發(fā)，給水稻 生產(chǎn)帶來嚴(yán)重威脅。RSV侵染水稻后最典型的外部癥狀是褪綠的條紋斑點或斑塊，一般最早 出現(xiàn)在較幼嫩的新葉上，水稻常表現(xiàn)兩種癥狀：卷葉型和展葉型。卷葉型表現(xiàn)為心葉褪綠、 捻轉(zhuǎn)，并弧圈狀下垂，嚴(yán)重的心葉枯死；展葉型表現(xiàn)為葉片出現(xiàn)黃綠色條帶，病葉不捻轉(zhuǎn)卷 曲，最后低垂和枯萎。生長早期感染的水稻植株，癥狀嚴(yán)重，甚至死亡，而后期感染的植株， 癥狀輕微。迄今為止，幾乎沒有能有效防治病毒病的化學(xué)藥劑，治蟲防病的應(yīng)急措施無法作 為一項長期策略，而研究寄主在病毒侵染后基因的功能進(jìn)而病害防控中加以利用則是一種 更為環(huán)保的手段。盡管已經(jīng)鑒定了多個RSV編碼蛋白功能，但RSV致病相關(guān)基因的功能鑒 定還有待進(jìn)一步研究。要準(zhǔn)確和可靠的鑒定病毒蛋白功能首先需要明確病毒在植物組織中 的分布?，F(xiàn)有的研究多以RT-PCR或蛋白雜交等方法檢測病毒在整株植株中的積累，而不能 在植株不同組織中檢測病毒的分布，有必要盡快確立一種合適的方法以解決這一問題。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0003] 本發(fā)明針對上述研究背景，以接種水稻條紋病毒的植株為材料，發(fā)明了一種免疫 組化檢測水稻條紋病毒在植株中的分布情況。
[0004] 本發(fā)明所提供的免疫組化檢測水稻條紋病毒在植株中的分布情況，其主要步驟如 下：
[0005] 1)利用對水稻條紋病毒高親和性灰飛虱從水稻條紋病株中獲毒；
[0006] 2)帶毒灰飛虱接種植株（水稻、擬南芥等）；
[0007] 3)RT_PCR檢測感染水稻條紋病毒的植株；
[0008] 4)感染水稻條紋病毒植株不同組織（根、莖、葉等）的石蠟切片；
[0009] 5)利用水稻條紋病毒多克隆抗體，通過免疫組化的方法檢測水稻條紋病毒在植株 不同組織中的分布。
[0010] 本發(fā)明能為研究水稻條紋病毒侵染植株，在感病植株不同組織中的積累分布作出 準(zhǔn)確和可靠的結(jié)果，其結(jié)果可以用于研究病毒與植物的分子互作。
【附圖說明】：
[0011] 圖1 DIBA檢測灰飛虱攜帶水稻條紋病毒；
[0012] 圖2水稻條紋病毒侵染擬南芥表型；
[0013] 圖3 RT-PCR檢測水稻條紋病毒在擬南芥中的積累；
[0014] 圖4免疫組化檢測水稻條紋病毒在擬南芥莖中的分布。
【具體實施方式】：
[0015] 下面實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
[0016] 實施例，免疫組化檢測水稻條紋病毒在擬南芥莖中的分布
[0017]1、植物材料、病毒分析以及侵染方法
[0018] 水稻種子（日本晴）首先用0. 1%HgC12消毒1小時；然后用去離子水沖洗干凈， 25°C浸種一天，催芽一天；催芽后的種子用木村B培養(yǎng)液中培養(yǎng)，光照14小時，黑暗10小 時，溫度28±1°C。
[0019] 于江蘇鹽城、徐州、建湖等水稻條紋葉枯病重病區(qū)采集表現(xiàn)水稻條紋葉枯病癥狀 (江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2012,（28) :1007-1015)的水稻病株，利用水稻條紋葉枯病毒外殼蛋白基 因?qū)?yīng)的引物（CP-F :ATGGGTACCAACAAGCC，CP-R :CTAGTCATCTGCACCTT)RT-PCR 方法檢測檢 測病株是否攜帶水稻條紋病毒。將1-2齡無毒灰飛虱若蟲在毒源上飼毒2-3d，而后移入 育有武育粳3號秧苗的燒杯中飼養(yǎng)使其度過循回期，12-13d后從每杯中隨機取出50頭經(jīng) DIBA方法（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2012,杜琳琳）測定其帶毒率，用于測算有效接種蟲量 [有效接種蟲量（蟲）=接種蟲量（蟲）X帶毒率（％ )]。
[0020] 30天大小的擬南芥幼苗每棵接種10頭有病毒的灰飛虱；接毒3天后，移除灰 飛虱，將幼苗移栽到溫室中；取接病毒后的擬南芥葉片保存在-80°C冰箱中做后續(xù)研究 (RT-PCR方法確認(rèn)侵染是否成功）。
[0021] 2、RNA 提取
[0022] 總RNA按照說明書用Trizol提取，并用NanoDrop 2000分光光度計檢測濃度和質(zhì) 量。只有260/280的比值在1. 9和2. 1之間且260/230的比值大于2. 0的RNA可以用作后 續(xù)的實驗。RNA的完整性用瓊脂糖凝膠電泳檢測，所有的樣品都標(biāo)準(zhǔn)化到同一濃度，用于后 續(xù)的實驗。
[0023]3、反轉(zhuǎn)錄和RT-PCR檢測
[0024] 取 2 μ g 經(jīng) DNase I 處理的總 RNA，用 M-MLV (Promega，Madison，WI，USA)合成 cDNA 第一鏈，具體操作步驟詳見其操作手冊，以cDNA作為RT-PCR模板。不同基因的表達(dá)水平 采用RT-PCR方法檢測，同時以在真核生物中高度保守并組成性表達(dá)的EF1 α基因為內(nèi)參。 具體操作步驟簡述如下：分別取2 μ gRNA作模板，分別加入Random Primers 0. 5 μ g，定容 至15yL，70°C變性5min，立即在冰上放置5min。然后分別加入M-MLV 5Xbuffer 5yL， dNTP(25mM)5yL，RNAasin Rivonuclease Inhibitor 25U，M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 200U，DEPC 水補 足25 μ L。42°C溫育lh，95°C 5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶活性。
[0025] 經(jīng)過優(yōu)化后，取適量的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于隨后的PCR。PCR引物序列見表1。PCR程 序如下：95°C，5min ;95°C 50s ;58°C 50s ;72°C 50s ;25-30 循環(huán)；72°C 10min。RT-PCR 產(chǎn)物經(jīng) 純化回收后，連接到pGEM-T easy vector上，送大連寶生物工程公司測序，BLAST分析。用 凝膠成像系統(tǒng)測定RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳溴化乙錠（EB)染色信號，估計基因表達(dá)相對水平。
[0026] 表1本研究所選用的水稻條紋病毒基因以及其引物序列
[0027]
[0028] 4、感染水稻條紋病毒擬南芥莖的石蠟組織切片
[0029] 感染水稻條紋病毒擬南芥莖在FAA固定液中4°C過夜，用30%~100%梯度乙醇脫 色后（每個梯度1-2小時），石蠟包埋，切片，切片厚度為1 μ m。1 %甲苯胺藍(lán)染色后在光學(xué) 顯微鏡下觀察并拍照。
[0030] 5、免疫組化檢測水稻條紋病毒在擬南芥莖中的分布
[0031] 感染水稻條紋病毒擬南芥莖石蠟組織切片在二甲苯中脫蠟，5minX3,100%~ 30%梯度乙醇復(fù)水（每個梯度5111；[11\2)，3%!1 20210111；[11，水2111；[11\2，1\抗原修復(fù)液（碧 云天）95-100°C 20min，PBS 5minX2,封閉液處理10min，1000X水稻條紋病毒多克隆一抗 (兔 IgG)l_2h (室溫）或 4°C過夜，PBS 2minX3,二抗 37°C30min，PBS 2minX3，DAB 顯色 5-30min，最后用超純水洗滌終止反應(yīng)，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。
[0032] 上述實施不以任何形式限定本發(fā)明。
【主權(quán)項】
1. 一種免疫組化檢測水稻條紋病毒在植株中分布的方法，其特征在于：運用帶毒灰飛 虱接種植株（水稻、擬南芥等），選取感病植株不同組織（根、莖、葉等）經(jīng)脫水、透明、石蠟 包埋以及超薄切片等過程獲得植株組織的石蠟切片，然后利用高度特異性水稻條紋病毒多 克隆抗體，通過兩步免疫組化檢測水稻條紋病毒在植株不同組織中分布情況。2. 按照權(quán)利1所獲得一種免疫組化檢測水稻條紋病毒在植株中分布的方法，其特征在 于：以水稻條紋病毒侵染的植株為對象，應(yīng)用免疫組化方法檢測病毒在植物不同組織（根、 莖、葉）水平上的積累情況，該方法可用于研究水稻條紋病毒與植物互作中病毒在植物組 織細(xì)胞中的積累模式。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種免疫組化檢測水稻條紋病毒在植株中分布的方法。本發(fā)明運用高親和灰飛虱從水稻條紋葉枯病株中獲毒，然后通過帶毒灰飛虱接種植株(水稻，擬南芥等)，RT-PCR檢測水稻條紋病毒在植株中的積累，選取感病植株不同組織(根、莖、葉等)作石蠟切片，最后用水稻條紋病毒多克隆抗體免疫組化檢測病毒在植株不同組織中的分布。與傳統(tǒng)檢測方法(RT-PCR、ELISA)相比，免疫組化方法能夠檢測病毒在植物組織水平上的積累。本發(fā)明可用于研究水稻條紋病毒與植物的分子互作模式。
【IPC分類】G01N33/569
【公開號】CN105388289
【申請?zhí)枴緾N201510793940
【發(fā)明人】孫楓, 方鵬, 杜琳琳, 蘭瑩, 劉之洋, 周彤, 周益軍
【申請人】江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【公開日】2016年3月9日
【申請日】2015年11月16日