焦亞硫酸鈉細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及整屬溶成劑的生物物質(zhì)，具體是一種焦亞硫酸鋼細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 焦亞硫酸鋼是一種常用的抗氧劑，廣泛用于藥品、食品等行業(yè)的生產(chǎn)中。焦亞硫酸 鋼極易被氧化，具有強(qiáng)還原性的物質(zhì)，其氧化電勢比藥物低，當(dāng)其與易氧化的藥物(如含酪 性成分、祗締、羨締、芳香胺、化挫酬等的物質(zhì)）同時(shí)存在時(shí)，可首先與其作用而使主藥保持 穩(wěn)定狀態(tài)。
[0003]輸液產(chǎn)品是醫(yī)院日常的必備基礎(chǔ)藥品。目前國內(nèi)輸液市場正處于價(jià)格戰(zhàn)，產(chǎn)品的 升級(jí)換代是關(guān)鍵，產(chǎn)品升級(jí)換代必然要對其使用的原料進(jìn)行嚴(yán)格的控制，W保證產(chǎn)品質(zhì)量。 而熱原或細(xì)菌內(nèi)毒素是注射劑質(zhì)量關(guān)鍵控制項(xiàng)目之一。
[0004]按照《中國藥典》2015年版的規(guī)定，熱原檢查可采用家兔升溫法。該方法系將一定 劑量的供試品，靜脈注入家兔體內(nèi)，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)，按時(shí)觀察記錄家兔體溫升高的情況，W 判定供試品中所含熱原的限度是否符合規(guī)定。家兔法檢測內(nèi)毒素的靈敏度為O.OOlpg/ml， 試驗(yàn)結(jié)果接近人體真實(shí)情況，是公認(rèn)的比較可靠的熱原檢查方法。但其操作繁瑣費(fèi)，影響因 素眾多，檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性和一致性取決于試驗(yàn)動(dòng)物的狀況、試驗(yàn)室條件和操作的規(guī)范性。 [000引隨著制藥工業(yè)的發(fā)展和科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，人們發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上的一種 脂多糖（Lipoplysaccharide)和微量蛋白（Protein)的復(fù)合物--細(xì)菌內(nèi)毒素，它的特殊 性不是細(xì)菌或細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，而是細(xì)菌死亡或解體后才釋放出來的一種具有內(nèi)毒素生物 活性的物質(zhì)，當(dāng)機(jī)體內(nèi)毒素濃度闊值〉0. 005ng/ml時(shí)，即可刺激體溫調(diào)節(jié)中樞導(dǎo)致機(jī)體發(fā) 熱。
[0006]細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法系利用整試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素， W判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。整試劑是從棲生于海洋的節(jié) 肢動(dòng)物"整"的蘭色血液中提取變形細(xì)胞溶解物，經(jīng)低溫冷凍干燥而成的生物試劑，專用于 細(xì)菌內(nèi)毒素檢測。目前國際上銷售的整試劑有兩種，一種稱美洲整試劑(LAL)，由美國生產(chǎn)； 另一種稱東方整試劑(TAL)dTAL與LAL有相同的功效。細(xì)菌內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位化U)表 示。整試劑法檢查內(nèi)毒素的靈敏度為O.OOOlpg/ml，比家兔法靈敏10倍，操作簡單易行，試 驗(yàn)費(fèi)用低，結(jié)果迅速可靠，特別適用于注射用原輔料、注射劑生產(chǎn)過程中的熱原控制和家兔 法不能檢測的某些細(xì)胞毒性藥物制劑，也是受到各國藥典承認(rèn)的一種通用方法。
[0007] 目前已經(jīng)有學(xué)者用整試劑法檢測焦亞硫酸鋼原料的細(xì)菌內(nèi)毒素，其結(jié)果是驗(yàn)證了 整試劑法的可行性，但他們采用的是最常見的凝膠法來檢測的。凝膠法也是藥典規(guī)定的方 法，實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求低，但是該方法是一個(gè)限度測定法，運(yùn)種方法只能分析產(chǎn)品中內(nèi)毒素的含 量有沒有超過標(biāo)準(zhǔn)，而不能夠得出確切的定量結(jié)果。
[0008]因此，需要一種新的檢測焦亞硫酸鋼細(xì)菌內(nèi)毒素的方法，可避免W上動(dòng)物熱原檢 查法、凝膠法的不足，檢測細(xì)菌內(nèi)毒素既省時(shí)又省經(jīng)濟(jì)，能夠滿足注射劑及其原輔料檢測的 需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明就是為了解決傳統(tǒng)的凝膠法只能分析產(chǎn)品中內(nèi)毒素的含量是否超標(biāo)，而 不能夠得出確切的定量結(jié)果的問題，所提出的一種焦亞硫酸鋼細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測方法。
[0010] 本發(fā)明是按照W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
[0011] -種焦亞硫酸鋼細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測方法，包括W下步驟： a. 反應(yīng)溶液制備 (I)稱取焦亞硫酸鋼，加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，得供試品焦亞硫酸鋼濃度為lOOmg/ml； (Π)用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將供試品焦亞硫酸鋼稀釋到0.lmg/na-0.6mg/ml; b. 試劑復(fù)溶 取動(dòng)態(tài)顯色法整試劑，開啟后依動(dòng)態(tài)顯色法整試劑使用說明加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水 復(fù)溶； C.加樣及反應(yīng) 將0.Img/nd-0.6mg/ml的供試品焦亞硫酸鋼與步驟b中復(fù)溶的整試劑等體積混合，放入 反應(yīng)試管中并插到動(dòng)態(tài)試管檢測儀中，計(jì)算內(nèi)毒素的含量。
[001引步驟a(Π)中供試品焦亞硫酸鋼的稀釋濃度為0.4mg/ml。
[001引步驟C中內(nèi)毒素的檢測溫度為37.0 ± 0.5°C，最長檢測時(shí)間為60 ± 2min，檢測波長 為％0醒-660醒。
[0014] 所述檢測波長為405nm。
[0015] 本發(fā)明獲得了如下的有益效果。
[0016] 本發(fā)明公開了一種焦亞硫酸鋼原料中細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測方法，確定使用焦亞硫酸 鋼的無干擾稀釋濃度;然后將待測的焦亞硫酸鋼原料稀釋成〇.4mg/ml待測溶液，進(jìn)行細(xì)菌 內(nèi)毒素檢測。本發(fā)明的焦亞硫酸鋼原料中細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測方法，可避免動(dòng)物熱原檢查法 的不足，解決了新開發(fā)注射液產(chǎn)品中焦亞硫酸鋼原料的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查問題;從源頭上對 無菌產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行定量控制，對保證輸液產(chǎn)品的安全性有重要意義。該方法有生物化學(xué)的 理論基礎(chǔ)，更科學(xué);利用酶的分子生化反應(yīng)，專屬性高，重現(xiàn)性強(qiáng)，準(zhǔn)確度和靈敏度高;操作 簡單快速，無需特殊儀器設(shè)備，實(shí)用性強(qiáng)。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。
[001 8] 1.實(shí)驗(yàn)材料 1.1供試品
1.2試劑及儀器
2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線選擇及最低有效濃度的確定 2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的選擇 按注射劑每支最大裝量為20mL，使用焦亞硫酸鋼最大濃度為0.2%,臨床安全系數(shù)為10 倍計(jì)算，臨床一次使用抗氧劑的量為400mg。內(nèi)毒素限值L=K/M=5EU/kg^( 400mg^ 60kg) =0.75抓/mg。
[0019] 本試驗(yàn)選取0.8mg/ml、0.4mg/ml、0.2mg/ml進(jìn)行干擾初篩試驗(yàn)，故依據(jù)內(nèi)毒素限 值，系列反應(yīng)溶液中可能含有的最大內(nèi)毒素量為0.75抓/mgX0.8mg/ml=0.6抓/ml，而整試 劑檢測最高靈敏度為0.005抓/ml，故本次試驗(yàn)選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線為4點(diǎn)曲線，各點(diǎn)濃度為祀U(xiǎn)/ ml,0.5 抓/ml,0.05 抓/ml,0.005抓/ml。
[0020] 2.2最低有效濃度的確定 最低有效濃度MVC=A/L=0.005抓/ml今 0.75抓/mg=6.67Xl〇-3mg/ml 3. 干擾初篩試驗(yàn) 稱取1g焦亞硫酸鋼加10mlBET水溶解，得供試品焦亞硫酸鋼的濃度為lOOmg/ml。本試 驗(yàn)選取 0.8mg/ml、0.4mg/ml、0.2mg/ml進(jìn)行試驗(yàn)。
[0021 ] 3.1反應(yīng)溶液制備 稱取1.Og焦亞硫酸鋼加10ml肥T水溶解，得供試品焦亞硫酸鋼的濃度為lOOmg/ml。
[0022]供試品（溶液A)稀釋過程：
陰性對照(溶液D):細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水。
[0023] 3.2試劑復(fù)溶 取動(dòng)態(tài)顯色法整試劑2支，開啟后加入1.25ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶，待溶液澄清 后，用無熱原吸頭轉(zhuǎn)移合并至1支。
[0024] 3.3加樣及反應(yīng) 將0.1ml上述制備的溶液A、B、C、D分別與0.1ml整試劑加入8X75mm反應(yīng)試管中，輕輕 混勻，插入動(dòng)態(tài)試管檢測儀中反應(yīng)，使用軟件計(jì)算回收率、內(nèi)毒素含量等數(shù)值。
[002引 3.4試驗(yàn)結(jié)果
藥典要求 (I)陰性對照的反應(yīng)時(shí)間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時(shí)間； (Π)標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)Η>0.980; (虹）回收率R滿足：50% <R< 2000/0; 初步確定往樣品中加入BET水溶解后稀釋到0.4mg/ml使用動(dòng)態(tài)顯色法試劑可排除焦亞 硫酸鋼對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的干擾。
[0026] 4.干擾試驗(yàn)及細(xì)菌內(nèi)毒素定量測定 根據(jù)干擾初篩試驗(yàn)結(jié)果，初步確定往樣品中加入BET水溶解后稀釋到0.4mg/ml使用動(dòng) 態(tài)顯色法試劑可排除焦亞硫酸鋼對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的干擾。本試驗(yàn)取Ξ批焦亞硫酸鋼進(jìn)行 干擾試驗(yàn)。
[0027] 4.1反應(yīng)溶液制備 稱取Ξ批20111201-1、20111201-2、101220140402稱取l.Og焦亞硫酸鋼加 10mlBET水 溶解，得供試品焦亞硫酸鋼濃度為lOOmg/ml。
[002引 Ξ批 20111201-1、20111201-2、101220140402供試品（溶液A)按W下稀釋過程稀 釋：
Ξ批20111201-1、20111201-2、101220140402供試品陽性對照(溶液B)按W下稀釋過程 稀釋：
陰性對照(溶液D):細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水。
[0029] 4.2試劑復(fù)溶 取動(dòng)態(tài)顯色法整試劑2支，開啟后加入1.25ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶，待溶液澄清 后，用無熱原吸頭轉(zhuǎn)移合并至1支。
[0030] 4.3加樣及反應(yīng) 將0.1ml上述制備的溶液A、B、C、D分別與0.1ml整試劑加入8X75mm反應(yīng)試管中，輕輕 混勻，插入動(dòng)態(tài)試管檢測儀中反應(yīng)。
[0031 ] 4.4試驗(yàn)結(jié)果
藥典要求 (I)陰性對照的反應(yīng)時(shí)間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時(shí)間； (Π)標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)|r| >0.980; (虹）回收率R滿足：50〇/〇 <R< 200〇/〇。
[0032]將焦亞硫酸鋼溶解后稀釋到0.4mg/ml使用動(dòng)態(tài)顯色法試劑可排除焦亞硫酸鋼對 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的干擾。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種焦亞硫酸鈉細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測方法，其特征在于:包括以下步驟： a. 反應(yīng)溶液制備 (I)稱取焦亞硫酸鈉，加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，得供試品焦亞硫酸鈉濃度為l〇〇mg/ml； (Π)用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將供試品焦亞硫酸鈉稀釋到0.lmg/ml-〇.6mg/ml; b. 試劑復(fù)溶 取動(dòng)態(tài)顯色法鱟試劑，開啟后依動(dòng)態(tài)顯色法鱟試劑使用說明加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水 復(fù)溶； c. 加樣及反應(yīng) 將0.lmg/ml-0.6mg/ml的供試品焦亞硫酸鈉與步驟b中復(fù)溶的鱟試劑等體積混合，放入 反應(yīng)試管中并插到動(dòng)態(tài)試管檢測儀中，計(jì)算內(nèi)毒素的含量。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種焦亞硫酸鈉細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測方法，其特征在于：步驟a (Π沖供試品焦亞硫酸鈉的稀釋濃度為0.4mg/ml。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種焦亞硫酸鈉細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測方法，其特征在于：步驟c 中內(nèi)毒素的檢測溫度為37 · 0 ± 0 · 5°C，最長檢測時(shí)間為60 ± 2min，檢測波長為340nm-660nm〇4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種焦亞硫酸鈉細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測方法，其特征在于:所述檢 測波長為405nm〇
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種焦亞硫酸鈉細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測方法，涉及鱟屬溶成劑的生物物質(zhì)領(lǐng)域。本發(fā)明檢測方法包括以下步驟：a.反應(yīng)溶液制備（Ⅰ）稱取焦亞硫酸鈉，加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，得供試品焦亞硫酸鈉濃度為100mg/ml；（Ⅱ）用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將供試品焦亞硫酸鈉稀釋到0.1mg/ml-0.6mg/ml；b.取動(dòng)態(tài)顯色法鱟試劑，開啟后加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶；c.將0.1mg/ml-0.6mg/ml的供試品焦亞硫酸鈉與步驟b中復(fù)溶的鱟試劑等體積混合，放入反應(yīng)試管中并插到動(dòng)態(tài)試管檢測儀中，計(jì)算內(nèi)毒素的含量。本發(fā)明避免了動(dòng)物熱原檢查法的不足，重現(xiàn)性強(qiáng)，靈敏度高，操作簡便。
【IPC分類】G01N33/579
【公開號(hào)】CN105445467
【申請?zhí)枴緾N201510839837
【發(fā)明人】于玥
【申請人】中國大冢制藥有限公司
【公開日】2016年3月30日
【申請日】2015年11月27日