核酸適配體功能化磁納米顆粒分離富集-激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)金黃色葡萄球菌的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于食品安全和醫(yī)療診斷領(lǐng)域，具體涉及一種核酸適配體修飾磁納米粒子 分離富集金黃色葡萄球菌并利用激光誘導(dǎo)熒光在線檢測(cè)的方法。
【背景技術(shù)】：
[0002] 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一種革蘭氏陽(yáng)性致病菌，分布廣泛， 存在于空氣、水、灰塵及人和動(dòng)物的排泄物中。美國(guó)疾病控制中心報(bào)告，由金黃色葡萄球菌 引起的感染占第二位，僅次于大腸桿菌。國(guó)內(nèi)外多起由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事 件使得人們更加關(guān)注致病菌的檢測(cè)。2011年，我國(guó)衛(wèi)生部實(shí)施《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)速凍面米 制品》(GB19295 - 2011)，允許金葡菌限量存在。因此，建立快速有效的金黃色葡萄球菌檢測(cè) 技術(shù)對(duì)食品安全具有重要意義。
[0003] 目前金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法主要包括傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法和近年發(fā)展起來(lái)的快 速檢測(cè)方法。傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法主要是根據(jù)國(guó)標(biāo)法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)和生化鑒別。但是此 方法耗時(shí)且靈敏度低，很難滿足現(xiàn)今評(píng)價(jià)食品中微生物安全性的要求。近年來(lái)，人們采用免 疫學(xué)、生物傳感和分子生物學(xué)等先進(jìn)技術(shù)對(duì)食品中致病微生物進(jìn)行快速檢測(cè)方法的研究， 包括紙片法、PCR技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附法等。
[0004] 核酸適配體是通過(guò)指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)篩選，針對(duì)目標(biāo)物具有 高親和力和特異性的核苷酸序列片段。與抗體相比，適配體具有靶標(biāo)更廣泛、易于合成和化 學(xué)修飾、穩(wěn)定性好和可擴(kuò)增等優(yōu)點(diǎn)。磁納米材料在磁場(chǎng)作用下能實(shí)現(xiàn)分離以及對(duì)樣品的富 集，可有效提高分析檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。近年來(lái)，許多研究將磁納米材料結(jié)合核酸適配 體應(yīng)用于致病菌的檢測(cè)。但是其中一些存在檢測(cè)靈敏度低、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)及操作復(fù)雜等問(wèn)題。
[0005] 激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)是指檢測(cè)激光照射樣品后的熒光發(fā)射的方法，具有時(shí)間響應(yīng) 快、靈敏度高、干擾小等優(yōu)點(diǎn)。因此，有必要建立一種核酸適配體功能化磁納米顆粒分離富 集金黃色葡萄球菌并利用激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)在線靈敏檢測(cè)的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0006] 本發(fā)明目的在于提供一種核酸適配體功能化磁納米顆粒分離富集金黃色葡萄球 菌，并利用激光誘導(dǎo)熒光在線的方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:將金黃色葡萄球菌適配體 修飾在磁納米顆粒表面，該材料可以快速識(shí)別并捕獲待測(cè)樣品中的金黃色葡萄球菌;再將 捕捉到的金黃色葡萄球菌與FAM標(biāo)記的適配體進(jìn)行結(jié)合，實(shí)現(xiàn)夾心結(jié)構(gòu)的熒光標(biāo)記;將磁納 米-金黃色葡萄球菌-FAM夾心結(jié)構(gòu)復(fù)合體注射入毛細(xì)管中，利用磁場(chǎng)進(jìn)行富集;撤掉磁場(chǎng)， 以恒定流速推動(dòng)復(fù)合體通過(guò)激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)池得到一定熒光峰面積;在一定范圍內(nèi)金黃 色葡萄球菌的濃度與熒光峰面積的趨勢(shì)呈線性相關(guān)，以達(dá)到對(duì)金黃色葡萄球菌定量檢測(cè)的 目的。
[0007] 具體步驟為：
[0008] (1)制備核酸適配體功能化的磁納米顆粒
[0009] 取500yL氨基化三氧化二鐵于離心管中，加入1.5mL戊二醛1?溶液避光反應(yīng)2h，再 PB緩沖液清洗3次。然后加入適量親和素室溫震蕩孵育6h，用超純水清洗3次，得到親和素功 能化磁納米顆粒。再取240yL上述親和素功能化磁納米超聲分散20min，加入10yL生物素化 核酸適配體，室溫震蕩孵育30min，用TE緩沖液清洗3次后得到核酸適配體功能化的磁納米 顆粒。
[0010] (2)激光誘導(dǎo)熒光在線檢測(cè)金黃色葡萄球菌
[0011]取30yL核酸適配體功能化的磁納米顆粒加入等體積FAM標(biāo)記的核酸適配體和金黃 色葡萄球菌菌懸液，室溫振蕩孵育30min，利用栗將混合物注射入毛細(xì)管中，加恒定磁場(chǎng)進(jìn) 行分離富集，然后撤掉磁場(chǎng)，繼續(xù)以恒定流速將復(fù)合體推入激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)池中進(jìn)行熒 光檢測(cè)，得到一定熒光峰面積值。
[0012] 取30yL核酸適配體功能化的磁納米顆粒加入等體積FAM標(biāo)記的核酸適配體和金黃 色葡萄球菌菌懸液，再加入480yL TE緩沖液，使反應(yīng)體系體積增大，即金黃色葡萄球菌稀釋 5倍，如上述方法進(jìn)行檢測(cè)，得到一定熒光峰面積值與金黃色葡萄球菌濃度呈線性相關(guān)，可 對(duì)其進(jìn)行定量檢測(cè)。
[0013] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其顯著優(yōu)點(diǎn)是：
[0014] (1)核酸適配體修飾磁納米顆粒特異性識(shí)別金黃色葡萄球菌并對(duì)其進(jìn)行分離富 集，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和方法的特異性。
[0015] (2)結(jié)合激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)技術(shù)實(shí)現(xiàn)在線檢測(cè)，背景信號(hào)低，提高了檢測(cè)方法的 靈敏度并縮短了檢測(cè)時(shí)間。
[0016] (3)對(duì)金黃色葡萄球菌的檢測(cè)限較低，達(dá)到3CFU/mL。
【附圖說(shuō)明】：
[0017] 附圖1為:金黃色葡萄球菌在線檢測(cè)示意圖。
[0018] 附圖2為:核酸適配體功能化磁納米顆粒捕獲金黃色葡萄球菌TEM表征圖：（a)磁納 米顆粒(b)磁納米顆粒結(jié)合金黃色葡萄球菌。
[0019]附圖3為:金黃色葡萄球菌檢測(cè)過(guò)程色譜圖。
[0020] 附圖4為:不同濃度金黃色葡萄球菌與熒光峰面積的關(guān)系曲線(a)反應(yīng)體系總體積 為120yL(b)反應(yīng)體系總體積為600yL。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地描述：
[0022] (1)利用戊二醛交聯(lián)法將氨基化的磁納米顆粒與親和素偶聯(lián)。取500yL氨基化三氧 化二鐵于離心管中，超聲分散lOmin。加入1.5mL戊二醛1?溶液避光反應(yīng)2h，再PB緩沖液清洗 3次。然后加入適量親和素室溫震蕩孵育6h，用超純水清洗3次，得到親和素功能化磁納米顆 粒，分散于超純水中。
[0023] (2)通過(guò)親和素-生物素系統(tǒng)將生物素化的核酸適配體與親和素功能化的磁納米 顆粒結(jié)合，即將核酸適配體修飾到磁納米顆粒表面。取240μΙ^能親和素功能化磁納米超聲 分散20min，加入10yL生物素化核酸適配體，室溫震蕩孵育30min，磁性分離，用ΤΕ緩沖液清 洗3次后得到核酸適配體功能化的磁納米顆粒，分散于TE緩沖液中。
[0024] (3)金黃色葡萄球菌在線檢測(cè)反應(yīng)條件測(cè)優(yōu)化。對(duì)磁納米顆粒濃度、兩條核酸適配 體探針濃度和恒定檢測(cè)流速進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化結(jié)果顯示:磁納米濃度為1.0mg/mL、核酸適配體 探針濃度分別為ΙΟΟηΜ和120nM、檢測(cè)流速為90mm/min時(shí)，可獲得方法的最佳結(jié)果。
[0025] (4)金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)曲線的建立。將不同濃度金黃色葡萄球菌菌懸液與 核酸適配體功能化的磁納米顆粒和熒光標(biāo)記的核酸適配體混合孵育，進(jìn)行激光誘導(dǎo)熒光在 線檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為:在最優(yōu)條件下，金黃色葡萄球菌濃度在6.7~6.7 X 104CFU/mL范圍內(nèi) 與熒光峰面積呈良好的線性關(guān)系，R2 = 〇. 9872，檢測(cè)限為3CFU/mL。
[0026] (5)實(shí)際水樣品中金黃色葡萄球菌的檢測(cè):對(duì)飲用水和自來(lái)水分裝和滅菌后，再加 入金黃色葡萄球菌，使其成為不同濃度水樣品中的菌懸液。取30yL上述菌懸液與等體積核 酸適配體功能化磁納米顆粒和FAM標(biāo)記的核酸適配體進(jìn)行混合孵育，按照本方法進(jìn)行檢測(cè) 并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得對(duì)應(yīng)的金黃色葡萄球菌濃度，同時(shí)將平板計(jì)數(shù)法作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)進(jìn)行比 較，檢測(cè)結(jié)果參見(jiàn)表1。
[0027] 表1實(shí)際水樣品中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)結(jié)果
[0028]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種核酸適配體功能化磁納米顆粒分離富集金黃色葡萄球菌并利用激光誘導(dǎo)熒光 技術(shù)在線檢測(cè)的方法，其特征在于:將生物素化金黃色葡萄球菌適配體修飾到磁納米顆粒 表面，對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行分離富集;將另外一條熒光標(biāo)記的金黃色葡萄球菌適配體作 為信號(hào)探針與磁納米和金黃色葡萄球菌組裝成夾心結(jié)構(gòu)；以毛細(xì)管為分離通道、流體拖曳 力為驅(qū)動(dòng)力，結(jié)合激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行在線快速檢測(cè)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的生物素化核酸適配體序列為： Biotin-TCCCTACGGCGCTAACCTCCCAACCGCTCCACCCTGCCTCCGCCTCGCCACCGTGCTACAAC〇3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的熒光標(biāo)記的核酸適配體序列為： FAM-GCAATGGTACGGTACTTCCTCGGCACGTTCTCAGTAGCGCTCGCTGGTCATCCCACAGCTACGTCAA〇4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的核酸適配體-磁納米復(fù)合體的制備 是通過(guò)戊二醛交聯(lián)作用，在氨基化三氧化二鐵表面修飾醛基，再與親和素表面氨基連接，即 將親和素修飾到磁納米表面，再通過(guò)生物素-親和素系統(tǒng)將合成的生物素化適配體結(jié)合到 磁納米顆粒表面。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的檢測(cè)過(guò)程為:將磁納米-金黃色葡萄 球菌-FAM夾心復(fù)合體注入毛細(xì)管中，加恒定磁場(chǎng)達(dá)到分離富集的效果，去除磁場(chǎng)后以恒定 流速將復(fù)合物推入檢測(cè)池，用激光誘導(dǎo)熒光儀進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)熒光峰面積變化對(duì)金黃色葡 萄球菌進(jìn)行在線快速檢測(cè)。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的恒定磁場(chǎng)采用永磁鐵。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的將磁納米-金黃色葡萄球菌-FAM夾 心復(fù)合體注入毛細(xì)管中可以用栗或者注射器。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種核酸適配體功能化磁納米顆粒分離富集金黃色葡萄球菌并利用激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)在線檢測(cè)的方法。本方法以核酸適配體修飾磁納米顆粒作為捕獲探針，加入金黃色葡萄球菌，以另一條熒光標(biāo)記的核酸適配體為信號(hào)探針形成夾心結(jié)構(gòu)。采用毛細(xì)管為分離通道、流體拖曳力為驅(qū)動(dòng)力，通過(guò)恒定磁場(chǎng)實(shí)現(xiàn)分離富集，激光誘導(dǎo)熒光在線熒光檢測(cè)，根據(jù)熒光峰面積變化對(duì)金黃色葡萄菌進(jìn)行定量分析。本發(fā)明為金黃色葡萄球菌的檢測(cè)提供了一種新方法，具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)周期短和檢測(cè)限低等優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類】G01N21/64
【公開(kāi)號(hào)】CN105466896
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510817001
【發(fā)明人】沈曉芳, 龐月紅, 孟榮榮
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年4月6日
【申請(qǐng)日】2015年11月23日