一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)的血管活性腸肽i型受體抑制劑高通量篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥理學(xué)領(lǐng)域，利用熒光檢測(cè)技術(shù)，構(gòu)建了血管活性腸肽I型受體抑制劑 的高通量篩選模型，用于待測(cè)樣品對(duì)血管活性腸肽I型受體抑制活性的高通量檢測(cè)。 技術(shù)背景
[0002] 血管活性腸肽I型受體是神經(jīng)多肽與血管活性腸肽的共同受體，介導(dǎo)多種重要的 生物學(xué)功能，如血管活性腸肽I型受體介導(dǎo)神經(jīng)多肽與血管活性腸肽抑制食欲和抗炎的生 物學(xué)功能。血管活性腸肽I型受體在大腦和T細(xì)胞大量表達(dá)，能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)元分化和T細(xì)胞活 化。血管活性腸肽I型受體作為血管活性腸肽受體其中一種亞型，在多種腫瘤細(xì)胞表面高水 平表達(dá)，而低表達(dá)或不表達(dá)于正常組織細(xì)胞，并在腫瘤的進(jìn)展和血管生成中發(fā)揮重要作用， 是一具潛在應(yīng)用價(jià)值的分子影像診斷和治療靶標(biāo)，所以篩選血管活性腸肽I型受體拮抗劑 具有重要應(yīng)用價(jià)值。
[0003] 時(shí)間分辨焚光技術(shù)（time-resolved fluorescence，TRF)是基于鑭系元素如銪 (Eu)、釤(Sm)、鏑(Dy)等具有較長(zhǎng)熒光壽命的特點(diǎn)發(fā)展而來(lái)的。當(dāng)銪螯合物供體與受體之間 距離小于l〇nm，且供體發(fā)射光譜與受體激發(fā)光譜有重疊時(shí)，則發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，均相 時(shí)間分辨焚光（homogeneous time-resolved fluorescence，HTRF)技術(shù)是法國(guó)Cisbio公司 利用這一原理進(jìn)行深入開發(fā)的產(chǎn)品。大多數(shù)熒光物質(zhì)的熒光壽命非常短(一般為幾毫秒）， 為了避免短暫的熒光干擾，Cisbio公司利用較長(zhǎng)熒光壽命的鑭系螯合物作為熒光能量供 體，受體經(jīng)過(guò)別藻藍(lán)蛋白（allophycocyanin)或焚光素修飾，供體在能量轉(zhuǎn)移時(shí)就可以使受 體也具有較長(zhǎng)的熒光壽命。因此，能量轉(zhuǎn)移時(shí)受體發(fā)射光消失時(shí)間與供體發(fā)射光消失時(shí)間 成正比，而與供受體間的距離成反比，這種方法延長(zhǎng)了熒光檢測(cè)時(shí)間，降低了短暫熒光引起 的背景干擾。
[0004] 實(shí)驗(yàn)中利用血管活性腸肽I型受體和Gs蛋白耦聯(lián)，激活A(yù)C，使cAMP含量增加，會(huì)產(chǎn) 生帶有熒光的產(chǎn)物，通過(guò)熒光強(qiáng)弱來(lái)判斷血管活性腸肽I型受體的作用，從而得出化合物是 否有抑制血管活性腸肽I型受體作用，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)血管活性腸肽I型受體抑制劑的高通量篩 選模型的建立。
[0005] 目前，少有對(duì)于血管活性腸肽I型受體抑制劑的篩選方法，因此，建立方便快捷準(zhǔn) 確的檢測(cè)方法，特別是體外的功能性檢測(cè)在藥物篩選中越來(lái)越受到重視。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于建立一種基于熒光的血管活性腸肽I型受體抑制劑高通量篩選 模型，具有信噪比高，使用安全，樣品消耗量小的特點(diǎn)。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案:采用熒光方法建立體外血管活性腸肽I型受體抑制劑高通量 篩選模型，初篩，復(fù)篩發(fā)現(xiàn)一類具有抑制血管活性腸肽I型受體活性的候選化合物。具體步 驟如下：
[0008] 本發(fā)明利用熒光的方法建立了一種血管活性腸肽I型受體抑制劑高通量篩選模 型。
[0009] 步驟一:血管活性腸肽I型受體抑制劑篩選模型的建立與優(yōu)化。
[0010] 步驟二:陽(yáng)性藥驗(yàn)證模型可靠性。
[0011] 步驟三:高通量篩選模型驗(yàn)證。
【附圖說(shuō)明】：
[0012] 圖1:血管活性腸肽I型受體細(xì)胞濃度梯度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（n = 1，hs)
[0013] 圖2: VIP濃度梯度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（η = 1，；辦）
[0014]圖3:陽(yáng)性藥VIP(l-7)-GRF(8-27)對(duì)血管活性腸肽I型受體的抑制曲線圖。 (n=7, x+S)
[0015]
【具體實(shí)施方式】
[0016] 以下結(jié)合【附圖說(shuō)明】本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】：
[0017] -、血管活性腸肽I型受體抑制劑篩選方法建立
[0018] 1、實(shí)驗(yàn)材料
[0019] d2-cAMP檢測(cè)試劑盒（Cisbio,法國(guó)）、￥1卩（51811^-&1(14。11，美國(guó)）、￥1?(1-7)-61^ (8-27)(Sigma-aldrich，美國(guó)）、01^]\^85(6讓(：〇，美國(guó)）384孔聚丙烯微孔板〇3七#3573 (Corning，美國(guó)）、一次性槍頭(Axygen，美國(guó)）
[0020] 2、實(shí)驗(yàn)步驟
[0021 ] 1)血管活性腸肽I型受體細(xì)胞最適濃度確定
[0022] 1)配制不同濃度的血管活性腸肽I型受體細(xì)胞，每孔加入5μ1。
[0023] 2)每孔加入5μ1含VIP的1 X反應(yīng)buffer。
[0024] 4)室溫反應(yīng)45分鐘。
[0025] 5)加入ΙΟμLΧ終止buffer，室溫孵育1小時(shí)。檢測(cè)熒光強(qiáng)度，確定最適血管活性腸 肽I型受體細(xì)胞濃度(見圖2)。
[0026] (2)VIP最適濃度確定
[0027] 1)配制不同濃度的VIP，每孔加入5μ1。
[0028] 2)每孔加入5μ1重懸血管活性腸肽I型受體細(xì)胞的1 X反應(yīng)buffer。
[0029] 4)室溫孵育45分鐘。
[0030] 5)加入ΙΟμLΧ終止buffer，室溫孵育1小時(shí)。檢測(cè)熒光強(qiáng)度，確定最適VIP濃度（見 圖1)。
[0031] (3)陽(yáng)性藥(VIP(l-7)-GRF(8-27))IC5〇
[0032] 1)配制不同濃度的VIP(l-7)-GRF(8-27)，每孔加入2·5μ1。
[0033] 2)配制最適濃度的VIP，每孔加入2.5μ1(空白對(duì)照加5μ1 IX反應(yīng)buffer)
[0034] 3)配制給定濃度的血管活性腸肽I型受體細(xì)胞，每孔加入5μ1。
[0035] 4)室溫反應(yīng)45分鐘。
[0036] 5)加入ΙΟμLΧ終止buffer，室溫孵育1小時(shí)。檢測(cè)熒光強(qiáng)度，計(jì)算得出VIP( 1-7)- GRF(8-27)的 IC5〇(見圖3)。
[0037] 2 ·數(shù)據(jù)處理
[0038] 1)根據(jù)公式計(jì)算各孔665nm和610nm處熒光強(qiáng)度的比值(Ratio 665/610);
[0039] 2)根據(jù)公式計(jì)算各孔的相對(duì)抑制率
[0040]
[0041] 3)活性樣品進(jìn)行濃度稀釋后檢測(cè)的相對(duì)抑制率值，使用作Graphpad軟件作圖求算 半數(shù)抑制率IC 50。
[0042] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0043] 血管活性腸肽I型受體篩選模型優(yōu)化結(jié)果:最佳反應(yīng)所需的確定VIP的最適濃度是 236μΜ(見圖1)，血管活性腸肽I型受體細(xì)胞的最適濃度是50〇 cells/well (見圖2)，陽(yáng)性藥抑 制率IC5Q為2980μΜ(見圖3)，表明采用本方法建立的血管活性腸肽I型受體抑制劑體外篩選 模型達(dá)到了高通量篩選的要求，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠，可以用于進(jìn)行血管活性腸肽I型受體抑 制劑的高通量篩選。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種血管活性腸肽I型受體抑制劑高通量篩選模型，其特征在于，包括步驟： (1) 血管活性腸肽I型受體抑制劑篩選模型的建立與優(yōu)化； (2) 陽(yáng)性藥驗(yàn)證模型可靠性； (3) 高通量篩選模型驗(yàn)證。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1)中進(jìn)行確定VIP和血管活性腸肽I型 受體細(xì)胞最適濃度的實(shí)驗(yàn)。3. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，配制不同濃度的VIP，每孔加入5μ 1，再每孔加入5μ1含血管活性腸肽I型受體細(xì)胞的1X反應(yīng)buffer，室溫孵育45分鐘，檢測(cè)熒 光強(qiáng)度，確定最適VIP濃度為236μΜ;配制不同濃度的血管活性腸肽I型受體細(xì)胞，每孔加入5 μL，再每孔加入5μ1含VIP的1X反應(yīng)buffer，室溫孵育45分鐘，檢測(cè)熒光強(qiáng)度，確定最適多血 管活性腸肽I型受體細(xì)胞濃度為500cellS/well。4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2)配制不同濃度的陽(yáng)性藥VIP(l-7)_ GRF(8-27)，每孔加入2.5μ1，配制最適濃度的VIP，每孔加入5μ1(空白對(duì)照加5μ1IX反應(yīng) buffer)，室溫孵育45分鐘，檢測(cè)熒光強(qiáng)度，計(jì)算得出陽(yáng)性藥的IC5Q為2980μΜ。5. 權(quán)利要求1-5中所述任一所述的方法在篩選血管活性腸肽I型受體抑制劑的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種篩選血管活性腸肽I型受體抑制劑高通量篩選方法，本發(fā)明中利用實(shí)驗(yàn)中利用血管活性腸肽I型受體和Gs蛋白耦聯(lián)，激活A(yù)C，使cAMP含量增加，會(huì)產(chǎn)生帶有熒光的產(chǎn)物，通過(guò)熒光強(qiáng)弱來(lái)判斷血管活性腸肽I型受體的作用，從而得出化合物是否有血管活性腸肽I型受體抑制作用。包括以下步驟：(1)血管活性腸肽I型受體抑制劑篩選模型的建立與優(yōu)化：確定VIP和血管活性腸肽I型受體細(xì)胞反應(yīng)的最適濃度；(2)陽(yáng)性藥驗(yàn)證模型可靠性：陽(yáng)性藥IC50與參考文獻(xiàn)一致。方法簡(jiǎn)便快捷；熒光檢測(cè)值靈敏度高，提高檢測(cè)精確度；結(jié)果穩(wěn)定可靠，重現(xiàn)性好。
【IPC分類】G01N21/64
【公開號(hào)】CN105466897
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510828140
【發(fā)明人】嚴(yán)明, 沈靈, 孫丹丹, 何玲, 張陸勇
【申請(qǐng)人】中國(guó)藥科大學(xué)
【公開日】2016年4月6日
【申請(qǐng)日】2015年11月20日