一種花粉管裝載熒光染料的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及花粉管的極性生長(zhǎng)領(lǐng)域，尤其涉及一種花粉管裝載熒光染料的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]花粉管的正常生長(zhǎng)是多種信號(hào)分子調(diào)控的結(jié)果，而鈣離子在其中發(fā)揮著重要作用。在多種植物中已觀察到花粉管細(xì)胞質(zhì)尖端較高的鈣梯度，鈣濃度梯度的消失會(huì)導(dǎo)致花粉管生長(zhǎng)停止?；ǚ酃茼敹烁哜}梯度可能有以下功能:第一，它可能參與囊泡分泌的調(diào)節(jié)，因?yàn)楦邼舛鹊拟}利于分泌囊泡與質(zhì)膜的融合，促進(jìn)外排作用，使花粉管延伸；第二，高濃度鈣使微絲解聚，細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)減慢，所以鈣梯度可以通過(guò)控制微絲的組裝來(lái)影響細(xì)胞器的運(yùn)輸;第三，高濃度的鈣與花粉管定向生長(zhǎng)有關(guān)，花粉管頂端高濃度的游離鈣離子會(huì)抑制肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白調(diào)控的運(yùn)動(dòng)使囊泡沉淀，如果在花粉管一側(cè)增加胞質(zhì)游離鈣濃度，會(huì)使花粉管改變?cè)瓉?lái)的生長(zhǎng)方向，向高鈣濃度一側(cè)生長(zhǎng)。為了進(jìn)一步研究花粉管中鈣離子的作用，我們可以使用熒光標(biāo)記技術(shù)。在這一過(guò)程中熒光指示劑是不可缺少的標(biāo)記物質(zhì)，在植物花粉管構(gòu)造及生長(zhǎng)特性研究中起著越來(lái)越重要的作用。目前常用的熒光指示劑具有在不破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、維持組織活性的前提下，通過(guò)熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡以及流式細(xì)胞儀等特點(diǎn)儀器的測(cè)定，能夠得到花粉管特定細(xì)微結(jié)構(gòu)及組織熒光圖像。這種方法的成功要基于將染料成功地裝載到花粉(管)中，目前，鈣離子熒光探針的種類(lèi)有:單波長(zhǎng)熒光探針，包括fluo-3、quin_2、Calcium Green、Calcium Orange等；和雙波長(zhǎng)焚光探針，主要有indo-Ι、fura-2、fura-red等。鈣離子熒光指示劑的裝載方法有:電穿孔(這種方法對(duì)細(xì)胞損傷大，設(shè)備貴，現(xiàn)在一般不用)、顯微注射(這種方法對(duì)細(xì)胞有一定程度的損傷，另外操作復(fù)雜、工作量大、成功率低、不適用于個(gè)體較小的細(xì)胞、不適用于批量細(xì)胞等缺點(diǎn)都限制了這一方法的廣泛應(yīng)用、膜片鉗(速度慢、設(shè)備昂貴)、低溫法(時(shí)間長(zhǎng))、高溫法(影響存活)。為了克服以上的不足，需要探索快速有效地裝載熒光染料的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種花粉管裝載熒光染料的方法。
[0004]本發(fā)明通過(guò)下述方案實(shí)現(xiàn):
[0005]—種花粉管裝載熒光染料的方法，包括以下步驟:
[0006]第一步，將花粉包裹于稱量紙中，放置于密閉的硅膠瓶中保存于低溫冰箱中；
[0007]第二步，花粉從冰箱中取出后，在常溫下放置2h后加入培養(yǎng)液中，將其攪拌均勻后置于25°C恒溫箱中培養(yǎng)2h，
[0008]第三步，將培養(yǎng)液與裂解液、染色劑對(duì)應(yīng)混合，避光10-30min，然后置于25°C恒溫箱中避光培養(yǎng)2h。
[0009]在所述第二步中，所述培養(yǎng)液是將溶質(zhì)溶解在30mM的2-(N_嗎啉)乙磺酸一水合物溶液中，所述溶質(zhì)包括蔗糖、聚乙二醇、硼酸硝酸鈣；
[0010]其中，在所述培養(yǎng)液中溶質(zhì)的質(zhì)量百分比如下所示:10%蔗糖，20%聚乙二醇，0.01%硼酸，0.03%硝酸鈣。
[0011 ]所述培養(yǎng)液與裂解液、染色劑的體積比為48:1:1。
[0012]所述裂解液中的CTAB質(zhì)量百分比為2%，Tris-HC 1的濃度為1 OOmM，EDTA的濃度為40mMo
[0013]所述染色劑為乙酰甲酯衍生物，可以穿透細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞后會(huì)被胞內(nèi)酯酶所水解，產(chǎn)生的Fluo-4隨后會(huì)和鈣離子結(jié)合并發(fā)出熒光。
[0014]本發(fā)明的有益效果為:
[0015]本發(fā)明一種花粉管裝載熒光染料的方法采用的染色劑(Fluo-4AM-ester)是一種可以穿透細(xì)胞膜的熒光染料，主要通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間游離的鈣離子結(jié)合對(duì)Ca2+信號(hào)分布進(jìn)行定量分析，它可以靈敏反映細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度變化，染色劑進(jìn)入細(xì)胞后經(jīng)非特異性酯酶脫去AM成為Fluo-4留在細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)luo-4與細(xì)胞內(nèi)游離鈣結(jié)合后其熒光強(qiáng)度是本身的四十多倍以上。使用鈣離子熒光探針結(jié)合熒光分析技術(shù)研究細(xì)胞內(nèi)鈣離子時(shí)，熒光染料的裝載是這一方法中的關(guān)鍵步驟，本發(fā)明采用裂解液處理，破壞花粉的細(xì)胞膜，使得染色劑能夠快速有效地進(jìn)入細(xì)胞。本發(fā)明通過(guò)使用裂解液及染色劑(Fluo-4AM-ester)，在常溫(25°C)下對(duì)花粉管處理20min，能夠?qū)ǚ酃苤锈}離子成功染色。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明:
[0017]本發(fā)明中，mM為物質(zhì)的量濃度單位，為豪摩爾每升。
[0018]—種花粉管裝載熒光染料的方法，包括以下步驟:
[0019]第一步，將花粉包裹于稱量紙中，放置于密閉的硅膠瓶中保存于低溫冰箱中；
[0020]第二步，花粉從冰箱中取出后，在常溫下放置2h后加入培養(yǎng)液中，將其攪拌均勻后置于25°C恒溫箱中培養(yǎng)2h，
[0021]第三步，將培養(yǎng)液與裂解液、染色劑對(duì)應(yīng)混合，避光10-30min，然后置于25°C恒溫箱中避光培養(yǎng)2h。
[0022]在所述第二步中，所述培養(yǎng)液是將溶質(zhì)溶解在30mM的2-(N_嗎啉)乙磺酸一水合物溶液中，所述溶質(zhì)包括蔗糖、聚乙二醇、硼酸硝酸鈣；
[0023]其中，在所述培養(yǎng)液中溶質(zhì)的質(zhì)量百分比如下所示:10%蔗糖，20%聚乙二醇，0.01%硼酸，0.03%硝酸鈣。
[0024]所述培養(yǎng)液與裂解液、染色劑的體積比為48:1:1。
[0025]所述裂解液中的CTAB質(zhì)量百分比為2 %，Tri s-HC 1的濃度為1 OOmM，EDTA的濃度為40mMo
[0026]所述染色劑為乙酰甲酯衍生物，可以穿透細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞后會(huì)被胞內(nèi)酯酶所水解，產(chǎn)生的Fluo-4隨后會(huì)和鈣離子結(jié)合并發(fā)出熒光。
[0027]其中Fluo-4的分子式為C51H5QF2N2O23，其分子量為1096.94。
[0028]在實(shí)際使用中，還可在第三步完成后在花粉溶液中加入LaCl3，能使花粉管中游離鈣離子濃度顯著增加。
[0029]本發(fā)明一種花粉管裝載熒光染料的方法采用的染色劑(Fluo-4M-ester)是一種可以穿透細(xì)胞膜的熒光染料，主要通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間游離的鈣離子結(jié)合對(duì)Ca2+信號(hào)分布進(jìn)行定量分析，它可以靈敏反映細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度變化，染色劑進(jìn)入細(xì)胞后經(jīng)非特異性酯酶脫去AM成為Fluo-4留在細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)luo-4與細(xì)胞內(nèi)游離鈣結(jié)合后其熒光強(qiáng)度是本身的四十多倍以上。使用鈣離子熒光探針結(jié)合熒光分析技術(shù)研究細(xì)胞內(nèi)鈣離子時(shí)，熒光染料的裝載是這一方法中的關(guān)鍵步驟，本發(fā)明采用裂解液處理，破壞花粉的細(xì)胞膜，使得染色劑能夠快速有效地進(jìn)入細(xì)胞。本發(fā)明通過(guò)使用裂解液及染色劑(Fluo-4AM-ester)，在常溫(25°C)下對(duì)花粉管處理20min，能夠?qū)ǚ酃苤锈}離子成功染色。
[0030]盡管已經(jīng)對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做了較為詳細(xì)的闡述和列舉，應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，對(duì)上述實(shí)施例做出修改或者采用等同的替代方案，這對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種花粉管裝載熒光染料的方法，其特征在于，包括以下步驟: 第一步，將花粉包裹于稱量紙中，放置于密閉的硅膠瓶中保存于低溫冰箱中； 第二步，花粉從冰箱中取出后，在常溫下放置2h后加入培養(yǎng)液中，將其攪拌均勻后置于25°C恒溫箱中培養(yǎng)2h， 第三步，將培養(yǎng)液與裂解液、染色劑對(duì)應(yīng)混合，避光10-30min，然后置于25°C恒溫箱中避光培養(yǎng)2h。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種花粉管裝載熒光染料的方法，其特征在于:在所述第二步中，所述培養(yǎng)液是將溶質(zhì)溶解在30mM的2-(N-嗎啉)乙磺酸一水合物溶液中，所述溶質(zhì)包括蔗糖、聚乙二醇、硼酸硝酸鈣； 其中，在所述培養(yǎng)液中溶質(zhì)的質(zhì)量百分比如下所示:10%蔗糖，20%聚乙二醇，0.01%硼酸，0.03%硝酸鈣。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種花粉管裝載熒光染料的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)液與裂解液、染色劑的體積比為48:1:1。4.根據(jù)權(quán)利要求1或者3所述的一種花粉管裝載熒光染料的方法，其特征在于:所述裂解液中的CTAB質(zhì)量百分比為2%，Tris-HCl的濃度為100mM，EDTA的濃度為40mM。5.根據(jù)權(quán)利要求1或者3所述的一種花粉管裝載熒光染料的方法，其特征在于:所述染色劑為乙酰甲酯衍生物(Flu0-4AM-ester)，可以穿透細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞后會(huì)被胞內(nèi)酯酶所水解，產(chǎn)生的Fluo-4隨后會(huì)和鈣離子結(jié)合并發(fā)出熒光。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種花粉管裝載熒光染料的方法，包括以下步驟：第一步，將花粉包裹于稱量紙中，放置于密閉的硅膠瓶中保存于低溫冰箱中；第二步，花粉從冰箱中取出后，在常溫下放置2h后加入培養(yǎng)液中，將其攪拌均勻后置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)2h，第三步，將培養(yǎng)液與裂解液、染色劑對(duì)應(yīng)混合，避光10-30min，然后置于25℃恒溫箱中避光培養(yǎng)2h。本發(fā)明采用裂解液處理，破壞花粉的細(xì)胞膜，使得染色劑能夠快速有效地進(jìn)入細(xì)胞。本發(fā)明通過(guò)使用裂解液及染色劑(Fluo-4AM-ester)，在常溫(25℃)下對(duì)花粉管處理20min，能夠?qū)ǚ酃苤锈}離子成功染色。
【IPC分類(lèi)】G01N1/30, G01N21/64
【公開(kāi)號(hào)】CN105486565
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510944828
【發(fā)明人】屈海泳, 王永章, 劉成連, 原永兵, 邢文曦, 吳芬芬, 管押琴
【申請(qǐng)人】青島農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年4月13日
【申請(qǐng)日】2015年12月16日