基于細(xì)胞與微電極的相互作用實(shí)現(xiàn)單一癌細(xì)胞的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于癌細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種通過(guò)電化學(xué)方法研究細(xì)胞與微電 極的碰撞行為，實(shí)現(xiàn)單一細(xì)胞的檢測(cè)方法，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)癌癥的早期診斷。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞電化學(xué)是基于電化學(xué)原理、實(shí)驗(yàn)方法與細(xì)胞、分子生物學(xué)技術(shù)相互結(jié)合，對(duì)細(xì) 胞進(jìn)行分析和表征，研究或模擬研究細(xì)胞荷電離子或電活性粒子能量傳遞的運(yùn)動(dòng)規(guī)律，揭 示細(xì)胞結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系和外源分子對(duì)細(xì)胞功能影響的一個(gè)新研究領(lǐng)域。目前電化學(xué)檢測(cè)癌 細(xì)胞，是將玻碳電極上鍍一層納米金，然后修飾DNA，再將細(xì)胞特異性的結(jié)合，根據(jù)電極修飾 前后，電解池中K 4Fe (CN) 6/K3Fe (CN)6的電流信號(hào)的變化來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的。電極表面上修飾的 DNA是大量的，那么結(jié)合的細(xì)胞也是很多的，該方法通常不能實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)細(xì)胞的檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的癌細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)所存在的不足，本發(fā)明提供了一種選擇性 好、靈敏度高以及實(shí)現(xiàn)單一癌細(xì)胞的檢測(cè)與識(shí)別的，基于細(xì)胞與微電極的相互作用實(shí)現(xiàn)單 一癌細(xì)胞的檢測(cè)方法。
[0004] 本發(fā)明實(shí)現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案由以下步驟組成：
[0005] (1)將電化學(xué)活性分子或摻雜電化學(xué)活性分子的納米粒子與能夠特定識(shí)別癌細(xì)胞 的適配體DNA通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合；
[0006] (2)將待檢細(xì)胞離心后，與步驟(1)的結(jié)合電化學(xué)活性分子的適配體DNA在4°C培養(yǎng) 2h后，離心，洗滌，分散在濃度為0.0 lmo 1 /L、pH=7.4的磷酸緩沖液中備用，使標(biāo)有電化學(xué)活 性分子的適配體DNA與細(xì)胞表面蛋白特異性的識(shí)別；
[0007] (3)利用電化學(xué)工作站中的三電極體系進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，以金微電極為工作電極、 鉑電極為對(duì)電極、Ag/AgCl電極為參比電極、0.01 mo 1/L pH=7.4的磷酸緩沖液為電解液，將 步驟(2)處理后的待檢細(xì)胞注射到電解液中，待檢細(xì)胞在電解池中自由運(yùn)動(dòng)，單一的待檢細(xì) 胞與微電極表面發(fā)生碰撞，并粘附在其表面上時(shí)，待檢細(xì)胞上的電化學(xué)活性物質(zhì)能夠發(fā)生 氧化反應(yīng)，則產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)，即可確定該單一的待檢細(xì)胞為癌細(xì)胞;若無(wú)電化學(xué)信號(hào)產(chǎn) 生，則說(shuō)明該細(xì)胞非癌細(xì)胞。
[0008] 上述電化學(xué)活性分子是二茂鐵小分子、亞甲基藍(lán)或聯(lián)釕吡啶等。
[0009] 上述適配體DNA是AS1411或Sgc8c，其中AS1411的序列為NH2-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG，Sgc8c的序列為NH2-ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTA CGG TTA GA。
[0010] 上述納米粒子是單質(zhì)金屬納米粒子或無(wú)機(jī)化合物納米粒子或復(fù)合納米粒子，所述 金屬納米粒子是金、鉬、鎳或銀納米粒子，所述復(fù)合納米粒子是金/鉬復(fù)合納米粒子或金/二 氧化娃復(fù)合納米粒子，所述無(wú)機(jī)化合物納米粒子為二氧化娃納米粒子或碳量子點(diǎn)納米粒子 或者復(fù)勒稀C60納米粒子。
[0011] 本發(fā)明所提供的基于細(xì)胞與微電極的相互作用實(shí)現(xiàn)單一癌細(xì)胞的檢測(cè)方法是利 用電化學(xué)活性分子通過(guò)癌細(xì)胞的特定適配體與癌細(xì)胞結(jié)合，使標(biāo)有電化學(xué)活性分子的適配 體DNA與細(xì)胞表面蛋白特異性的識(shí)別，再利用電化學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)電解質(zhì)中的癌細(xì)胞與 微電極發(fā)生碰撞時(shí)會(huì)產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)，由于微電極的有效面積很小，當(dāng)細(xì)胞與電極發(fā)生碰 撞，并粘附在電極表面上，通過(guò)研究細(xì)胞與微電極的相互作用，實(shí)現(xiàn)單一細(xì)胞的研究及單一 癌細(xì)胞的識(shí)別，本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、選擇性好，可致力于癌癥的早期診斷。
【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1是二茂鐵連接的細(xì)胞與微電極的碰撞的電流-時(shí)間關(guān)系曲線，直線表示無(wú)細(xì)胞 電流-時(shí)間關(guān)系曲線，曲線表示有細(xì)胞的電流-時(shí)間關(guān)系曲線。
[0013] 圖2是氨基化的摻雜聯(lián)釕吡啶的二氧化硅的納米粒子TEM圖。
[0014] 圖3是修飾有摻雜聯(lián)釕吡啶的二氧化硅納米粒子連接的細(xì)胞在恒電位下（電位為 1.1V)與微電極碰撞的電流-時(shí)間關(guān)系曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)、附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，但是本發(fā)明不 僅限于下述的實(shí)施情形。
[0016] 實(shí)施例1
[0017]本實(shí)施例的電化學(xué)活性分子選擇二茂鐵小分子，特定識(shí)別癌細(xì)胞的適配體DNA選 擇AS 1411 (NH2-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG)，檢測(cè)單一癌細(xì)胞的方法由下述步驟組成： [0018] (1 )將二茂鐵小分子與能夠特定識(shí)別Hela細(xì)胞的適配體AS1411( (NH2- GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG)通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合，具體是：
[0019] (1.1)活化羧基化的二茂鐵小分子
[0020] 取純化的二茂鐵甲酸(Fc-C00H)102.5mg溶解在7mL二氯甲烷(簡(jiǎn)稱(chēng)DCM)中，加入質(zhì) 量比為5:2的EDC(N'_(乙基羰基亞氨基)-N，N-二甲基丙烷_(kāi)1，3二氨基氯化物)/NHS(N-羥基 丁二酰亞胺）中，在室溫下，混合物在氮?dú)夥諊谐掷m(xù)攪拌17小時(shí)，反應(yīng)完全后，混合物用水 洗3次，每次用水量為8mL，水相用15mL的DCM提取，有機(jī)相被MgS〇4干燥，混合物過(guò)濾，蒸發(fā)， 生成中間產(chǎn)物Fc-NHS，使其易于和氨基化的DNA結(jié)合。
[0021] (1.2)活化后的二茂鐵與特定識(shí)別Hela細(xì)胞的適配體AS1411通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合。
[0022] 取中間產(chǎn)物溶解在50yL濃度為0.5111〇1/1、？!1=8.5的碳酸氫鈉溶液，加入1(^的二 甲基甲酰胺，再加入l〇yL 200ymol/L的適配體AS1411，在4°C避光條件下，持續(xù)攪拌4h以使 反應(yīng)完全，將生成物溶解在濃度為0.01mol/L、pH=7.4的磷酸緩沖液中，以備使用。
[0023] (2)將待檢細(xì)胞用常規(guī)方法離心后加入步驟（1.2)的磷酸緩沖液中，使待檢細(xì)胞與 結(jié)合電化學(xué)活性分子的適配體DNA在4°C培養(yǎng)2h，常規(guī)離心、洗滌后，分散在濃度為0.0 lmol/ L、pH = 7.4的磷酸緩沖液中備用，由于DNA能與細(xì)胞表面蛋白特異性的結(jié)合，所以電化學(xué)物 質(zhì)二茂鐵能有效標(biāo)記在細(xì)胞表面。
[0024] (3)利用電化學(xué)工作站中的三電極體系進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，以金微電極為工作電極、 鉑電極為對(duì)電極、Ag/AgCl電極為參比電極、0.01 mo 1/L pH=7.4的磷酸緩沖液為電解液，將 步驟(2)處理后的待檢細(xì)胞注射到電解液中，在恒電位(電位為1. IV)下，標(biāo)記有二茂鐵分子 的待檢細(xì)胞在電解液中自由移動(dòng)，由于微電極的尺寸小，同時(shí)細(xì)胞之間存在電荷排斥和空 間位阻，就容易實(shí)現(xiàn)單一細(xì)胞與微電極表面發(fā)生碰撞，當(dāng)單一的待檢細(xì)胞與微電極表面發(fā) 生碰撞，并粘附在其表面上時(shí)，待檢細(xì)胞上的二茂鐵小分子能夠發(fā)生氧化反應(yīng)，瞬間產(chǎn)生增 大明顯的電流信號(hào)，如圖1所示，即產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)，可確定該單一的待檢細(xì)胞為Hela細(xì)胞； 若無(wú)電化學(xué)信號(hào)產(chǎn)生，則說(shuō)明該細(xì)胞并非是Hela細(xì)胞。
[0025] 實(shí)施例2
[0026] 本實(shí)施例的電化學(xué)活性分子選擇聯(lián)釕吡啶，納米粒子是選用二氧化硅納米粒子， 特定識(shí)別癌細(xì)胞的適配體DNA選擇AS 1411 (NH2-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG)，檢測(cè)單一 癌細(xì)胞的方法由下述步驟組成：
[0027] (1)將摻雜聯(lián)釕吡啶的二氧化硅納米粒子與能夠特定識(shí)別Hela細(xì)胞的適配體 AS1411 ((NH2-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG)通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合，具體是：
[0028] (1.1)在摻雜聯(lián)釕吡啶的二氧化硅納米粒子(RuSNPs)表面官能團(tuán)化
[0029]用反相微乳液的方法合成摻雜聯(lián)釕吡啶的二氧化硅納米粒子(RuSNPs)，其具體過(guò) 程如下：其中Triton X-100作表面活性劑，正己醇作助表面活性劑，環(huán)己烷作連續(xù)相，超純 水作分散性，形成W/0型的微乳液，在室溫25°C下，分別取1.8mL的Triton X-100、l .8mL的正 己醇、7.5mL的環(huán)己烷混合均勻，磁力攪拌30min后，加入超純水后，溶液保持澄清透明，再加 入50-10(^]^的聯(lián)舒[1比啶(1?11(^口7)3 2+)，聯(lián)舒[1比啶(1?11(^口7)32+)能分散在水環(huán)境中，形成穩(wěn)定 的油包水結(jié)構(gòu)，繼續(xù)攪拌lh后，加入正硅酸乙酯、氨水，持續(xù)攪拌24h后，再加入正硅酸乙酯 和3-氨丙基三乙氧基硅烷，再攪拌24h，待反應(yīng)完全后，加入丙酮破乳，離心收集，分別用乙 醇，超純水反復(fù)洗滌2或3次，在真空中至少放置兩天，