一種甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及臨床體外檢測試劑技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽 酶檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 早在1966年，Hopsu-Havu和Glenner發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物肽酶的生物化學(xué)和組織化學(xué)研 究中，色源底物甘氨酰-脯氨酰-β-萘胺(Gly-Pro-β-ΝΑ)可被某些酶制品水解，他們從這些 酶制品成功地分離出了這種可以水解Gly-Pro-β-ΝΑ的酶，并證明其水解產(chǎn)物為甘氨酰-脯 氨酸和β-萘胺。為了探尋哺乳動(dòng)物組織中是否存在這種酶，他們首先以小鼠的肝臟為樣品 進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)的確存在這種酶。繼而，將脫脂小鼠的腎臟切片與Gly-Pro-β-ΝΑ和偶氮染 料共孵育，發(fā)現(xiàn)小鼠的腎組織中存在水解產(chǎn)生的萘胺，表明在小鼠的肝臟及腎臟中都存在 這種二肽氨基肽酶，即甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶。甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶不僅存在 于小鼠中，還存在于豬、牛、人及各種動(dòng)物組織中。甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶能特異性地 水解Ν-末端第二位為脯氨酰的肽鍵。用不同氨基酸合成不同的X-脯氨酰對硝基苯胺（X-Pro-p-NA)，在ρΗ=8.7的條件下，人血清甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶對這些人工底物的水解 速率大小依次為61 7-^1&-、1^8-^坪-、6111-和48?-?仰-?-嫩。說明底物1末端氨基酸殘基 不同，影響著甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶活性及對底物的Km值。
[0003] 健康成人血清甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶水平較為恒定，新生兒顯著低于成人， 從嬰兒出生到20歲的迅速發(fā)育階段，血清甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶含量逐漸升高。原發(fā) 性肝癌病人血清中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶活性顯著高于正常人和慢性肝炎、肝硬化、 膽石癥、阻塞性黃疸的患者，但是重癥肝炎、酒精性肝炎患者血清中甘氨酰脯氨酸二肽氨基 肽酶活性的升高程度大于肝癌病人。肝血管瘤患者血清中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶的活 性正常。胃癌患者血清中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶的活性降低，其它良性胃腸道疾病時(shí)， 血清中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶的活性也略有降低此。
[0004] 目前，用于甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶的檢測方法主要有連續(xù)監(jiān)測法、非連續(xù)的 直接比色法和間接比色法。本發(fā)明提供一種用連續(xù)監(jiān)測法檢測甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶 的試劑盒，優(yōu)化其反應(yīng)體系，使其重復(fù)性好、穩(wěn)定性好、可進(jìn)行批量樣本全自動(dòng)化檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種穩(wěn)定性好的用于檢測甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶試劑 盒，該試劑盒采用連續(xù)監(jiān)測法。該試劑盒與常規(guī)的試劑盒相比，穩(wěn)定性和線性范圍比常規(guī)的 檢測試劑盒要好有利于試劑在臨床上的推廣應(yīng)用。
[0006] 基本原理： 以免疫比濁法為測定原理，血清中α?-酸性糖蛋白抗原與相應(yīng)抗體在溶液中相遇，形成 不溶性的抗原-抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液產(chǎn)生一定的池度，該池度的高低在一定量的抗體存在 時(shí)與抗原的含量成正比。在特定波長下測定該復(fù)合物的吸光值，與校準(zhǔn)品標(biāo)定的校準(zhǔn)曲線 比較，即可計(jì)算出樣本中的α?-酸性糖蛋白的含量。
[0007] 發(fā)明是通過以下步驟得到的： 一種甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶檢測試劑盒，其特征在于，它包含試劑R1和試劑R2。試 劑組成如下：試劑R1為100mm〇l/L pH8.6 Tris雙甘肽緩沖液、2mmol/L氯化鈉、10mmol/L疊 氮鈉;試劑R2為:pH7.5 Goods緩沖液、50mmol/L甘氨酰脯氨酸對硝基苯胺對甲苯磺酸、2%甘 露醇、10mmol/L疊氮鈉。
[0008] 所述的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶檢測試劑盒來檢測甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽 酶的檢測方法，使用全自動(dòng)生化分析儀利用速率法進(jìn)行測定，檢測主波長為405nm。
[0009] 所述的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶檢測試劑，試劑R1和試劑R2在使用時(shí)的比例為 Rl：R2=225：75〇
[0010] 本發(fā)明的試劑盒在具有雙試劑功能的全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行，其具體使用方法 圖3,加入生理鹽水、樣本或校準(zhǔn)品15μ1，再加入225μ1的R1試劑預(yù)孵育5min后讀取吸光度 A1，之后再加入75μ1的R2試劑反應(yīng)5min后，讀取吸光度A2，并計(jì)算Δ A。
[0011] 本發(fā)明的有益效果： 1) 試劑R1中添加氯化鈉，試劑R2中添加甘露醇，增強(qiáng)了試劑的穩(wěn)定性和抗干擾能力，而 且不會(huì)對試劑的準(zhǔn)確度產(chǎn)生影響； 2) 試劑的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性良好，價(jià)格便宜，使用方便，有利于該試劑在市場中進(jìn)一步的 推廣。
【附圖說明】
[0012]圖1為兩種試劑的相關(guān)性曲線圖， 圖2為兩種試劑效期穩(wěn)定性曲線圖， 圖3為本發(fā)明的試劑盒在具有雙試劑功能的全自動(dòng)生化分析儀上的使用方法。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明： 實(shí)施例1 一種常規(guī)的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶檢測試劑盒，它包括試劑R1和試劑R2。
[0014] 其中試劑R1組成為： pH8.6 Tris雙甘肽緩沖液 100mmol/L 氯化鈉 2mmol/L 疊氮鈉 10mmol/L 試劑R2組成為： Goods 緩沖液 pH7 · 5 甘氨酰脯氨酸對硝基苯胺對甲苯磺酸50mmol/L 甘露醇 2% 疊氮鈉 10mmol/L 本實(shí)施例所述試劑R1和試劑R2,配置時(shí)需先配制緩沖液，調(diào)到適當(dāng)pH值后，再添加其它 物質(zhì)。本實(shí)施例所述試劑盒在使用時(shí)，其測定方法是采用具有雙試劑功能的邁瑞800全自動(dòng) 生化分析儀，利用速率法進(jìn)行測定，操作如下： 加入生理鹽水、樣本或校準(zhǔn)品15μ1，再加入225μ1的R1試劑預(yù)孵育5min后讀取吸光度 A1，之后再加入75μ1的R2試劑反應(yīng)5min后，讀取吸光度A2，并計(jì)算Δ A。
[0015] 甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶含量(U/L) = (測定+標(biāo)準(zhǔn)）XC標(biāo)準(zhǔn)。
[0016] 實(shí)施例2 準(zhǔn)確度驗(yàn)證試驗(yàn):將實(shí)施例1的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶檢測試劑作為實(shí)驗(yàn)組，市場 上獲得認(rèn)可的一種準(zhǔn)確度好、穩(wěn)定性好的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶檢測試劑作為對照組 進(jìn)行檢測，對20個(gè)臨床血清樣本進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果如表1所示。獲得了兩種試劑的相關(guān)性 曲線（如圖1所示），結(jié)果表明，兩組試劑盒的相關(guān)系數(shù)為0.9970,說明兩者相關(guān)性比較好。證 明本發(fā)明試劑盒添加及更改的組分對其準(zhǔn)確性不會(huì)造成影響，試劑盒依然保持較好的準(zhǔn)確 度。
[0017] 表1實(shí)施例1試劑與市場認(rèn)可的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶檢測試劑 對比檢測結(jié)果 實(shí)施例3 線性相關(guān)性驗(yàn)證試驗(yàn):選取甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶含量為400U/L的高值樣本，用 生理鹽水進(jìn)行系列稀釋，配制6個(gè)不同濃度的樣本，濃度依次為400U/L、320U/L、240U/L、 1601]凡、801]/1、01]/1。分別利用實(shí)施例1試劑及對照組試劑進(jìn)行檢測，每個(gè)濃度的樣本分別 測定三次，分別取平均值，檢測結(jié)果如表2所示。
[0018] 表2實(shí)施例1試劑線性相關(guān)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果
如上表所示，實(shí)施例1與對照組試劑檢測結(jié)果相關(guān)系數(shù)均大于0.990,且實(shí)施例1試劑檢 測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)略大于對照組試劑檢測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)，這表明本發(fā)明試劑具有更好的 線性相關(guān)性。
[0019] 實(shí)施例4 穩(wěn)定性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn):在2°C~8°C、無腐蝕性氣體的避光環(huán)境中貯存試劑，檢測實(shí)施例1及 對照組試劑的穩(wěn)定性。每月1號分別用兩組試劑測定同一混合血清樣本，測定三次取平均 值，檢測數(shù)據(jù)如表3所示。
[0020] 表3實(shí)施例1試劑穩(wěn)定性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)施例1試劑在2°C~8°C、無腐蝕性氣體的避光環(huán)境中貯存15個(gè)月穩(wěn) 定，而對照組試劑在2°C~8°C、無腐蝕性氣體的避光環(huán)境中貯存12個(gè)月后開始不穩(wěn)定，說明 本發(fā)明試劑添加氯化鈉及甘露醇后穩(wěn)定性增強(qiáng)。
[0021]綜上所述，本發(fā)明提供的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶檢測試劑盒，試劑R1中添加 氯化鈉，同時(shí)試劑R2中添加甘露醇，提高了試劑盒的穩(wěn)定性，線性范圍較好，試劑的準(zhǔn)確度 也較好。因此，本發(fā)明提供的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶檢測試劑盒有利于在市場中進(jìn)一 步的推廣使用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶檢測試劑盒，其特征在于，它包含試劑R1和試劑R2。2. 試劑組成如下：試劑R1組成為：100mmol/L pH8.6 Tris雙甘肽緩沖液、2mmol/L氯化 鈉、10mmol/L疊氮鈉;試劑R2組成為:pH7.5 Goods緩沖液、50mmol/L甘氨酰脯氨酸對硝基苯 胺對甲苯磺酸、2%甘露醇、10mmol/L疊氮鈉。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，使用全自動(dòng)生化分析儀采用速率法進(jìn)行 測定，檢測主波長為405nm〇4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑R1和試劑R2在使用時(shí)的比例為 Rl：R2=225：75〇
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶檢測試劑盒，本試劑盒采用連續(xù)監(jiān)測法檢測血液中的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶，屬于臨床體外檢測試劑技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明試劑盒包括試劑R1和試劑R2。通過將試劑R1中添加氯化鈉，同時(shí)試劑R2中添加甘露醇，提高了試劑盒的穩(wěn)定性，線性范圍較好，試劑的準(zhǔn)確度也較好，有利于在市場中進(jìn)一步的推廣使用。
【IPC分類】G01N33/53, G01N33/68, G01N21/31
【公開號】CN105510572
【申請?zhí)枴緾N201510973109
【發(fā)明人】李敏, 甘宜梧, 譚柏清
【申請人】山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2015年12月22日