微藻蛋白質(zhì)的納米金測(cè)試方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用納米金測(cè)試微藻蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)分析檢測(cè)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，納米金粒子具有制備簡單、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、可實(shí)現(xiàn)重復(fù)，，因此得到了國內(nèi)外廣泛關(guān)注。金納米材料的光學(xué)性質(zhì)與顆粒的形狀和尺寸有非常大的關(guān)系，是研究的最早的金屬納米材料之一。納米金性質(zhì)穩(wěn)定，在紫外一可見光區(qū)出現(xiàn)強(qiáng)而穩(wěn)定的表面等離子體共振吸收峰，最大吸收峰的位置和半峰寬對(duì)粒子形狀、粒子間距離、溶液介電常數(shù)和溫度等因素反應(yīng)敏感，廣泛用于分析識(shí)別檢測(cè)。其中，金納米棒(GNRs)具有兩個(gè)共振峰帶，橫帶約520-600 nm，在近紅外區(qū)域的縱向條帶，通過控制納米棒的縱橫比可精確的調(diào)諧波長。
[0003]目前，納米金為作用基的生物探針研究已經(jīng)很多，由于其具有量子效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng)、表面效應(yīng)、良好的生物相容性和獨(dú)特的光學(xué)性能，能與多種生物大分子結(jié)合如核酸、重金屬離子、特別是蛋白質(zhì)等且不影響其生物活性，具有優(yōu)良的生物相容性。納米金與蛋白質(zhì)的相互結(jié)合，是由于納米金表面帶有較多的電荷，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在PH值等于或稍大于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)呈電中性，此時(shí)蛋白質(zhì)與金納米相互之間的靜電作用較小，但蛋白質(zhì)分子的表面張力卻很大，處于微弱的水化狀態(tài)，較易吸附于納米金顆粒的表面。由于蛋白質(zhì)分子牢固地結(jié)合在金顆粒表面，形成一個(gè)蛋白層，阻止了納米金顆粒的相互接觸，使納米金處于穩(wěn)定狀態(tài)。納米金對(duì)蛋白質(zhì)等生物大分子有很強(qiáng)的吸附作用，并且這種吸附作用不會(huì)使其變性，因此有很好的應(yīng)用前景。
[0004]蛋白質(zhì)作為一種生物大分子，是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是構(gòu)成細(xì)胞的基本有機(jī)物，是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，因此，蛋白質(zhì)的檢測(cè)在臨床醫(yī)學(xué)及生物化學(xué)中具有十分重要的意義。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)分析檢測(cè)方法主要有凱式定氮法、考馬斯亮藍(lán)法、分光光度法、化學(xué)發(fā)光法、近紅外反射光譜法、雙縮脲法等，但這些分析方法大都存在靈敏度較低、選擇性差、穩(wěn)定性弱及操作繁瑣費(fèi)時(shí)等局限。文獻(xiàn)調(diào)查中，我們發(fā)現(xiàn)熒光光譜法是最常用的。幾乎所有的蛋白質(zhì)都有熒光的氨基酸，色氨酸和酪氨酸，當(dāng)熒光色氨酸或酪氨酸與金納米粒子相互作用時(shí)，色氨酸或酪氨酸的熒光特性將會(huì)改變。這些變化可能發(fā)生發(fā)射波長紅移或藍(lán)移，熒光猝滅或增強(qiáng)。這種變化已被用來確定金納米粒子與蛋白質(zhì)定量的結(jié)合親和力和結(jié)合常數(shù)。蛋白質(zhì)與金納米粒子通過靜電引力和疏水作用力等形成締合納米微粒，使得體系中出現(xiàn)特征熒光散射峰，從而使締合納米微粒體系的熒光散射信號(hào)大大增強(qiáng)。眾所周知，在600-1500nm的范圍中，金納米棒有著強(qiáng)烈的等離子體增強(qiáng)效應(yīng)。根據(jù)熒光散射強(qiáng)度和蛋白質(zhì)濃度間存在一定的線性關(guān)系，本發(fā)明以金納米棒與微藻蛋白質(zhì)的生物結(jié)合，研究了金納米棒與微藻蛋白質(zhì)的結(jié)合反應(yīng)，建立了一種簡便、靈敏、穩(wěn)定的微藻蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種新型的微藻蛋白質(zhì)的納米金測(cè)試方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案: 一種新型的微藻蛋白質(zhì)的納米金測(cè)試方法，其特征在于該方法的具體步驟為:
a、在無菌條件下，采用TCA-丙酮結(jié)合法將對(duì)數(shù)生長期(16個(gè)/ml)微藻進(jìn)行蛋白質(zhì)提取，得到含有純微藻蛋白質(zhì)的溶液。
[0006]b、將含有純微藻蛋白的溶液配制成不同梯度濃度的溶液，與所制得的金納米棒進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定不同的熒光強(qiáng)度。
[0007]C、作各個(gè)條件因素對(duì)熒光散射強(qiáng)度的影響及其優(yōu)化的試驗(yàn)，包括(1)、PH值的優(yōu)化:應(yīng)用pH范圍為2.0-5.5的待測(cè)溶液，通過不同pH條件下的焚光散射強(qiáng)度，得到最佳pH條件為4.5; (2)共存物質(zhì)的影響:通過6組不同Na+濃度(0.1-0.6mol/L)下的熒光散射強(qiáng)度，得到最佳無機(jī)鹽離子Na+為0.5mol/L； (3)反應(yīng)穩(wěn)定時(shí)間的優(yōu)化:反應(yīng)時(shí)間在1min以內(nèi)，分別測(cè)定光散射強(qiáng)度，時(shí)間間隔為2min。
【附圖說明】
[0008]圖1為本發(fā)明中不同藻蛋白含量與金納米棒反應(yīng)后的熒光強(qiáng)度變化圖。
[0009]圖2為本發(fā)明中不同pH下藻蛋白與金納米棒反應(yīng)后的熒光強(qiáng)度變化圖。
[0010]圖3為本發(fā)明中不同時(shí)間下的藻蛋白與金納米棒反應(yīng)的熒光強(qiáng)度變化圖。
[0011]圖4為本發(fā)明中不同濃度Na+離子對(duì)藻蛋白溶液與金納米棒結(jié)合的熒光強(qiáng)度變化圖。
【具體實(shí)施方式】
[0012]現(xiàn)將本發(fā)明的具體實(shí)施例敘述如下。
實(shí)施例
[0013]a、實(shí)驗(yàn)所采用藻種為銅綠微囊藻1298號(hào)標(biāo)準(zhǔn)藻種，購自中國科學(xué)院水生生物研究所。采用BG-11培養(yǎng)基，pH=7.1，溫度28 ± I° C，光照時(shí)間16h/d，光照強(qiáng)度為IΟΟμπιοI.m_2.s-1，光源為白熾燈。
[0014]b、待銅綠微囊藻細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期(16個(gè)/ml)，取適量藻液，6000r/min離心獲取藻泥，將藻泥用液氮研磨成粉末，懸浮于四倍體積的_20°C的含10%TCA(三氯乙酸)、2mmol/LDTT的丙酮中，-20°C中沉淀2個(gè)小時(shí)，在9000r/min 4°C離心15min，棄上清液，將沉淀再懸浮于-20°C含2mmol/LDTT的丙酮中，沉淀2個(gè)小時(shí)，9000r/min 4°C離心15min，棄上清液，重復(fù)步驟2、3三次，將沉淀真空冷凍干燥，得粗蛋白質(zhì)，得到微囊藻蛋白質(zhì)溶液。
[0015]C、分別配制含不同濃度的藻蛋白的溶液，在7個(gè)1ml容量瓶中分別加入2ml、
2.5ml、3ml、3.5ml、4ml、4.5ml、5ml藻蛋白溶液，再分別加入5ml的納米金溶液，將蒸餾水補(bǔ)足到10ml，將溶液放在磁力攪拌器上進(jìn)行攪拌，靜置約lOmin。離心一次，除掉未參加反應(yīng)的納米棒和蛋白質(zhì)，待掃描測(cè)量體系的熒光散射強(qiáng)度。
[0016]d、作各個(gè)條件因素對(duì)熒光散射強(qiáng)度的影響及其優(yōu)化的試驗(yàn)
(1)、ρΗ值的優(yōu)化
在含有藻蛋白的測(cè)定液中，應(yīng)用HCl (0.lmol/L)緩沖溶液，分別配制pH范圍為1.0-6.0的待測(cè)溶液，測(cè)定不同PH條件下的熒光散射強(qiáng)度
(2)、共存物質(zhì)的影響在含有藻蛋白的測(cè)定液中，考察研究不同濃度的無機(jī)鹽離子Na+對(duì)納米金探針光散射強(qiáng)度的影響。分別配制了6組不同Na+濃度(0.l-0.6mol/L)，藻蛋白測(cè)定液。
[0017](3)、反應(yīng)穩(wěn)定時(shí)間的優(yōu)化
按照上述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，反應(yīng)時(shí)間在1min以內(nèi)，分別測(cè)定光散射強(qiáng)度，時(shí)間間隔為2min。
[0018]對(duì)實(shí)施例中的試驗(yàn)過程或處理過程的分析和評(píng)價(jià):
不同藻蛋白含量與金納米棒反應(yīng)后的熒光強(qiáng)度變化:隨著體系中蛋白質(zhì)濃度的增加，可以看到熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(見附圖1中1-7)，熒光強(qiáng)度的峰值在560nm處。
[0019]不同pH下藻蛋白與金納米棒反應(yīng)后的熒光強(qiáng)度變化:當(dāng)pH在2.0?4.0之間時(shí)，焚光強(qiáng)度隨著pH的升高逐漸降低；當(dāng)pH從4.0升高至4.5時(shí)，熒光強(qiáng)度突然增加；當(dāng)pH從4.5升到
5.5時(shí)，熒光強(qiáng)度持續(xù)下降直至最低；當(dāng)pH=4.5時(shí)，響應(yīng)最靈敏，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值。
[0020]不同時(shí)間下的藻蛋白與金納米棒反應(yīng)的熒光強(qiáng)度變化:在0_2min內(nèi)，體系的熒光強(qiáng)度相差無幾且達(dá)到最大值，金納米棒與蛋白質(zhì)的結(jié)合程度最高。隨著體系反應(yīng)時(shí)間的不斷增加，從2-12min之間，體系熒光強(qiáng)度逐漸降低，藻蛋白與金納米棒結(jié)合的熒光強(qiáng)度具有相當(dāng)?shù)倪f減效應(yīng)。
[0021 ]不同濃度Na+離子對(duì)藻蛋白溶液與金納米棒結(jié)合的熒光強(qiáng)度變化:當(dāng)Na+的濃度為
0.1-0.3mol/L時(shí)，熒光強(qiáng)度變化不大；當(dāng)Na+的濃度在0.3-0.5mol/L時(shí)，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，且在0.5mol/L時(shí)，響應(yīng)最靈敏。當(dāng)Na+的濃度>0.5mol/L時(shí)，熒光強(qiáng)度大幅度降低。在
0.5mol/L時(shí)，響應(yīng)最靈敏。
[0022]本發(fā)明方法其結(jié)果表明:隨著蛋白質(zhì)濃度的增加，熒光散射的強(qiáng)度增強(qiáng);體系的最適pH值為4.5，無機(jī)鹽離子Na+最佳濃度在0.511101凡，反應(yīng)體系的穩(wěn)定時(shí)間是21]1；[11以內(nèi)，金納米棒與藻類蛋白的結(jié)合之后，可以大大的增強(qiáng)體系的熒光強(qiáng)度，可以更加靈敏、便捷、穩(wěn)定的檢測(cè)藻類蛋白。
[0023]本方法適用于所有含有并可提取蛋白質(zhì)的微藻。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種微藻蛋白質(zhì)的納米金測(cè)試方法，其特征在于該方法的具體步驟為:a在無菌條件下，采用TCA-丙酮結(jié)合法將對(duì)數(shù)生長期(16個(gè)/ml)微藻進(jìn)行蛋白質(zhì)提取，得到含有純微藻蛋白質(zhì)的溶液； b將含有純微藻蛋白的溶液配制成不同梯度濃度的溶液，與所制得的金納米棒進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定不同的熒光強(qiáng)度； c作各個(gè)條件因素對(duì)熒光散射強(qiáng)度的影響及其優(yōu)化的試驗(yàn)，包括(1)、ρΗ值的優(yōu)化:應(yīng)用PH范圍為2.0-5.5的待測(cè)溶液，通過不同pH條件下的熒光散射強(qiáng)度，得到最佳pH條件為.4.5; (2)共存物質(zhì)的影響:通過6組不同Na+濃度(0.1-0.6mo 1/L)下的熒光散射強(qiáng)度，得到最佳無機(jī)鹽離子Na+為0.5mol/L ； (3)反應(yīng)穩(wěn)定時(shí)間的優(yōu)化:反應(yīng)時(shí)間在1min以內(nèi)，分別測(cè)定光散射強(qiáng)度，時(shí)間間隔為2m i η。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用納米金棒測(cè)試微藻蛋白質(zhì)的方法。是蛋白質(zhì)分析檢測(cè)領(lǐng)域。本發(fā)明是通過將藻類蛋白質(zhì)與金納米棒結(jié)合，提高其體系的熒光強(qiáng)度，便于檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)過程證實(shí)：在一定條件下，即銅綠微囊藻生長溫度28℃，達(dá)到對(duì)數(shù)生長期后，從培養(yǎng)液中提取銅綠微囊藻的胞內(nèi)蛋白質(zhì)，配制不同濃度微藻蛋白質(zhì)溶液，測(cè)定其熒光強(qiáng)度，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，不同的pH對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，不同的反應(yīng)時(shí)間中，體系熒光強(qiáng)度的變化，不同Na+離子濃度對(duì)于實(shí)驗(yàn)的影響。結(jié)果表明：隨著蛋白質(zhì)濃度的增加，熒光散射的強(qiáng)度增強(qiáng)；體系的最適pH值為6，無機(jī)鹽離子Na+最佳濃度在0.5mol/L,反應(yīng)體系的穩(wěn)定時(shí)間是2min。本發(fā)明可作為納米金方法測(cè)試藻類蛋白質(zhì)的參考因素。
【IPC分類】G01N21/552, G01N21/49
【公開號(hào)】CN105548086
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510902336
【發(fā)明人】劉書宇, 胡曉慧, 趙月平, 徐敬玲
【申請(qǐng)人】上海大學(xué)
【公開日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2015年12月9日