一種快速檢測t-2毒素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬納米生物傳感以及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是提供一種快速檢測T-2毒素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]T-2毒素主要由三線鐮刀菌等真菌產(chǎn)生的單端孢霉烯族化合物之一，它廣泛分布于自然界，是常見的污染田間作物和庫存谷物的主要毒素，對(duì)人、畜危害大。聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAQ)和世界衛(wèi)生組織(WHO)把這類毒素作為自然存在的最危險(xiǎn)的食品污染源。T-2毒素在室溫條件下非常穩(wěn)定，放置6?7年或加熱至100?120°C1小時(shí)不能破壞其毒性。迄今為止，尚無T-2毒素中毒的特異性防治辦法，唯一有效的預(yù)防辦法是避免接觸或減少接觸。因此，對(duì)T-2毒素的檢測非常必要。
[0003]目前，檢測T-2毒素的方法主要有:色譜法、免疫層析法、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等方法。最近，中國專利CN 105021593 A公開了一種基于足點(diǎn)域和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測定T-2毒素的方法。
[0004]但是，這些方法的各有其缺點(diǎn):如色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，不僅儀器價(jià)格昂貴，且需藥專門技術(shù)人員才能勝任，難于普及;免疫法試劑貴且易于失活;基于足點(diǎn)域和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測定T-2毒素的方法，需要使用價(jià)格昂貴的通過標(biāo)記的DNA等不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供一種快速檢測T-2毒素的方法。
[0006]本發(fā)明采用的技術(shù)方案:一種快速檢測T-2毒素的方法，包括如下步驟:
(A)T-2毒素核酸適體Apt與單鏈信號(hào)探針ssDNA雜交，形成雜交鏈；
(B)將待測樣品溶液加入到該雜交鏈溶液，當(dāng)待測樣品中有T-2毒素時(shí)，雜交鏈選擇性地與T-2毒素反應(yīng)釋放出單鏈信號(hào)探針ssDNA;
(C)消除雜交鏈的干擾，利用DNA擴(kuò)增，使雜交鏈成雙鏈DNA，然后用核酸外切酶，將雙鏈DNA水解成單核苷酸，留下單鏈信號(hào)探針ssDNA;
(D)利用T-2毒素核酸適體-T-2毒素結(jié)合體不能誘導(dǎo)銅離子還原成近紅外熒光的銅納米粒子，只有單鏈信號(hào)探針ssDNA能誘導(dǎo)銅離子還原成近紅外熒光銅納米粒子，在銅離子還原檢測體系中檢測體系熒光強(qiáng)度，從而測定待測樣品中的T-2毒素的含量。
[0007]所述銅離子還原檢測體系包括先后添加的銅離子和使銅離子還原成近紅外熒光銅納米粒子的還原劑維生素C。步驟(D)的檢測，例如包括依次先后向體系中加入銅離子溶液和維生素C溶液，反應(yīng)后生成近紅外熒光銅納米粒子。
[0008]所述T-2毒素核酸適體為
5’-CAGCTCAGAAGCTTGATCCTGTATATCAAGCATCGCGTGTTTACACATGCGAGAGGTGAAGACTCGCA-3，。
[0009]所述可與T-2毒素核酸適體雜交的信號(hào)探針ssDNA為5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCGAGTCTTCACC_3，。
[0010]本發(fā)明的檢測原理如下:先讓Apt與ssDNA雜交(下劃線部分)；當(dāng)有T-2毒素存在時(shí)，雜交鏈與T-2毒素反應(yīng)釋放出ssDNA;體系中存在Apt- ssDNA (剩余的)，Apt_T_2毒素和ssDNAjpt-T-2毒素不能誘導(dǎo)銅離子還原成近紅外熒光銅納米粒子，Apt-T-2毒素存在對(duì)測定無干擾;雜交鏈可能有干擾;為了消除雜交鏈的干擾:a.利用DNA擴(kuò)增，使雜交鏈成雙鏈DNA，b.用核酸外切酶，將雙鏈DNA水解成單核苷酸，除去了雙鏈DNA。此時(shí)體系中只留下可誘導(dǎo)生成近紅外熒光銅納米粒子的ssDNA，通過檢測體系的熒光強(qiáng)度，可以測定T-2毒素的含量。由于消除體系中背景熒光的干擾，提高了檢測的靈敏度和精度。
[0011]本發(fā)明另外提供了一種檢測T-2毒素的試劑盒，其至少包括:T-2毒素核酸適體、可與Τ-2毒素核酸適體雜交的單鏈信號(hào)探針ssDNA、DNA擴(kuò)增體系、外切酶、銅離子還原檢測體系O
[0012]所述T-2 毒素核酸適體為 5 ’ -CAGCTCAGAAGCTTGATCCTGTATATCAAGCATCGCGTGTTTACACATGCGAGAGGTGAAGACTCGCA-3，。
[0013]所述的單鏈信號(hào)探針ssDNA 為 5 ’ _xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxTTTTGCGAGTCTTCACC-3’。
[0014]所述DNA擴(kuò)增體系包括緩沖溶液、三磷酸脫氧單核苷酸混合溶液(dNTP)和Phi29DNA聚合酶。所述緩沖溶液由Tris-HCl、MgCl2和(NH4)2SO4組成。
[0015]所述外切酶為Exo III核酸外切酶。
[0016]所述的銅離子還原檢測體系中還原劑為維生素C。
[0017]本發(fā)明還提供了一種可用于檢測T-2毒素的T-2毒素核酸適體，其堿基序列為5’-CAGCTCAGAAGCTTGATCCTGTATATCAAGCATCGCGTGTTTACACATGCGAGAGGTGAAGACTCGCA-3’。
[0018]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
根據(jù)本發(fā)明的檢測方法和試劑盒，消除了背景熒光的干擾，提高了 T-2毒素的檢測靈敏度和精度。
【附圖說明】
[0019]圖1為ssDNA-銅納米粒子熒光強(qiáng)度與T_2毒素的濃度關(guān)系。
【具體實(shí)施方式】
[0020]實(shí)施例1
本發(fā)明的檢測Τ-2毒素的試劑盒至少包括:Τ-2毒素核酸適體、單鏈信號(hào)探針ssDNA、DNA擴(kuò)增體系、核酸外切酶、銅離子還原檢測體系。所述的T-2毒素核酸適體為5’-CAGCTCAGAAGCTTGATCCTGTATATCAAGCATCGCGTGTTTACACATGCGAGAGGTGAAGACTCGCA-3 ’。所述的單鏈信號(hào)探針 ssDNA為 5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCGAGTCTTCACC-3’。所述的DNA擴(kuò)增體系包括緩沖溶液(Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4)、dNTP和Phi29DNA聚合酶。所述核酸外切酶為Exo III核酸外切酶。
[0021 ] 實(shí)施例2
一種快速檢測T-2毒素的方法，具體操作過程如下:
將各DNA儲(chǔ)備液在95°C下經(jīng)加熱處理5分鐘，使用前，并在室溫下放置30分鐘。然后，分別取含3.0 μ??ο? τ-2毒素核酸適體Apt的雜交緩沖溶液40 μ!^Ρ3.0 μπιο?信號(hào)探針ssDNA的雜交緩沖溶液40 yL置于2ml離心管中，在37°C下雜交I小時(shí)，生成T-2毒素核酸適體-信號(hào)探針雜交物(Apt - ssDNA) ο
[0022]在37°C下，分別依次將濃度為O?50 ng/mL的T-2毒素添加到Apt- ssDNA溶液中，Τ-2毒素與T_2毒素核酸適體反應(yīng)， 生成核酸適體_T_2毒素， 釋放出 ssDNA。 這時(shí) ，體系中有ssDNA、剩余(未反應(yīng)的)Apt- ssDNA和核酸適體-T-2毒素等物質(zhì)。
[0023]加入10 yL緩沖溶液(緩沖溶液組成為50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2,10 mM(NH4)2SO4lPH 7.8 )，然后加入dNTP (10 mM) 18 yL。再向體系中加入2yL Phi29 DNA 聚合酶(10 u/μ?),在37°C下反應(yīng)15分鐘，使得以T-2毒素核酸適體-信號(hào)探針雜交序列(Apt-ssDNA)為摸板擴(kuò)增成雙鏈DNA。在65°C下保持10分鐘使Phi29 DNA去活。
[0024]再向該反應(yīng)體系中加入2yL Exo III核酸外切酶(20 u/yL)，在37°C下反應(yīng)30分鐘，使選擇性地將雙鏈DNA水解成單核苷酸，單鏈探針ssDNA不被切割而保留下來。
[0025]向反應(yīng)液中加入25 yL I mmol硝酸銅和180 yL PBS緩沖液(10 mM，pH7.8)。然后，混合物在室溫下避光或暗室中放置10分鐘后，在快速攪拌下，加入10yL濃度為ImM的新制備的維生素C溶液。然后在45°C下反應(yīng)5?10 min。將溶液轉(zhuǎn)移至微量比色皿，測定體系的熒光強(qiáng)度，進(jìn)行T-2毒素的定量測定，結(jié)果如圖1所示。
[0026]線性范圍0.08 - 25 ng/mL，檢測限0.05 ng/mL，回收率在94.5?112.2%。其它真菌毒素等生物小分子T-2毒素的檢測無干擾。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種快速檢測T-2毒素的方法，其特征是，該方法包括如下步驟: (Α)Τ-2毒素核酸適體Apt與單鏈信號(hào)探針ssDNA雜交，形成雜交鏈； (B)使該雜交鏈與待測樣品作用，當(dāng)待測樣品中有T-2毒素存在時(shí)，雜交鏈選擇性地與T-2毒素反應(yīng)釋放出單鏈信號(hào)探針ssDNA; (C)為了消除雜交鏈的干擾，利用DNA擴(kuò)增，使雜交鏈成雙鏈DNA，然后用外切酶，選擇性地將雙鏈DNA水解成單核苷酸，留下單鏈信號(hào)探針ssDNA ； (D)利用T-2毒素核酸適體-T-2毒素結(jié)合體不能誘導(dǎo)銅離子還原生成近紅外熒光的銅納米粒子，只有單鏈信號(hào)探針ssDNA能夠誘導(dǎo)銅離子還原成近紅外熒光銅納米粒子，檢測體系的熒光強(qiáng)度，從而測定待測樣品中的T-2毒素的含量。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測T-2毒素的方法，其特征是，所述T-2毒素核酸適體為5’-CAGCTCAGAAGCTTGATCCTGTATATCAAGCATCGCGTGTTTACACATGCGAGAGGTGAAGACTCGC-3’。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的快速檢測T-2毒素的方法，其特征是，所述的信號(hào)探針ssDNA為5 ’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCGAGTCTTCACC-3 ’。4.權(quán)利要求1所述的快速檢測T-2毒素的方法，包括檢測T-2毒素的試劑盒，其至少包括:T-2毒素核酸適體、信號(hào)探針ssDNA、DNA擴(kuò)增體系、核酸外切酶、銅離子還原檢測體系。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征是，所述T-2毒素核酸適體為5’-CAGCTCAGAAGCTTGATCCTGTATATCAAGCATCGCGTGTTTACACATGCGAGAGGTGAAGACTCGC-3’。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征是，所述的信號(hào)探針DNA為5’ -TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCGAGTCTTCACC_3’。7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征是，所述DNA擴(kuò)增體系包括緩沖溶液、dNTP和Phi29 DNA聚合酶；所述緩沖溶液由Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4組成。8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征是，所述核酸外切酶為ExoIII核酸外切酶。9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征是，所述的銅離子還原檢測體系中還原劑為維生素C。10.—種可用于檢測T-2毒素的T-2毒素核酸適體，其特征是，其堿基序列為5’-CAGCTCAGAAGCTTGATCCTGTATATCAAGCATCGCGTGTTTACACATGCGAGAGGTGAAGACTCGC-3’。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種快速檢測T-2毒素的方法，該方法包括如下步驟：（A）使T-2毒素核酸適體與單鏈信號(hào)探針DNA雜交，形成雜交鏈；（B）使該雜交鏈與待測樣品接觸，當(dāng)待測樣品中有T-2毒素存在時(shí)，雜交鏈與T-2毒素反應(yīng)釋放出單鏈信號(hào)探針DNA；（C）利用DNA擴(kuò)增，使雜交鏈成雙鏈DNA，然后用外切酶，將雙鏈DNA水解成單核苷酸，此時(shí)體系中留下單鏈信號(hào)探針DNA；（D）在單鏈DNA誘導(dǎo)下，銅離子還原生成近紅外熒光銅納米粒子；檢測體系熒光強(qiáng)度，從而測定待測樣品中的T-2毒素的含量。該方法具有高靈敏度，操作簡單、快速，成本低等特點(diǎn)。
【IPC分類】G01N21/64
【公開號(hào)】CN105548119
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610043520
【發(fā)明人】易守軍, 曾秀顏, 鄧克勤, 黃昊文, 唐春然, 夏曉東
【申請(qǐng)人】湖南科技大學(xué)
【公開日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2016年1月24日