一種檢測(cè)雞肉組織中的地克珠利的熒光分析法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]一種檢測(cè)地克珠利的試劑盒及其檢測(cè)方法，屬于時(shí)間分辨熒光免疫分析(TRFIA)技術(shù)領(lǐng)域，用于雞肉組織樣品中地克珠利的含量檢測(cè)。
【背景技術(shù)】
[0002]地克珠利(Diclazuril)屬三嗪苯乙腈化合物，為類白色或淡黃色粉末，在二甲基甲酰胺中略溶，在四氫呋喃中微溶，在水、乙醇中幾乎不溶。地克珠利是一種高效、低毒的廣譜驅(qū)球蟲藥，對(duì)雞、火雞、鴨、鵝、孔雀、鵪鶉、兔等各種球蟲具有良好的防治效果，每噸飼料添加lg，能有效地控制球蟲病的爆發(fā)。雞球蟲是養(yǎng)禽業(yè)的常見(jiàn)寄生蟲，給養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。目前預(yù)防雞球蟲病的主要手段是實(shí)用抗球蟲藥進(jìn)行化學(xué)防治和疫苗接種，長(zhǎng)期藥物預(yù)防一直是雞球蟲病防治的有效手段，其用藥量大，約占各種藥物添加劑總量的1/4。地克珠利是主要使用的抗球蟲藥物之一，國(guó)內(nèi)實(shí)用也較為混亂。
[0003]隨著藥物在食品動(dòng)物中的廣泛應(yīng)用，其殘留問(wèn)題已引起了廣泛的關(guān)注。藥物殘留不僅因其毒副作用對(duì)人造成直接危害，更嚴(yán)重的問(wèn)題是食品動(dòng)物中殘留低濃度的藥物容易又到人類致病菌產(chǎn)生耐藥性，從而不利于藥物在人醫(yī)臨床的應(yīng)用。因?yàn)殚_(kāi)展地克珠利的殘留研究十分必要。
[0004]目前有關(guān)動(dòng)物源性食品中地克珠利及其代謝物的測(cè)定方法主要為高效液相色譜法測(cè)定雞肉中的地克珠利殘留量，檢出限為0.01 ug/kg。但這些方法儀器設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜，靈敏度低，且不適用于大批量樣品的檢測(cè)，無(wú)法滿足國(guó)內(nèi)食品安全檢測(cè)市場(chǎng)的迫切需要。而時(shí)間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)由于其特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、廉價(jià)，且特別適于大批量樣品的檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)而越來(lái)越被人們所重視和采用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)地克珠利的試劑盒及其檢測(cè)方法，用于水產(chǎn)品樣品中地克珠利含量的檢測(cè)。本發(fā)明主要采用時(shí)間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)檢測(cè)地克珠利。技術(shù)方案:該檢測(cè)地克珠利的試劑盒是由:(1)96或48孔包被板；(2)緩沖液；(3)地克珠利標(biāo)準(zhǔn)；(4)地克珠利的抗體凍干品；(5)銪標(biāo)記的羊抗鼠抗體；(6)洗滌液；(7)增強(qiáng)液所組成。
[0006]本發(fā)明測(cè)定方法:測(cè)定的基礎(chǔ)是標(biāo)記免疫反應(yīng)。包被有地克珠利-OVA的微孔板，加入地克珠利標(biāo)準(zhǔn)或已處理好的樣品到各自的微孔中，再加入地克珠利抗體，振蕩反應(yīng)，游離的地克珠利與微孔板上的地克珠利-OVA競(jìng)爭(zhēng)地克珠利抗體，洗滌液洗滌，沒(méi)有連接的地克珠利抗體在洗滌步驟中被除去。加入Eu3 + -羊抗鼠抗體，進(jìn)行標(biāo)記免疫反應(yīng)，再用洗滌液洗滌，反應(yīng)后沒(méi)有連接的Eu3 + -羊抗鼠抗體在洗滌步驟中被除去。加增強(qiáng)液振蕩后，在紫外光的激發(fā)下發(fā)射很強(qiáng)的熒光，用時(shí)間分辨熒光儀測(cè)定其熒光強(qiáng)度cps，熒光強(qiáng)度與樣品中的濃度成反比，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定樣品中抗原的量。
【附圖說(shuō)明】
[0007]圖1地克珠利-TRFIA反應(yīng)示意圖。
[0008]圖2地克珠利-TRFIA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0009]圖3檢測(cè)地克珠利的試劑盒示意圖:(1)96或48孔包被板，⑵緩沖液，(3)地克珠利標(biāo)準(zhǔn)，(4))地克珠利的抗體凍干品，(5)銪標(biāo)記的羊抗鼠抗體，(6)洗滌液，(7)增強(qiáng)液。
具體實(shí)施方案
[0010]實(shí)施例1
按下列步驟制備試劑盒和檢測(cè)雞肉組織樣品:
(I)Eu3 + -羊抗鼠抗體的制備:
取溶解于50mmol/LPBS pH7.0的5g/L羊抗鼠抗體1.2ml，經(jīng)TO-10柱轉(zhuǎn)換緩沖條件，洗脫液為含0.155mol/LNaCl的50mmol/LNa2C03-NaHC03pH8.5緩沖液。收集蛋白峰，經(jīng)紫外吸收分析定量(1.46A280-0.74A260)，用上述洗脫液稀釋羊抗鼠抗體至2g/L。取500-1000 μ I稀釋后的羊抗鼠抗體加入含0.2-0.4mg的Eu3 + -N2_[p-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3 + -DTTA)的小瓶中，30°C磁力攪拌反應(yīng)20小時(shí)。反應(yīng)液經(jīng)用80mmol/L Tris-HCl ρΗ7.8緩沖液平衡的S印harose CL-6B柱(I X 40cm)層析，A280監(jiān)測(cè)收集蛋白峰，稀釋分裝備用。
[0011](2)包被板固相抗原制備:
將地克珠利-OVA用50mmol/L Na2C03-NaHC03 pH9.6緩沖液稀釋至5mg/L的包被液，96 (或48)孔微孔板各孔加100μ 1，4°C放置過(guò)夜。棄去包被液，沖洗兩次，加150μ I含3g/LBSA的上述緩沖液封閉，4°C放置過(guò)夜。棄去封閉液，真空抽干，板條密封后置_20°C冷凍保存。
[0012](3)試劑的配制:
A.標(biāo)準(zhǔn)地克珠利:(Ong/ml,0.025ng/ml,0.05ng/ml,0.lng/ml,0.3ng/ml,0.6ng/ml),從地克珠利純品中稀釋得到，稀釋液為甲醇:水=7: 3 ；
B.緩沖液:8mmol/LNaCl、0.1 % BSA、0.2 % 牛 IgG、50 μ mol/L 二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、0.lml/LTween-80 和 0.1% NaN3 的 Tris-HCl ρΗ7.8 ；
C.洗滌液:14.5mmol/L NaCl.0.2ml/LTween_80 和 0.2% NaN3 的 50mmol/L Tris-HClρΗ7.8 ；
D.增強(qiáng)液的配制:1升pH3.2鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液含15 μ mol β -萘甲酰三氟丙酮(β -ΝΤΑ), 50 μ mo I 三正辛基氧化膦(Τ0Ρ0)，Iml 曲拉通 X-100 (Triton X-100)。
[0013](4)試劑盒提供的試劑:
每一個(gè)盒中的試劑足夠進(jìn)行96個(gè)測(cè)量，盒中的材料如下:
A.1X96孔板(8條X 12孔，可以拆分為單孔)包被有地克珠利-OVA ；
B.6 X地克珠利標(biāo)準(zhǔn)液，1.0ml/瓶，標(biāo)準(zhǔn)液濃度為:(0ng/ml，0.025ng/ml，0.05ng/ml,
0.lng/ml,0.3ng/ml,0.6ng/ml)；
C.1X地克珠利抗體凍干品，用時(shí)0.5ml蒸餾水溶解；
D.1XEu3 + -羊抗鼠抗體凍干品，用時(shí)0.5ml蒸餾水溶解； E.1X 增強(qiáng)液:15ml ；
F.1X洗滌液:30ml，用時(shí)以蒸餾水1: 25稀釋；
G.1X 緩沖液:30mlο
[0014](5)測(cè)定之前注意事項(xiàng):
A.使用之前將所有試劑回升至室溫(18-30°C)；
B.使用之后立即將所有試劑放回2-8°C；
C.如果樣品量大建議使用多通道移液器；
D.在所有恒溫孵育過(guò)程中，避免光線照射，用蓋子蓋住微孔；
E.取出需用數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放進(jìn)原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封，保存于2-8°C。
[0015](6)具體檢測(cè)步驟如下:
取地克珠利-OVA板條，加入50 μ I的地克珠利標(biāo)準(zhǔn)或處理好的樣品到各自的微孔中，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)和樣品必須使用新的吸頭，加緩沖液1: 5000稀釋的地克珠利抗體50 μ 1，移液器管尖千萬(wàn)不要接觸到放進(jìn)孔中的液體，37 °C振蕩I小時(shí)，洗滌液洗四次，加緩沖液I: 400稀釋的Eu3+ -羊抗鼠抗體100 μ 1，37°C振蕩45分鐘，用洗滌液洗六次，加200 μ I增強(qiáng)液振蕩5分鐘后測(cè)量。從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的地克珠利含量，和圖2，該例的樣品濃度 0.15ng/ml。
[0016]實(shí)施例2
按下列步驟制備試劑盒和檢測(cè)豬肉樣品:
(1)制備試劑盒同實(shí)施例1的(1Γ(5)；
(2)具體檢測(cè)步驟如下:
稱取2.0 土 0.05 g均質(zhì)后的組織樣品，加入8 mL 3%三氯乙酸溶液，渦旋5 min，室溫4000 r/min離心10 min ;取出2 mL上清液至另一個(gè)離心管中，用I M NaOH調(diào)pH值至7.0~7.5之間。取調(diào)pH值后的液體用樣本復(fù)溶液1:4卿100 mL樣本液加400 mL樣本復(fù)溶液)稀釋，混勻30 s ;取50 mL用于檢測(cè)分析。
[0017]取地克珠利-OVA板條，加入50 μ I的地克珠利標(biāo)準(zhǔn)或處理好的樣品到各自的微孔中，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)和樣品必須使用新的吸頭，加緩沖液1: 5000稀釋的地克珠利抗體50 μ 1，移液器管尖千萬(wàn)不要接觸到放進(jìn)孔中的液體，37 °C振蕩I小時(shí)，洗滌液洗四次，加緩沖液I: 400稀釋的Eu3 + -羊抗鼠抗體100μ 1，37°C振蕩45分鐘，用洗滌液洗4次，加200μ1增強(qiáng)液振蕩5分鐘后測(cè)量。從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的地克珠利含量，如圖2為地克珠利標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種檢測(cè)地克珠利的時(shí)間分辨熒光免疫分析法試劑盒，其特征是:(1)96或48孔包被板；(2)緩沖液；(3)地克珠利標(biāo)準(zhǔn)；(4)地克珠利的抗體凍干品；(5)銪標(biāo)記的羊抗鼠抗體;(6)洗滌液；(7)增強(qiáng)液所組成。2.一種用權(quán)利要求1所述的試劑盒地克珠利的方法，其特征是取包被有地克珠利-OVA的微孔包被板，加入地克珠利標(biāo)準(zhǔn)或處理好的樣品到各自的微孔中，再加入地克珠利抗體，振蕩反應(yīng)，洗滌液洗滌，加銪標(biāo)記的羊抗鼠抗體，進(jìn)行標(biāo)記免疫反應(yīng)，洗滌液洗滌，加增強(qiáng)液振蕩后測(cè)量熒光強(qiáng)度cps，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的地克珠利含量。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)地克珠利的方法，其操作為:取包被有地克珠利-OVA的微孔包被板，加入50yL的地克珠利標(biāo)準(zhǔn)或處理好的樣品到各自的微孔中，加50μ I以緩沖液(2)稀釋的地克珠利抗體，25°C振蕩I小時(shí)，洗滌液洗三次，加以緩沖液(2)稀釋的.100 μ L Eu3 + -羊抗鼠抗體，25°C振蕩0.5小時(shí)，用洗滌液洗六次，加200 μ I增強(qiáng)液振蕩5分鐘后測(cè)量熒光強(qiáng)度cps，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的地克珠利含量。
【專利摘要】一種檢測(cè)地克珠利的試劑盒及其檢測(cè)方法，屬于時(shí)間分辨熒光免疫分析（TRFIR）技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明配制的試劑盒，采用TRFIR檢測(cè)地克珠利，測(cè)定的基礎(chǔ)是標(biāo)記免疫反應(yīng)。微孔板包被有地克珠利－OVA，加入地克珠利標(biāo)準(zhǔn)或樣品，再加入地克珠利抗體。游離的地克珠利與微孔板上的地克珠利－OVA競(jìng)爭(zhēng)地克珠利抗體，沒(méi)有連接的地克珠利抗體被洗滌除去，加入Eu3＋－羊抗鼠抗體，標(biāo)記免疫反應(yīng)后沒(méi)有連接的Eu3＋－羊抗鼠抗體被洗滌除去。加增強(qiáng)液后，用時(shí)間分辨熒光儀測(cè)定其熒光強(qiáng)度cps，熒光強(qiáng)度與樣品中的地克珠利濃度成反比，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定被測(cè)樣品中地克珠利的含量。本發(fā)明提供的檢測(cè)地克珠利試劑盒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，使用方便、廉價(jià)、靈敏度高，操作時(shí)間大幅度減少；可用作檢測(cè)雞肉組織中地克珠利殘留檢測(cè)。
【IPC分類】G01N33/543, G01N21/64
【公開(kāi)號(hào)】CN105572083
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410550537
【發(fā)明人】洪霞, 江振飛, 劉靜
【申請(qǐng)人】南京億特生物科技有限公司
【公開(kāi)日】2016年5月11日
【申請(qǐng)日】2014年10月17日