聚乙二醇6000、甘油、明膠按照表1的組方 配制成抗原保護(hù)劑，以最佳優(yōu)化條件包被衣原體Μ0ΜΡ蛋白酶標(biāo)板，封閉、洗滌后分別加入 200yL/孔的抗原穩(wěn)定劑(處方1、處方2、處方3、處方4、roS對(duì)照組），4°C過夜，次日取出棄去 孔內(nèi)液體，加入PBST溶液300yL/孔，洗滌3次，每次3min，并用吸水紙拍干，紫外線照射2h，晾 干后裝入避光袋中，置于37°C環(huán)境連續(xù)保存7d，每天取出4孔置于4°C環(huán)境。第12天取出所有 酶標(biāo)板，并取出_20°C保存的酶標(biāo)板(_20°C對(duì)照組），按照確定的ELISA程序檢測(cè)陽性對(duì)照 品，重復(fù)4孔，計(jì)算其平均值，比較其0D450'的下降情況。選擇與-20°C保存PBS組為對(duì)照組。 [0092]表1包被穩(wěn)定劑的組方
[0094] 表2不同包被穩(wěn)定劑在37 °C下的測(cè)定0D值

[0096] 結(jié)果顯示包被抗原保護(hù)液組-處方4組的0D450值幾乎沒有下降，與-20°C對(duì)照組相 一致，而處方2組穩(wěn)定劑和PBS組保存第4天后0D' 450值在開始明顯下降，下降趨勢(shì)比較顯 著。處方3抗體測(cè)定的0D值下降比較緩慢，第12天其0D值低于1.0。因此選擇包被處方4為抗 原保護(hù)劑，篩選的抗原保護(hù)處方組成為l〇〇ml中含:2%β-1，3/1,6葡聚糖、20%甘油、0.01 % 明膠。
[0097] 實(shí)施例3包被有鸚鵡熱衣原體重組蛋白Μ0ΜΡ的酶標(biāo)板的制備
[0098] 1、以鸚鵡熱衣原體6BC株總DNA為模板，使用特異性引物M0MP-F和M0MP-R進(jìn)行擴(kuò) 增，得到1143bp的目的片段，核苷酸序列如SEQIDN0.2所示；
[0099] M0MP-F：AAAGAATTCTTGCCTGTAGGGAACCC；
[0100] M0MP-R：GGGGTCGACTTAGAATCTGAATTGAG；
[0101] 2、將擴(kuò)增所得片段回收純化后用EcoRlI和Sail雙酶切回收純化目的片段；
[0102] 3、將酶切好的目的片段與用相同酶切的PET28a( + )載體連接獲得重組表達(dá)質(zhì)粒；
[0103] 4、將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)內(nèi)，37°C培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；
[0104] 5、將菌液離心收集沉淀，將沉淀重溶于PBS，pH7.2溶液中經(jīng)過超聲裂解處理后離 心取沉淀；
[0105] 6、重復(fù)第5步，獲得的沉淀為重組蛋白包涵體；
[0106] 7、將步驟6的沉淀經(jīng)尿素溶解、透析復(fù)性后，與Ni-NTA瓊脂糖凝膠混勻，低溫結(jié)合；
[0107] 8、將結(jié)合完畢后的蛋白與Ni-NTA瓊脂糖混合物，倒入空Ni-NTA柱，以20mmol/L咪 唑溶液洗滌，除去雜蛋白；
[0108] 9、以250mmol/L的咪唑溶液洗脫Ni-NTA柱，收集經(jīng)SDS-PAGE分析達(dá)到95%以上純 化程度的重組蛋白Μ0ΜΡ洗脫液；
[0109] 10、將收集的蛋白洗脫液體裝入透析袋中，在20倍體積的PBS溶液中透析去除咪 唑，冷凍抽干獲得干粉重組蛋白Μ0ΜΡ;
[0110] 11、將重組蛋白干粉以pH9.6、50mM碳酸鹽緩沖液稀釋為終濃度0.5yg/mL，加入酶 標(biāo)板各孔，4°C孵育16小時(shí)，用洗滌緩沖液PBST沖洗酶標(biāo)板，再用封閉液(含5%脫脂奶粉的 PBST溶液)封閉，以封閉液200yL/孔封閉，37°C溫育2小時(shí)，倒掉封閉液，PBST洗滌3次甩干以 封閉液200yL/孔封閉，37°C溫育2小時(shí)，倒掉封閉液，PBST洗滌3次甩干以封閉液200yL/孔封 閉，37°C溫育2小時(shí)，倒掉封閉液，PBST洗滌3次甩干倒掉封閉液，洗滌，甩干； 12、封閉好的微孔板每孔加入200微升的抗原保護(hù)劑，pH7.2溶液37度孵育4小時(shí) 后，倒掉抗原保護(hù)溶液，洗滌，甩干，晾干，即獲得包被有鸚鵡熱衣原體重組蛋白Μ0ΜΡ的酶標(biāo) 板。
[0112] 實(shí)施例4禽鸚鵡熱衣原體陽性對(duì)照血清的制備
[0113] 1、取鸚鵡熱衣原體6BC株種子液，以2SP溶液作1:200稀釋，經(jīng)卵黃膜接種方式接種 7日齡SPF雞胚，每個(gè)胚接種200yL衣原體種子稀釋液，置于孵化器中繼續(xù)孵化。棄去3日內(nèi)死 亡的禽胚，挑選接種后3~8日死亡的禽胚，無菌收獲胚體和卵黃膜，以0.01m 〇l/L pH7.2預(yù) 冷PBS溶液充分洗滌胚體和卵黃膜，取少量卵黃膜以Μ0ΜΡ特異引物進(jìn)行PCR鑒定，將鑒定正 確的剩余組織加入適量2SP溶液充分勻漿，置于離心管中，4°C3000rpm離心15min，收集上 清，加入4 %甲醛4 °C滅活16h。取滅活前、后的菌液接種細(xì)胞，培養(yǎng)36h，以衣原體熒光抗體試 劑盒鑒定是否有衣原體生長(zhǎng)。收集滅活成功的菌體，小量分裝，-80°C保存?zhèn)溆?，即為鸚鵡熱 衣原體抗原。
[0114] 2、將衣原體抗原以2SP溶液1:10稀釋后，應(yīng)用分光光度法測(cè)定衣原體抗原濃度并 用2SP溶液稀釋至蛋白濃度為2mg/mL。選擇8周齡SPF雞，采血、分離血清，經(jīng)衣原體IHA試劑 盒檢測(cè)，選擇衣原體抗體為陰性禽2只，進(jìn)行免疫。
[0115] 3、首免:將氟氏完全佐劑與衣原體抗原等量混合，充分乳化，取lmL頸部皮下多點(diǎn) 注射。
[0116] 4、二免:首免后第14天，取氟氏不完全佐劑與衣原體抗原等量混合，充分乳化，取 lmL頸部皮下多點(diǎn)注射。
[0117] 5、三免:二免后第7天，同二免方法加強(qiáng)免疫一次。
[0118] 6、加強(qiáng)免疫:三免后第7天，肌肉和頸部皮下各注射衣原體抗原lmL。
[0119] 7、血清抗體效價(jià)檢測(cè)：加強(qiáng)免疫7天后翅靜脈各采血300yL，至無菌微量離心管中， 于37°C靜置2小時(shí)，然后4°C過夜。次日8000g離心2分鐘，分離血清。經(jīng)衣原體IHA試劑盒測(cè)定 血清抗體效價(jià)，選取效價(jià)2 1: 256的SPF雞，進(jìn)行心臟采血，無菌分離血清，56°C水浴滅活 30min，即獲得禽鸚鵡熱衣原體陽性對(duì)照血清。
[0120] 實(shí)施例5禽鸚鵡熱衣原體陰性對(duì)照血清的制備
[0121] 1、取2只SPF雞，分別采血、分離血清，56°C水浴滅活30min，
[0122] 2、經(jīng)過衣原體間接血凝（IHA)試劑盒檢測(cè)，選取效價(jià)< 1:4的SPF雞，進(jìn)行心臟采 血，無菌分離血清，56 °C水浴滅活30min混合，小量分裝，即為衣原體陰性血清，-20 °C保存?zhèn)?用。
[0123] 實(shí)施例6禽鸚鵡熱衣原體病酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒
[0124] 1、各種試劑溶液的配制：
[0125] 1)包被緩沖液為pH9.6、50mM碳酸鹽緩沖液(CB);
[0126] 2)封閉液為含5 %脫脂奶粉的PBST溶液；
[0127] 3)洗滌緩沖液為含0.5%。吐溫-20、pH7.2的磷酸鹽緩沖液(PBST);
[0128] 4)樣本稀釋緩沖溶液為含有1%小牛血清、0.3%Triton-100、0.1%〇硫柳汞鈉的pH 7.2的磷酸鹽緩沖液
[0129] 5)酶標(biāo)抗體稀釋溶液為含有1.0 %牛血清白蛋白、0.1%。硫柳汞鈉、5 %甘油、5 %海 藻糖的PH7.2的磷酸鹽緩沖液；
[0130] 6)顯色劑A為含1.46 %磷酸氫二鈉，0.93 %檸檬酸，0.045 %過氧化氫的水溶液。
[0131] 7)顯色劑B為含0.03%四甲基聯(lián)苯胺，0.096%檸檬酸，0.019%乙二胺四乙二酸鈉 鹽，2 % DMS0，4 %甘油的水溶液。
[0132] 實(shí)施例7禽鸚鵡熱衣原體病酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用
[0133] 禽鸚鵡熱衣原體病酶聯(lián)免疫抗體檢測(cè)法的具體實(shí)施步驟如下：
[0134] 1)包被:用包被緩沖液將鸚鵡熱衣原體重組蛋白Μ0ΜΡ稀釋成終濃度0.5yg/mL，100 μ!7孔包被于NUNC公司生產(chǎn)的96孔酶標(biāo)板上，4 °C溫育16小時(shí)。倒掉酶標(biāo)板內(nèi)液體，PBST洗滌 3次，甩干。
[0135] 2)封閉：以封閉液200yL/孔封閉，37°C溫育2小時(shí)，倒掉封閉液，PBST洗滌3次甩干。
[0136] 3)保護(hù):加入抗原保護(hù)劑，pH7.2溶液37°C孵育4小時(shí)后，倒掉抗原保護(hù)劑，洗滌，甩 干，晾干，即獲得包被有鸚鵡熱衣原體重組蛋白MOMP的酶標(biāo)板。
[0137] 4)樣品稀釋:用樣本稀釋緩沖溶液將待測(cè)血清、陰性和陽性對(duì)照血清1:100稀釋。
[0138] 5)加樣：以100μL孔待測(cè)樣品加入封閉后的酶標(biāo)板孔中，同時(shí)以100μL孔設(shè)復(fù)孔 陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，37°C溫育30分鐘。PBST沖洗5次，甩干。
[0139] 6)加酶標(biāo)抗體:用酶表抗體緩沖液將酶標(biāo)抗體稀釋成1:40000的酶工作液，每孔加 入100yL，37°C溫育30分鐘。PBST沖洗5次，甩干。
[0140] 7)顯色:每孔先后加入顯色劑A、B 50yL，37°C避光溫育10分鐘。
[0141] 8)終止:每孔加入100yL終止液。
[0142] 9)檢測(cè)：于酶標(biāo)儀上雙波長(zhǎng)檢測(cè)450nm/630nm吸收值。
[0143] 實(shí)施例8禽鸚鵡熱衣原體病酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的靈敏性和特異性
[0144] 1、靈敏性檢