一種快速檢測黃曲霉毒素b1的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及納米生物傳感以及生物檢測領(lǐng)域，具體地說，是提供一種快速檢測黃曲霉毒素BI的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]黃曲霉毒素是黃曲霉、寄生曲霉等產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，其中黃曲霉毒素BI是已知的化學(xué)物質(zhì)中致癌性最強的一種，對人畜危害極大。當人攝入含黃曲霉毒素BI污染的食物，可發(fā)生急性肝炎、出血性壞死等急性中毒，甚至死亡；當微量持續(xù)攝入，可造成慢性中毒，生長障礙，致癌、致畸等。然而，黃曲霉毒素在食品中幾乎不可避免，為了保證人民身體健康和生命安全，我國食品衛(wèi)生標準中規(guī)定:玉米、花生油、花生及其制品中黃曲霉毒素不得>20yg /kg;大米、其它食用油不得>10yg / kg;其它糧食、豆類、發(fā)酵食品不得>5yg / kg;嬰兒代乳食品不得檢出黃曲霉毒素。歐盟等國于2002年對糧食，花生及其產(chǎn)品中的黃曲霉毒素BI含量規(guī)定，人類直接使用的花生中黃曲霉毒素BI含量需<2yg/kg，作為食品原料進口的花生黃曲霉毒素BI含量需< 8yg/kg。人們?nèi)羰称分悬S曲霉毒素含量超出一定標準，就會直接威脅到人的健康。因此，建立高選擇性、高靈敏的黃曲霉毒素BI的檢測方法非常有價值。
[0003]目前國內(nèi)外研究主要有薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、免疫親和柱法以及酶聯(lián)免疫法等。TLC法的特異性較差，靈敏度也相對較差，所需標準品濃度較高，潛在的污染性較高。HPLC法需要具有專門操作技術(shù)的人員才能進行檢測，技術(shù)要求高；凈化柱消耗較多，檢測成本較高，免疫親和柱特異性較好，但仍然需要專門技術(shù)人員才能勝任檢測工作，檢測技術(shù)要求高。免疫法具有操作簡便、快捷、污染較小、靈敏度也較高等許多優(yōu)勢，但通常需要用到價格昂貴的酶標試劑、酶、抗原、抗體等生物試劑，而且這些生物試劑也很易失活。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種快速檢測黃曲霉毒素BI的方法。
[0005]本發(fā)明采用的技術(shù)方案:一種快速檢測黃曲霉毒素BI的方法，包括如下步驟:
(A)黃曲霉毒素BI核酸適體Apt與單鏈信號探針ssDNA雜交，形成雜交鏈；
(B)將待測樣品溶液加入到該雜交鏈溶液，當待測樣品中有黃曲霉毒素BI時，雜交鏈選擇性地與黃曲霉毒素BI反應(yīng)釋放出單鏈信號探針ssDNA;
(C)消除雜交鏈的干擾，利用DNA擴增，使雜交鏈成雙鏈DNA，然后用核酸外切酶，將雙鏈DNA水解成單核苷酸而除去雙鏈DNA，留下單鏈信號探針ssDNA ；
(D)利用黃曲霉毒素BI核酸適體-黃曲霉毒素結(jié)合體不能誘導(dǎo)銅離子還原成近紅外熒光的銅納米粒子，只有單鏈信號探針ssDNA能誘導(dǎo)銅離子還原成近紅外熒光銅納米粒子，在銅離子還原檢測體系中檢測體系熒光強度，從而測定待測樣品中的黃曲霉毒素BI的含量。
[0006]所述銅離子還原檢測體系包括先后添加的銅離子和使銅離子還原成近紅外熒光銅納米粒子的維生素C還原劑。步驟(D)的檢測，例如包括依次先后向體系中加入銅離子溶液和維生素C溶液，反應(yīng)后生成近紅外熒光銅納米粒子。
[0007]所述黃曲霉毒素BI 核酸適體為 5 ’ -GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3，。
[0008]所述的單鏈信號探針ssDNA 為 5 ’ _xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxGTGGGCCTAGCG-3，。
[0009]本發(fā)明的檢測原理如下:先讓Apt與ssDNA雜交；當有黃曲霉毒素BI存在時，雜交鏈與黃曲霉毒素BI反應(yīng)釋放出ssDNA;體系中存在Apt- ssDNA (剩余的)，Apt_黃曲霉毒素BI和ssDNA ^pt-黃曲霉毒素BI不能誘導(dǎo)銅離子還原成近紅外熒光銅納米粒子，Apt-黃曲霉毒素BI存在對測定無干擾;雜交鏈可能有干擾;為了消除雜交鏈的干擾:a.利用DNA擴增，使雜交鏈成雙鏈DNA，b.用核酸外切酶，將雙鏈DNA水解成單核苷酸而除去雙鏈DNA。此時體系中只留下可誘導(dǎo)生成近紅外熒光銅納米粒子的ssDNA，通過檢測體系的熒光強度，可以測定黃曲霉毒素BI的含量。由于消除體系中背景熒光的干擾，提高了檢測的靈敏度和精度。
[0010]本發(fā)明還提供了一種檢測黃曲霉毒素BI的試劑盒，其至少包括:黃曲霉毒素BI核酸適體、單鏈信號探針ssDNA、DNA擴增體系、外切酶、銅離子還原檢測體系。
[0011 ]所述黃曲霉毒素 BI 核酸適體為 5 ’ -GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3，。
[0012]所述的單鏈信號探針ssDNA 為 5 ’ _xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxGTGGGCCTAGCG-3，。
[0013]所述DNA擴增體系包括緩沖溶液、三磷酸脫氧單核苷酸混合溶液dNTP和Phi29DNA聚合酶；所述緩沖溶液由Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4組成。
[0014]所述外切酶為Exo III核酸外切酶。
[0015]所述的銅離子還原檢測體系中還原劑為維生素C。
[0016]本發(fā)明還提供了一種可用于檢測黃曲霉毒素BI的黃曲霉毒素BI核酸適體，其堿基序列為5 ’ -GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3 ’。
[0017]本發(fā)明的優(yōu)點
根據(jù)本發(fā)明的檢測方法和試劑盒，消除了背景熒光的干擾，提高了黃曲霉毒素BI的檢測靈敏度和精度。
【附圖說明】
[0018]圖1為ssDNA_銅納米粒子熒光強度與黃曲霉毒素BI的濃度關(guān)系。
【具體實施方式】
[0019]實施例1
一種快速檢測黃曲霉毒素BI的試劑盒至少包括:黃曲霉毒素BI核酸適體、單鏈信號探針s sDNA、DNA擴增體系、核酸外切酶、銅離子還原檢測體系。所述的黃曲霉毒素BI核酸適體為5 ’ -GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3 ’。所述的單鏈信號探針ssDNA為5’ -TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGGGCCTAGCG-3 ’。所述的DNA擴增體系包括緩沖溶液、dNTP和Phi29 DNA聚合酶。所的述核酸外切酶為Exo III核酸外切酶。所述的銅離子還原檢測體系中的還原劑為維生素C。所述緩沖溶液由Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2S04組成。
[0020]實施例2
一種快速檢測黃曲霉毒素BI的方法，具體操作過程如下:
將各DNA儲備液在95°C下經(jīng)加熱處理5分鐘，使用前，并在室溫下放置30分鐘。然后，分別取含3.0 μπιο?黃曲霉毒素BI核酸適體Apt的雜交緩沖溶液40 μ!^Ρ3.0 μπιο?信號探針ssDNA的雜交緩沖溶液40 yL置于2ml離心管中，在37°C下雜交I小時，生成黃曲霉毒素BI核酸適體-信號探針雜交物(Apt - ssDNA) ο
[0021]在37°C下，分別依次將濃度為O?2 ng/mL的黃曲霉毒素BI添加到Apt- ssDNA溶液中，黃曲霉毒素BI與黃曲霉毒素BI核酸適體反應(yīng)，生成核酸適體-黃曲霉毒素BI，釋放出ssDNA。這時，體系中有ssDNA、剩余(未反應(yīng)的)APT- ssDNA和核酸適體-黃曲霉毒素BI等物質(zhì)。
[0022]加入10 yL緩沖溶液(緩沖溶液組成為50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2,10 mM(NH4)2SO4lPH 7.8 )，然后加入dNTP (10 mM) 18 yL。再向體系中加入2yL Phi29 DNA 聚合酶(10 u/μ?),在37°C下反應(yīng)15分鐘，使得以黃曲霉毒素BI核酸適體-信號探針雜交序列(Ap-ssDNA)為摸板擴增成雙鏈DNA。在65°C下保持10分鐘使Phi29 DNA去活。
[0023]再向該反應(yīng)體系中加入2yL Exo III核酸外切酶(20 u/yL)，在37°C下反應(yīng)30分鐘，使選擇性地將雙鏈DNA水解成單核苷酸而除去，單鏈探針ssDNA因反應(yīng)速度極慢不水解而保留下來。
[0024]向反應(yīng)液中加入25 yL I mmol硝酸銅和200 yL PBS緩沖液(10 mM，pH7.8)。然后，混合物在室溫下避光或暗室中放置10分鐘后，在快速攪拌下，加入10yL濃度為I mM的新制備的維生素C溶液。然后在45°C下反應(yīng)5?10 min。將溶液轉(zhuǎn)移至微量比色皿，測定體系的熒光強度，進行黃曲霉毒素BI的定量測定，結(jié)果如圖1所示。
[0025]線性范圍0.01- 15 ng/mL，檢測限5 pg/mL，回收率在94.8?108.6%。其它真菌毒素等生物小分子黃曲霉毒素BI的檢測無干擾。
【主權(quán)項】
1.一種快速檢測黃曲霉毒素BI的方法，其特征是，該方法包括如下步驟: (A)黃曲霉毒素BI核酸適體Apt與單鏈信號探針ssDNA雜交，形成雜交鏈； (B)使該雜交鏈與待測樣品作用，當待測樣品中有黃曲霉毒素BI存在時，雜交鏈選擇性地與黃曲霉毒素BI反應(yīng)釋放出單鏈信號探針ssDNA; (C)為了消除雜交鏈的干擾，利用DNA擴增，使雜交鏈成雙鏈DNA，然后用外切酶，將雙鏈DNA水解成單核苷酸而除去雙鏈DNA，留下單鏈信號探針ssDNA ； (D)利用黃曲霉毒素BI核酸適體-黃曲霉毒素BI結(jié)合體不能誘導(dǎo)銅離子還原生成近紅外熒光的銅納米粒子，只有單鏈信號探針ssDNA能夠誘導(dǎo)銅離子還原成近紅外熒光銅納米粒子，檢測體系的熒光強度，從而測定待測樣品中的黃曲霉毒素BI的含量。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測黃曲霉毒素BI的方法，其特征是，所述黃曲霉毒素BI核酸適體為5 ’ -GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3 ’。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的快速檢測黃曲霉毒素BI的方法，其特征是，所述的單鏈信號探針ssDNA為5 ’ -TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGGGCCTAGCG-3 ’。4.權(quán)利要求1所述的快速檢測黃曲霉毒素BI的方法，包括檢測黃曲霉毒素BI的試劑盒，其至少包括:黃曲霉毒素BI核酸適體、單鏈信號探針ssDNA、DNA擴增體系、核酸外切酶、銅離子還原檢測體系。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征是，所述黃曲霉毒素BI核酸適體為5’-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3’。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征是，所述的單鏈信號探針DNA為5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGGGCCTAGCG_3’。7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征是，所述DNA擴增體系包括緩沖溶液、dNTP和Phi29 DNA聚合酶；所述緩沖溶液由Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4組成。8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征是，所述核酸外切酶為ExoIII核酸外切酶。9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征是，所述的銅離子還原檢測體系中還原劑為維生素C。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種快速檢測黃曲霉毒素B1的方法，該方法包括如下步驟：（A）使黃曲霉毒素B1核酸適體Apt與單鏈信號探針ssDNA雜交，形成雜交鏈；（B）使該雜交鏈與待測樣品接觸，當待測樣品中有黃曲霉毒素B1存在時，雜交鏈與黃曲霉毒素B1反應(yīng)釋放出ssDNA；（C）利用DNA擴增，使雜交鏈成雙鏈DNA，然后用外切酶，將雙鏈DNA水解成單核苷酸而除去雙鏈DNA，此時體系中留下ssDNA；（D）在ssDNA誘導(dǎo)下，銅離子還原生成近紅外熒光銅納米粒子；檢測體系熒光強度，從而測定待測樣品中的黃曲霉毒素B1的含量。
【IPC分類】G01N21/64
【公開號】CN105675565
【申請?zhí)枴緾N201610043519
【發(fā)明人】易守軍, 黃盛茂, 黃昊文, 鄧克勤, 夏曉東, 曾云龍, 唐春然
【申請人】湖南科技大學(xué)
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2016年1月24日