一種對髓母細胞瘤細胞熱力學參數(shù)的檢測分析方法及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明屬臨床檢驗技術領域，涉及一種對髓母細胞瘤細胞熱力學參數(shù)的檢測分析方法及其用途。本發(fā)明方法中通過示差掃描量熱法(DSC)，對獲得的離體的患者腦脊液(CSF)標本加熱，對該加熱過程中產(chǎn)生的熱力學參數(shù)變化進行分析，確定參數(shù)臨界值；本方法優(yōu)化了腦脊液蛋白提純處理程序，簡化了實驗操作，可直接、快速地檢查CSF標本Tm，當Tm＝73.76℃時，特異性為69.6％,敏感性為86.7％，以該值為檢測閾值，有助于髓母細胞瘤播散轉(zhuǎn)移的輔助判斷，本方法無需昂貴的實驗設備，簡便，易行；將為髓母細胞轉(zhuǎn)移和播散生物行為的進一步研究提供有利的工具。
【專利說明】
一種對髓母細胞瘤細胞熱力學參數(shù)的檢測分析方法及其用途
技術領域
[0001]本發(fā)明屬臨床檢驗技術領域，涉及髓母細胞瘤細胞的檢測，尤其涉及一種對髓母細胞瘤細胞熱力學參數(shù)的檢測分析方法及其用途。本發(fā)明方法中通過示差掃描量熱法(differential scanning calorimetry, DSC)，對獲得的離體的患者腦脊液(Cerebrospinal fIuid，CSF)標本加熱，對該加熱過程中產(chǎn)生的熱力學參數(shù)變化進行分析，確定參數(shù)臨界值，本發(fā)明方法以及獲得的的參數(shù)有助于髓母細胞瘤播散轉(zhuǎn)移的判斷。
【背景技術】
[0002]文獻報道，髓母細胞瘤(M)好發(fā)兒童，該種腫瘤起源于胚胎殘余細胞，生存時間短，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性程度最高的神經(jīng)上皮性腫瘤之一。研究顯示，MB絕大多數(shù)生長在小腦頓部，它可隨著腦脊液播散轉(zhuǎn)移是其重要生物學特性(Brandes AA, Crit Rev OncolHematoI，2004)，通常臨床實踐中根據(jù)髓母細胞瘤的播散狀態(tài)和范圍將MB分為M0-M4型，其中MO為未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移，Ml為CSF中發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞，M2-4為顱內(nèi)或顱外發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶(ChangCH, Rad1logy, 1969) 0有研究認為，腫瘤的轉(zhuǎn)移(M1-M4)是腫瘤預后的重要標志之一，它決定了腫瘤的治療方式和策略(Zeltzer PM，J Clin Oncol, 1999 ；Packer RJ, PediatrNeurosurg, 2003)。因此，識別MB是否轉(zhuǎn)移播散具有非常重要的臨床參考意義。
[0003]通常，臨床實踐中主要通過影像學和腫瘤脫落細胞學識別腫瘤細胞的存在狀態(tài)，其中，影像學診斷仍然是主要標準，尤其是在檢測髓母細胞瘤細胞的存在狀態(tài)時，能較客觀的顯示髓母細胞瘤細胞的存在狀態(tài)，即通過影像學方法能為臨床發(fā)現(xiàn)MB顱內(nèi)或顱外轉(zhuǎn)移病灶提供有參考意義的檢測依據(jù)，但是它仍然需要有經(jīng)驗的神經(jīng)外科醫(yī)生或影像學醫(yī)生對其進行綜合判斷，但它不能發(fā)現(xiàn)髓母細胞瘤的Ml狀態(tài)，而Ml狀態(tài)也是影響患者生存時間的重要指標，而目前Ml狀態(tài)只能由脫落細胞學進行檢查，但遺憾的是，脫落細胞學無論在特異上還是在敏感性上都存在不足，如:在特異性上，脫落細胞學受到腰椎穿刺檢查條件和時間的嚴格限制，早期術后發(fā)現(xiàn)的脫落腫瘤細胞并不一定預示著腫瘤細胞的具體存在狀態(tài)，而在敏感性上，脫落細胞學檢查敏感性僅在35%左右(Terterov S，J Neurosurg Pediatr,2010)。在有關前瞻性臨床研究試驗中，通過脫落細胞學CSF檢測未發(fā)現(xiàn)Ml狀態(tài)MB病人，而已被影像學證實發(fā)生顱內(nèi)外轉(zhuǎn)移(M2-M4)狀態(tài)的MB病人脫落細胞學檢出率也僅僅為26.7%，因此關于檢測髓母細胞瘤細胞的存在狀態(tài)的方法將有利于完善和補充對髓母細胞瘤轉(zhuǎn)移和播散狀態(tài)的判斷。
[0004]DSC是一項被廣泛應用于無機及有機化合物及藥物分析的研究工具。其本質(zhì)是一種量熱法，它在程序控制溫度下，觀察輸給物質(zhì)和參比物的功率差與溫度的關系，并根據(jù)熱量和溫度相互關系繪制DSC曲線。該法可測定多種熱力學和動力學參數(shù)，如比熱容、焓變、反應熱、相圖、反應速率、結(jié)晶速率、尚聚物結(jié)晶度、樣品線度等(如圖1所不)。而在生物樣本中，復雜分子的相關作用能夠改變生物樣本的熱力學屬性，因此它能夠用于研究純化的單個生物多聚體以及它們之間的相互作用，該技術現(xiàn)已被逐漸應用于人體血漿、血清等體液蛋白質(zhì)組在疾病狀態(tài)下的特異性改變(Garbett NC, Plos One, 2014 ；Engh JA,Neurosurgery,2011)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種對髓母細胞瘤細胞熱力學參數(shù)的檢測分析方法，本發(fā)明方法中通過示差掃描量熱法(differential scanning calorimetry, DSC)，對獲得的離體的患者腦脊液(Cerebro spinal fluid，CSF)標本加熱，對該加熱過程中產(chǎn)生的熱力學參數(shù)變化進行分析，確定參數(shù)臨界值。
[0006]本發(fā)明的進一步目的是提供上述方法在用于輔助判斷髓母細胞瘤播散轉(zhuǎn)移中的用途。
[0007]本發(fā)明中基于髓母細胞瘤細胞具有腦脊液播散的特性，及其腦脊液會產(chǎn)生特異性的生物標志物，將這些生物標志物作為配體和腦脊液原有的高豐度受體蛋白結(jié)合，能改變髓母細胞瘤在腦脊液DSC熱譜圖的特性，形成特征性的熱力學參數(shù)；本發(fā)明中通過DSC對其相關參數(shù)進行檢測，其結(jié)果有助于幫助MB轉(zhuǎn)移播散狀態(tài)的識別；本方法采用的DSC將為現(xiàn)有影像學診斷手段提供有力補充，進一步為判斷髓母細胞瘤的預后并實行個體化治療提供有力的輔助工具。
[0008]具體的，本發(fā)明中結(jié)合了 DSC與CSF提純分析技術，通過改良技術分析提純CSF蛋白，使用差掃描量熱法(differential scanning calorimetry, DSC)，優(yōu)化DSC操作參數(shù)并篩選DSC結(jié)果參數(shù)，結(jié)果顯示，其中溶解溫度(Tm)值為轉(zhuǎn)移播散髓母細胞瘤病人顯著性改變指標，進一步通過受試者工作特征曲線(receiver operating characteristiccurve, ROC)對該方法進行分析，ROC曲線下面積為0.835，提示對髓母細胞瘤的判斷有良好的參考價值(如圖所示)，當Tm = 73.76°C時，特異性為69.6%，敏感性為86.7%，表明本檢測分析方法較傳統(tǒng)影像學和脫落細胞學檢測方法具有明顯優(yōu)勢，同時，本方法簡便易行、成本較低、質(zhì)量穩(wěn)定，為髓母細胞瘤的轉(zhuǎn)移狀態(tài)判斷和個性化的治療提供了有用的輔助工具。
[0009]更具體的，本發(fā)明的一種對髓母細胞瘤細胞熱力學參數(shù)的檢測分析方法，其特征在于，其包括步驟:
[0010]1，對離體的患者的腦脊液(Cerebro spinal fluid，CSF)進行樣本處理:
[0011]I)取出儲存在-80°c條件下的CSF標本，在室溫下自然解凍；
[0012]2)加樣于Amicon Ultra-0.5ml超速離心管，每個樣品管封蓋，并根據(jù)樣品號進行標記；
[0013]3)4。。14000Xg 超濾離心 30 分鐘；
[0014]4)倒掉底層收集管內(nèi)的液體，加450ul4 °C預冷的PBS (PH = 7.4)到濾芯，14000 Xg離心30分鐘；
[0015]5)倒掉底層收集管內(nèi)的液體，加450ul4 °C預冷的PBS (PH = 7.4)到濾芯，14000 Xg離心30分鐘；
[0016]6)在完成最后一輪離心后，取出濾芯，倒置放置在另一個干凈的收集管上，100Xg離心2分鐘回收濃縮液；
[0017]7)濃縮液用PBS (4°C )稀釋到600ul的終體積；
[0018]8)每個樣本中各取20ul用BCA法進行蛋白濃度測量，剩余樣本保存在4°C下送檢DSC檢測；
[0019]2，不差掃描量熱法(differential scanning calorimetry, DSC)分析樣本:
[0020]I)將400ulPBS緩沖液或樣品上樣于microcal VP-capillary DSC專用的96孔板；
[0021]2)樣品掃描記錄范圍從10°C到110°C，設定升溫速度為1.00C /min ；
[0022]3)原始數(shù)據(jù)先用緩沖液-緩沖液掃描的數(shù)據(jù)進行校正，并根據(jù)樣品的總蛋白濃度進行歸一化處理；
[0023]4)熱譜圖根據(jù)比容(Cal/°C.g)隨溫度變化進行繪制，利用自帶origin軟件進行繪制，并計算Tm值。
[0024]本發(fā)明的CSF的樣本處理中:使用Amicon Ultra-0.5ml離心管14000rpm超速離心至少3次，平均每次不少于30分鐘，使本方法能最大限度提高腦脊液純度，減少雜質(zhì)干擾十目號，提尚樣品同質(zhì)性；
[0025]本發(fā)明的DSC檢測的參數(shù)設置中:從10°C到110°C，設定升溫速度為1.0°C /min,DSC曲線縱坐標為比容(Cal/°C.g)，橫坐標為溫度值；
[0026]本發(fā)明中，診斷參數(shù)為溶解溫度Tm，當Tm = 73.76°C，特異性為69.6 %，敏感性為86.
[0027]本發(fā)明進行了前瞻性臨床試驗，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)移播散MB病人CSF較無轉(zhuǎn)移病人CSF的Tm值明顯升高；進一步通過受試者工作特征曲線(receiver operating characteristiccurve, ROC)分析，結(jié)果顯示，曲線下面積為0.829，具有較高判斷參考價值，當界值Tm =73.76°C，特性為69.6% ,敏感性為86.7%0
[0028]本發(fā)明方法在可用于輔助判斷髓母細胞瘤的播散轉(zhuǎn)移。
[0029]本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
[0030]1、結(jié)合了 DSC和CSF蛋白提純技術，可以直接、快速地檢查CSF標本Tm，當Tm =73.76°C時，特異性為69.6%，敏感性為86.7%，以該值為檢測閾值，有助于髓母細胞瘤播散轉(zhuǎn)移的判斷，其輔助判斷價值優(yōu)于影像學檢測；與CSF脫落細胞學檢測相比，其檢測髓母細胞瘤細胞的存在狀態(tài)的敏感性和特異性均明顯提高；同時，本方法無需昂貴的實驗設備，簡便，易行；
[0031]2、本方法優(yōu)化了腦脊液蛋白提純處理程序，簡化了實驗操作，將干擾因素控制到最低；
[0032]3、本方法獲得的Tm值與CSF中轉(zhuǎn)移瘤標志性小分子蛋白和高豐度受體蛋白結(jié)合后CSF熱穩(wěn)定性改變有關，因此本方法將為髓母細胞轉(zhuǎn)移和播散生物行為的進一步研究提供有利的工具。
[0033]為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實施例對本發(fā)明的進行詳細地描述。需要特別指出的是，具體實例和附圖僅是為了說明，顯然本領域的普通技術人員可以根據(jù)本文說明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外，本發(fā)明引用了公開文獻，這些文獻是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本文進行參考，就好像它們的全文已經(jīng)在本文中重復敘述過一樣。
【附圖說明】
[0034]圖1.差掃描量熱法主要參數(shù)。
[0035]圖2.(a)非播散轉(zhuǎn)移組髓母細胞瘤病例的熱譜圖(n = 23) (b)平均數(shù)值，陰影部分為標準差。
[0036]圖3.(a)播散轉(zhuǎn)移組髓母細胞瘤病例的熱譜圖(η = 15) (b)平均數(shù)值，陰影部分為標準差。
[0037]圖4.非播散轉(zhuǎn)移組和播散轉(zhuǎn)移組髓母細胞瘤病例熱譜圖平均值(a)和Tm值(b)比較。
[0038]圖5.ROC曲線，曲線下面積為0.829，對應最佳界值Tm = 73.76 °C (特異性:69.6%，敏感性:86.7% ) ο
【具體實施方式】
[0039]實施例1對髓母細胞瘤細胞熱力學參數(shù)的檢測分析實驗
[0040]1，對離體的患者的腦脊液(Cerebro spinal fluid，CSF)進行樣本處理:
[0041]I)取儲存在_80°C條件下的CSF標本，在室溫下自然解凍；
[0042]2)加樣于Amicon Ultra-0.5ml超速離心管，每個樣品管封蓋，并根據(jù)樣品號進行標記；
[0043]3) 4°C 14000 X g 超濾離心 30 分鐘；
[0044]4)倒掉底層收集管內(nèi)的液體，加450ul4 °C預冷的PBS (PH = 7.4)到濾芯，14000 Xg離心30分鐘；
[0045]5)倒掉底層收集管內(nèi)的液體，加450ul4 °C預冷的PBS (PH = 7.4)到濾芯，14000 Xg離心30分鐘；
[0046]6)在完成最后一輪離心后，取出濾芯，倒置放置在另一個干凈的收集管上，100Xg離心2分鐘回收濃縮液；
[0047]7)濃縮液用PBS (4°C )稀釋到600ul的終體積；
[0048]8)每個樣本中各取20ul用BCA法進行蛋白濃度測量，剩余樣本保存在4°C下送檢DSC檢測；
[0049]2、不差掃描量熱法(differential scanning calorimetry, DSC)分析樣本:
[0050]I)將400ulPBS緩沖液或樣品上樣于microcal VP-capillary DSC專用的96孔板；
[0051]2)樣品掃描記錄范圍從10°C到110°C，設定升溫速度為1.00C /min ；
[0052]3)原始數(shù)據(jù)先用緩沖液-緩沖液掃描的數(shù)據(jù)進行校正，并根據(jù)樣品的總蛋白濃度進行歸一化處理；
[0053]4)熱譜圖根據(jù)比容(Cal/°C.g)隨溫度變化進行繪制，利用自帶origin軟件進行繪制，并計算Tm值。
[0054]本發(fā)明從伴有播散轉(zhuǎn)移病人CSF DSC眾多參數(shù)中，篩選出其中溶解溫度Tm為顯著改變參數(shù)，經(jīng)前瞻性臨床試驗驗證，其中轉(zhuǎn)移播散MB病人CSF較無轉(zhuǎn)移病人CSF的Tm值明顯升高，進一步通過受試者工作特征曲線(receiver operating characteristiccurve, ROC)分析，曲線下面積為0.829，具有較高的判斷輔助價值，當界值Tm = 73.76°C，特性為69.6% ,敏感性為86.7%o
【主權項】
1.一種對髓母細胞瘤細胞熱力學參數(shù)的檢測分析方法，其特征在于，其包括步驟: 1)對離體的患者的腦脊液(CSF)進行樣本處理: (1)取出儲存在_80°C條件下的CSF標本，在室溫下自然解凍； (2)加樣于AmiconUltra-0.5ml超速離心管，每個樣品管封蓋，并標記； (3)40C 14000 X g超濾離心30分鐘； (4)倒掉底層收集管內(nèi)的液體，加450ul4°C預冷的PBS(PH = 7.4)到濾芯，14000 Xg離心30分鐘； (5)倒掉底層收集管內(nèi)的液體，加450ul4°C預冷的PBS(PH = 7.4)到濾芯，14000 Xg離心30分鐘； (6)在完成離心后，取出濾芯，倒置放置在另一收集管上，1000X g離心2分鐘回收濃縮液； (7)濃縮液用PBS(40C )稀釋至IJ 600ul的終體積； (8)每個樣本中各取20ul用BCA法進行蛋白濃度測量，剩余樣本保存在4°C下送檢DSC檢測； 2)示差掃描量熱法(DSC)分析樣本: (1)將400ulPBS緩沖液或樣品上樣于microcalVP-capillary DSC用的96孔板； (2)樣品掃描記錄范圍從10°C到110°C，設定升溫速度為1.00C /min ; (3)原始數(shù)據(jù)先用緩沖液-緩沖液掃描的數(shù)據(jù)進行校正，并根據(jù)樣品的總蛋白濃度進行歸一化處理； (4)熱譜圖根據(jù)比容(Cal/°C.g)隨溫度變化進行繪制，利用origin軟件進行繪制，并計算Tm值。2.按權利要求1所述的對髓母細胞瘤細胞熱力學參數(shù)的檢測分析方法，其特征在于，所述的CSF的樣本處理中:使用Amicon Ultra-0.5ml離心管14000rpm超速離心至少3次，平均每次不少于30分鐘。3.按權利要求1所述的對髓母細胞瘤細胞熱力學參數(shù)的檢測分析方法，其特征在于，所述的DSC檢測的參數(shù)設置中:從10°C到110°c，設定升溫速度為1.00C /min, DSC曲線縱坐標為比容(Cal/°C.g)，橫坐標為溫度值。4.按權利要求1所述的對髓母細胞瘤細胞熱力學參數(shù)的檢測分析方法，其特征在于，所述的方法中，溶解溫度Tm為判斷參數(shù)，當Tm = 73.76 °C，特異性為69.6%，敏感性為.86.5.權利要求1所述的對髓母細胞瘤細胞熱力學參數(shù)的檢測分析方法在用于輔助判斷髓母細胞瘤的播散轉(zhuǎn)移中的用途。
【文檔編號】G01N25/20GK105823791SQ201510004900
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2015年1月6日
【發(fā)明人】姚瑜, 唐超, 周良輔, 張振宇, 沈方, 鐘平
【申請人】復旦大學附屬華山醫(yī)院