一種利用甘蔗花葉病毒p3n-pipo構(gòu)建的亞細(xì)胞定位試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用甘蔗花葉病毒P3N?PIPO構(gòu)建的植物亞細(xì)胞定位試劑盒，包括4個分別標(biāo)記綠色、紅色、黃色和青色熒光蛋白的胞間連絲定位載體：SCMV?P3N?PIPO?GFP、pSCMV?P3N?PIPO?RFP、pSCMV?P3N?PIPO?YFP和pSCMV?P3N?PIPO?CFP；4個無特異亞細(xì)胞定位的對照載體：pSAT6?EGFP?C1、pSAT6?ERFP?C1、pSAT6?EYFP?C1和pSAT6?ECFP?C1；限制性內(nèi)切酶Xho I、Hind III、無RNase水和侵染液。使用本試劑盒可以快速明確目的基因表達(dá)產(chǎn)物是否具有胞間連絲定位的特性。
【專利說明】
-種利用甘薦花葉病毒P3N-PIPO構(gòu)建的亞細(xì)胞定位試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域 [0001] 本發(fā)明設(shè)及一種試劑盒，具體設(shè)及一種利用甘薦花葉病毒P3N-PIP0構(gòu) 建的亞細(xì)胞定位試劑盒。本發(fā)明利用分別帶有綠色巧光蛋白（green fluorescent protein,GFP)標(biāo)記、紅色巧光蛋白（red fluorescent protein,RFP)標(biāo)記、黃色巧光蛋白 (yellow fluorescent protein,YFP)標(biāo)記和青色巧光蛋白（cyan fluorescent protein, CFP)標(biāo)記的具有特異胞間連絲(Plasmodesma，PD)定位功能的蛋白SCMV-P3N-PIP0,指示待 驗(yàn)證基因表達(dá)蛋白是否具有胞間連絲定位特性，屬于生物。
【背景技術(shù)】 [0002] 隨著生物技術(shù)的發(fā)展，尤其是基因組學(xué)的發(fā)展和測序技術(shù)的進(jìn)步，越來 越多的新基因被發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)形成了海量數(shù)據(jù)。明確未知基因的功能，探討其潛在的應(yīng)用價 值，是基因組學(xué)研究的終極目標(biāo)。蛋白質(zhì)是基因的表達(dá)產(chǎn)物，蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位與蛋白質(zhì) 的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系密切，蛋白質(zhì)必須處于合適的位置才能發(fā)揮其功能。對于一個新基因，明 確其表達(dá)產(chǎn)物即蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位，可W為研究該基因的功能提供重要線索。目前，確定 蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位的方法主要有Ξ種:細(xì)胞分饋法，電子顯微鏡分析，激光共聚焦法，其中 激光共聚焦法應(yīng)用最為廣泛。激光共聚焦法利用標(biāo)記巧光蛋白受激發(fā)產(chǎn)生的巧光信號，可 W直觀的觀察到目標(biāo)蛋白所在的亞細(xì)胞位置。在對目標(biāo)蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行研究時，需 要陽性對照，即具有特異亞細(xì)胞地位的帶有可檢測標(biāo)記的蛋白，佐證未知蛋白的定位。
[0003] 胞間連絲(Plasmodesma，PD)是植物體內(nèi)穿過細(xì)胞壁連接相鄰細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和內(nèi) 質(zhì)網(wǎng)的連絲微管，是細(xì)胞間物質(zhì)運(yùn)輸與信息傳遞的重要通道。PD的結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜，至今依然 沒有完全清楚，其結(jié)構(gòu)模型一直處于補(bǔ)充更新狀態(tài)。ro的通透性受多種因素調(diào)節(jié)，小分子物 質(zhì)可W通過胞間連絲自由擴(kuò)散，但是蛋白質(zhì)、核酸等大分子或者大分子復(fù)合體如病毒粒子、 核糖體蛋白復(fù)合體等的胞間移動受PD的調(diào)控。對于植物胞間信號傳導(dǎo)和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)确矫娴?研究，盡管可W利用生物信息學(xué)手段對分離到的基因的編碼蛋白亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測，但 是必須對該基因編碼蛋白做亞細(xì)胞定位進(jìn)行生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，明確其能否定位于PD，進(jìn)而判定 該蛋白是否參與胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和物質(zhì)運(yùn)輸，為研究其功能提供直觀的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
[0004] 2008年，Chung等利用生物信息學(xué)方法，對包括甘薦花葉病毒（Sugarcane mosaic virus,SCMV)、高梁花葉病毒（Sorghum mosaic virus,SrMV)和甘薦條紋花葉病毒 (Sugarcane sheak mosaic virus,SCSMV)等在內(nèi)的48個馬鈴馨Υ病毒科的病毒分析表明， 在Ρ3基因內(nèi)部存在一個保守結(jié)構(gòu)G1-2A6-7，核糖體在該保守結(jié)構(gòu)通過+2移碼可W翻譯出一個 大約6-7kDa的蛋白（ΡΙΡ0)，該蛋白與Ρ3蛋白的Ν端結(jié)合，形成一個大約25kDa的融合蛋白，即 P3N-PIP0?；痷ng等克隆了憲菁花葉病毒（Turnip mosaic virus，TuMV)的P3N-PIP0編碼序 列，并通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了化MV-P3N-PIP0定位于胞間連絲。研究表明，P3N-PIP0很可能是馬鈴 馨Y病毒的移動蛋白，該蛋白通過與寄主因子互作，使病毒通過胞間連絲實(shí)現(xiàn)胞間移動，進(jìn) 而對寄主建立系統(tǒng)性侵染（Choi等，2005; Chung等，2008; Wen等，2010; Wei等，2010; Vijayapalani 等，2012)。但是有關(guān) SCMV-P3N-PIP0，SrMV-P3N-PIP0 和 SCSMV-P3N-PIP0 的亞 細(xì)胞定位研究還未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種利用甘薦花葉病毒P3N-PIP0構(gòu)建的亞細(xì)胞定 位試劑盒，為檢測目的基因表達(dá)產(chǎn)物是否定位于植物胞間連絲提供指示。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下。
[0007] 利用融合PCR技術(shù)，WSCMV的P3基因編碼序列為模板，克隆了P3N-PIP0的編碼序 列，構(gòu)建到攜帶不同巧光標(biāo)記蛋白基因植物表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，注射本氏煙葉片，在 激光共聚焦顯微鏡下使用相應(yīng)的激光激發(fā)并采集發(fā)射光信號，即可在本氏煙上皮細(xì)胞的胞 間連絲位置上觀測到清晰明亮的點(diǎn)狀圖像，證明了 P3N-PIP0定位于胞間連絲。據(jù)此，我們利 用SCMV的P3N-PIP0構(gòu)建了植物亞細(xì)胞定位試劑盒。
[0008] 本發(fā)明的一種利用甘薦花葉病毒P3N-PIP0構(gòu)建的亞細(xì)胞定位試劑盒，其特征在于 該試劑盒由下列試劑組成：
[0009] (1)綠色巧光蛋白標(biāo)記的PD定位載體PSCMV-P3N-PIP0-GFP，作為陽性對照，1管， 1 OOng/yL，50μLν管，-20 °C冷凍保存?zhèn)溆茫?br>[0010] (2)紅色巧光蛋白標(biāo)記的PD定位載體PSCMV-P3N-PIP0-RFP，作為陽性對照，1管， 1 OOng/yL，50μLν管，-20 °C冷凍保存?zhèn)溆茫?br>[0011] (3)黃色巧光蛋白標(biāo)記的PD定位載體PSCMV-P3N-PIP0-YFP，作為陽性對照，1管， 1 OOng/yL，50μLν管，-20 °C冷凍保存?zhèn)溆茫?br>[0012] (4)青色巧光蛋白標(biāo)記的PD定位載體PSCMV-P3N-PIP0-CFP，作為陽性對照，1管， 1 OOng/yL，50μLν管，-20 °C冷凍保存?zhèn)溆茫?br>[0013 ] (5)載體 PSAT6-EGFP-C1:1 管，SOOng/yL，50μLν 管，-20 °C 冷凍保存?zhèn)溆茫?br>[0014] (6)載體 PSAT6-ERFP-C1:1 管，SOOng/yL，50μLν 管，-20 °C 冷凍保存?zhèn)溆茫?br>[0015 ] (7)載體 PSAT6-EYFP-C1:1 管，SOOng/yL，50μLν 管，-20 °C 冷凍保存?zhèn)溆茫?br>[0016] (8)載體 PSAT6-ECFP-C1:1 管，SOOng/yL，50μLν 管，-20 °C 冷凍保存?zhèn)溆茫?br>[0017] (9)限制性內(nèi)切酶趾0 1:1管，500units，100yL/管；
[001 引（10)限制性內(nèi)切酶 Hind 111:1 管，500units，100yL/管；
[0019] (11)無 RNase 水:2瓶，lOOmL/瓶；
[0020] (12)侵染液：1管，50mL/管，-20°C冷凍保存?zhèn)溆?；所述侵染液，包括D-葡萄糖， 250mg;MES，5ιΛ;Na3P〇4 · 12出0，5ιΛ;乙酷下香酬，如L加入dd出0至總體積50血。
[0021] 所述綠色巧光蛋白標(biāo)記的PD定位載體PSCMV-P3N-PIP0-GFP的構(gòu)建方法:使用趾0 巧口Hind III對載體pSAT6-EGFP-Cl(GenBank:AY818374)進(jìn)行雙酶切，然后用T4DNA連接酶 將酶切產(chǎn)物與插入片段S連接，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌化scherichia coli)D冊α中，挑取 陽性克隆驗(yàn)證；
[0022] 所述紅色巧光蛋白標(biāo)記的PD定位載體PSCMV-P3N-PIP0-RFP的構(gòu)建方法:使用趾0 巧口Hind III對載體pSAT6-ERFP-Cl(GenBank:DQ005474)進(jìn)行雙酶切，然后用T4DNA連接酶 與將酶切產(chǎn)物插入片段S連接，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌化scherichia coli)D冊α中，挑取 陽性克隆驗(yàn)證；
[0023] 所述黃色巧光蛋白標(biāo)記的PD定位載體PSCMV-P3N-PIP0-YFP的構(gòu)建方法:使用趾0 巧口Hind III對載體pSAT6-EYFP-Cl(GenBank:AY818380)進(jìn)行雙酶切，然后用T4DNA連接酶 將酶切產(chǎn)物與插入片段S連接，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌化scherichia coli)D冊α中，挑取 陽性克隆驗(yàn)證；
[0024] 所述青色巧光蛋白標(biāo)記的PD定位載體PSCMV-P3N-PIP0-CFP的構(gòu)建方法:使用趾0 巧口Hind III對載體pSAT6-ECFP-Cl(GenBank:AY818374)進(jìn)行雙酶切，然后用T4DNA連接酶 將酶切產(chǎn)物與插入片段s連接，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌化scherichia coli)D冊α中，挑取 陽性克隆驗(yàn)證；
[0025] 所述插入片段S，其核巧酸序列為序列表中SEQ ID NO: 11所示的核巧酸序列。
[0026] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果:使用本發(fā)明的試劑盒可W快速將目的基因構(gòu)建到帶有 巧光標(biāo)記的載體中，明確其表達(dá)產(chǎn)物是否具有胞間連絲定位的特性。本試劑盒提供了4種巧 光標(biāo)記載體，為使用者提供了更多的選擇，滿足了研究不同基因表達(dá)產(chǎn)物是否共定位于胞 間連絲的需求。使用本試劑盒可W快速完成目的基因表達(dá)產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位。
【附圖說明】：
[0027] 圖1為綠色巧光蛋白標(biāo)記的載體PSCMV-P3N-PIP0-GFP的質(zhì)粒圖譜；
[002引圖2為紅色巧光蛋白標(biāo)記的載體PSCMV-P3N-PIP0-RFP的質(zhì)粒圖譜；
[0029] 圖3為黃色巧光蛋白標(biāo)記的載體PSCMV-P3N-PIP0-YFP的質(zhì)粒圖譜；
[0030] 圖4為青色巧光蛋白標(biāo)記的載體PSCMV-P3N-PIP0-CFP的質(zhì)粒圖譜；
[0031 ] 圖5為擬南芥AtREMl. 3的紅色巧光蛋白標(biāo)記載體pAtREMl. 3-RFP的質(zhì)粒圖譜；
[0032] 圖6為pAtREMl. 3-RFP和PSCMV-P3N-PIP0-GFP亞細(xì)胞定位圖的合并圖片；
[0033] 圖7為GFP載體PSAT6-EGFP-C1的亞細(xì)胞定位；
[0034] 圖8為RFP載體PSAT6-ERFP-C1的亞細(xì)胞定位。
【具體實(shí)施方式】 [0035] 為了進(jìn)一步闡明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明，W下結(jié)合實(shí)施例加 W 說明。下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。所述試劑和生物材料如 無特殊說明均可從商業(yè)途徑獲得。
[0036] 實(shí)施例一:SCMV-P3N-PIP0編碼序列的克隆
[0037] 本發(fā)明利用PCR技術(shù)，克隆了甘薦花葉病毒（Sugarcane mosaic virus,SCMV)的P3 蛋白編碼序列；WP3基因?yàn)槟０?，利用融合PCR技術(shù)，克隆了SCMV的P3N-PIP0的編碼序列，并 將該序列連接到帶有不同巧光蛋白標(biāo)記的表達(dá)載體中，獲得了 4個能夠特異定位于胞間聯(lián) 絲的亞細(xì)胞表達(dá)載體，即綠色巧光蛋白標(biāo)記的PD定位載體PSCMV-P3NPIP0-GFP，紅色巧光蛋 白標(biāo)記的PD定位載體PSCMV-P3NPIP0-RFP，黃色巧光蛋白標(biāo)記的PD定位載體pSCMV- P3NPIP0-YFP和青色巧光蛋白標(biāo)記的PD定位載體PSCMV-P3NPIP0-CFP。載體構(gòu)建方法如下：
[0038] (1)SCMV-P3編碼序列的獲得:針對SCMV-P3的編碼序列設(shè)計(jì)特異PCR引物SCMV-P3- F(上游引物)和SCMV-P3-R(下游引物），W SCMV的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物通過 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離并回收，獲得SCMV-P3的編碼序列。所述上游引物SCMV-P3-F的核 巧酸序列為序列表中SEQ ID NO: 1所示的核巧酸序列；下游引物SCMV-P3-R的核巧酸序列為 序列表中SEQ ID N0:2所示的核巧酸序列；SCMV-P3編碼序列的核巧酸序列為序列表中SEQ ID NO:3所示的核巧酸序列；
[0039] (2) SCMV-P3N編碼序列的獲得:設(shè)計(jì)特異PCR引物，SCMV-P3N-F (上游引物)和SCMV- P3N-R(下游引物），在上游引物SCMV-P3N-F中引入酶切位點(diǎn)趾0 I。WSCMV-P3編碼序列為模 板，使用引物SCMV-P3N-F和SCMV-P3N-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25化：10 X PCR Buf f er 2.化L，dNTPs 2 . OyL，上游引物SCMV-P3N-F( ΙΟμL?ο 1/L) 1. OyL，下游引物SCMV-P3N-R( 10μ mo 1/L) 1.0化，Taq 酶（511/化)0.125化，d地2〇 17.37扣L，模板（cDNA) 1.0化，總體積 25化。PCR 反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性4min;然后運(yùn)行35個循環(huán)，94°C30s，50°C30s，72°C Imin;最后72°C lOmiruPCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，回收并濃縮至4(K)ngAiL， 獲得SCMV-P3N的編碼序列。所述上游引物SCMV-P3N-F的核巧酸序列為序列表中SEQ ID NO: 4所示的核巧酸序列；下游引物SCMV-P3N-R的核巧酸序列為序列表中SEQ ID N0:5所示的核 巧酸序列；SCMV-P3N編碼序列的核巧酸序列為序列表中SEQ ID N0:6所示的核巧酸序列； [0040] (3) SCMV-PIP0編碼序列的獲得：設(shè)計(jì)特異PCR引物，SCMV-PIP0-F(上游引物）和 SCMV-PIP0-R(下游引物），在下游引物SCMV-P3N-R中引入酶切位點(diǎn)Hind III。WSCMV-P3編 碼序列為模板，使用引物SCMV-PIP0-F和SCMV-PIP0-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25化：10 X PCR Buffer 2.5化，dNTPs 2.0yL，上游引物SCMV-PIP0-F(10ymol/L)1.0yL，下游引物5〔1￥- PIP0-R (10皿01 /L) 1.0化，Taq酶（511/化)0.12 5化，d地2〇 17.3 7 扣L，模板 kDNA) 1.0化，總體 積25化。？〔3反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性4min;然后運(yùn)行35個循環(huán)，94°C30s，50°C30s，72°Clmin; 最后72°C10minJCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，回收并濃縮至 400ngAiL，獲得SCMV-PIP0的編碼序列。所述上游引物SCMV-PIP0-F的核巧酸序列為序列表 中56〇10^:7所示的核巧酸序列；下游引物5〔1￥斗1口〇-如勺核巧酸序列為序列表中56〇10 N0:8所示的核巧酸序列；SCMV-PIP0編碼序列的核巧酸序列為序列表中SEQ ID N0:9所示的 核巧酸序列；
[0041 ] (4)SCMV-P3N-PIP0編碼序列的獲得:將濃度均為40化g/化的P3N和PIP0的PCR產(chǎn)物 按照1:1混合作為模板，使用引物SCMV-P3N-F和SCMV-PIP0-R，利用融合PCR方法克隆SCMV- P3NPIP0編碼序列。PCR反應(yīng)體系為25化：10XPCR Buffer 2.5^，(1ΝΤΡ3 2.0yL，上游引物 SCMV-P3N-F( 10ymol/L) 1. OyL，下游引物SCMV-PIP〇-R( 10ymol/L) 1. OyL，Taq酶（511/化） 0.12扣L，d地2〇 12.37扣L，模板（cDNA)6. OyL，總體積25化。PCR反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性4min; 然后運(yùn)行35個循環(huán)，94 °C 30s，55 °C 30s，72 °C Imin;最后72 °C lOmin JCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn) 物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離并回收，獲得SCMV-P3N-PIP0的編碼序列。所述SCMV-P3N- PIP0編碼序列的核巧酸序列為序列表中SEQ ID NO: 10所示的核巧酸序列；
[0042] (5)插入片段S的獲得:使用化0巧日化nd III對SCMV-P3N-PIP0編碼序列進(jìn)行雙酶 切，將酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離并回收，獲得插入片段S;所述插入片段S的核 巧酸序列為序列表中SEQ ID NO: 11所示的核巧酸序列；
[0043] (6)綠色巧光蛋白標(biāo)記的PD定位載體PSCMV-P3N-PIP0-GFP的構(gòu)建:使用趾0 I和 Hind III對載體pSAT6-EGFP-Cl(GenBank:AY818374)進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖 凝膠電泳進(jìn)行分離并回收。然后用T4DNA連接酶將酶切產(chǎn)物與插入片段S連接，并將連接產(chǎn) 物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌化schericMa coli)D冊α中，挑取陽性克隆驗(yàn)證，得到綠色巧光 蛋白標(biāo)記的PD定位載體PSCMV-P3N-PIP0-GFP，其質(zhì)粒圖譜如圖1所示；
[0044] (7)紅色巧光蛋白標(biāo)記的PD定位載體PSCMV-P3N-PIP0-RFP的構(gòu)建:使用趾0 I和 Hind III對載體PSAT6-ERFP-C1 (GenBank:DQ005474)進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖 凝膠電泳進(jìn)行分離并回收。然后用T4DNA連接酶將酶切產(chǎn)物與插入片段S連接，并將連接產(chǎn) 物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌化scherichia coli)D冊α中，挑取陽性克隆驗(yàn)證，得到紅色巧光 蛋白標(biāo)記的PD定位載體PSCMV-P3N-PIP0-RFP，其質(zhì)粒圖譜如圖2所示；
[0045] (8)黃色巧光蛋白標(biāo)記的PD定位載體PSCMV-P3N-PIP0-YFP的構(gòu)建:使用趾0 I和 Hind III對載體pSAT6-EYFP-Cl(GenBank:AY818380)進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖 凝膠電泳進(jìn)行分離并回收。然后用T4DNA連接酶將酶切產(chǎn)物與插入片段S連接，并將連接產(chǎn) 物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌化schericMa coli)D冊α中，挑取陽性克隆驗(yàn)證，得到黃色巧光 蛋白標(biāo)記的PD定位載體PSCMV-P3N-PIP0-YFP，其質(zhì)粒圖譜如圖3所示；
[0046] (9)青色巧光蛋白標(biāo)記的PD定位載體PSCMV-P3N-PIP0-CFP的構(gòu)建:使用趾0 I和 Hind III對載體pSAT6-ECFP-Cl(GenBank:AY818374)進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖 凝膠電泳進(jìn)行分離并回收。然后用T4DNA連接酶將酶切產(chǎn)物與插入片段S連接，并將連接產(chǎn) 物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌化scherichia coli)D冊α中，挑取陽性克隆驗(yàn)證，得到青色巧光 蛋白標(biāo)記的PD定位載體PSCMV-P3N-PIP0-CFP，其質(zhì)粒圖譜如圖4所示；
[0047] 實(shí)施例二:擬南芥AtREMl .3的亞細(xì)胞定位
[004引 1、擬南芥AtREMl. 3基因的克隆
[0049] 從擬南芥中克隆了一個Remorin基因，將其克隆到克隆載體PMD19-T中。進(jìn)化樹分 析表明該基因?qū)儆赗emorin基因家族的第1亞群的第巧中類型，命名為AtREMl. 3。文獻(xiàn)表明 Remorin可W定位于質(zhì)膜和胞間連絲，但是生物信息學(xué)分析表明，Remorin沒有跨膜結(jié)構(gòu)域 和信號膚。為驗(yàn)證AtREMl. 3是否可W定位于胞間連絲，使用本試劑盒對其進(jìn)行亞細(xì)胞定位 進(jìn)行研究。所述AtREMl.3編碼序列的核巧酸序列為序列表中SEQ ID NO: 12所示的核巧酸序 列；
[00加]2、亞細(xì)胞定位載體pAtREMl. 3-RFP的構(gòu)建
[0051 ] (1)設(shè)計(jì)特異PCR引物，AtREM1.3-F(上游引物）和AtREM1.3-R(下游引物），在上游 引物AtREMl. 3-F中引入酶切位點(diǎn)化0 I，在下游引物AtREMl. 3-R中引入酶切位點(diǎn)化nd III。 使用該對引物，WAtREMl. 3基因的克隆載體為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25化：10 XPCR Buffer 2.5^，(1ΝΤΡ8 2.0yL，上游引物AtREM1.3-F(10ymol/L)1.0yL，下游引物 AtREMl. 3-R(10皿01 /L) 1.0化，Taq酶巧U/化）0.125化，d地2〇 17.37扣L，模板（cDNA) 1.0化， 總體積25化。PCR反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性4min;然后運(yùn)行35個循環(huán)，94°C 30s，50°C 30s，72°C Imin;最后72°ClOminePCR反應(yīng)結(jié)束后，使用趾o巧日化nd III對PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，將酶 切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離并回收，獲得插入片段InsTarget;所述上游引物 AtREM1.3-F的核巧酸序列為序列表中SEQ ID N0:13所示的核巧酸序列；下游引物 AtREMl. 3-R的核巧酸序列為序列表中SEQ ID NO: 14所示的核巧酸序列；插入片段 Ins化rget的核巧酸序列為序列表中SEQ ID NO: 15所示的核巧酸序列；
[0化2] (2)取RFP對照載體，使用趾0 I和化nd III對載體PSAT6-ERFP-C1進(jìn)行雙酶切，將 酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離并回收。然后用T4DNA連接酶將酶切產(chǎn)物與插入片 段InsTarget連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌(^Escherichia coli )D冊α中，?兆取 陽性克隆驗(yàn)證，得到紅色巧光蛋白標(biāo)記的PD定位載體pAtREM1.3-RFP，其質(zhì)粒圖譜如圖5所 示；
[0化3] 3、亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)
[0054] (1)采用液氮凍融法，分別將亞細(xì)胞定位載體pAtREMl. 3-RFP和GFP標(biāo)記的PD定位 載體PSCMV-P3N-PIP0-GFP轉(zhuǎn)入感受態(tài)的農(nóng)桿菌EHA105菌株中；在5mL LB培養(yǎng)基(含Rif，34μ g/rnL Kan，50yg/mL)中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌，28 °C，200巧m培養(yǎng)過夜；
[0化日](2)常溫下，5,000巧m，離屯、5min，棄上清，加入ImL侵染液重懸菌液；
[0056] (3)重復(fù)步驟(2)，洗去培養(yǎng)基中含有的抗生素；
[0057] (4)加入ImL侵染液，現(xiàn)憶菌液0〇6日日，并調(diào)節(jié)0〇6日日值至0.1;
[005引（5)取75化L菌液于2mL無菌離屯、管中，混勻，放置3~化；將含有亞細(xì)胞定位載體 pAtREMl. 3-GFP的菌液和含有YFP標(biāo)記載體的菌液等比混勻，進(jìn)行侵染實(shí)驗(yàn)；
[0059] (6)取健康本氏煙植株(在侵染前，光照處理煙草化），選擇兩片大的葉片，在煙草 葉片背面(兩個葉脈間)注射菌液并做好標(biāo)記；
[0060] (7)把侵染過的煙草放在正常條件下培養(yǎng)。2天后取侵染葉片l-2cm2,背面朝上，用 激光共聚焦顯微鏡觀察。在采集巧光信號時，對同一個細(xì)胞分別采集不同巧光信號。待檢測 的pAtREM1.3-RFP標(biāo)記的是紅色巧光蛋白，采集紅色巧光蛋白信號時，在箭頭所示位置會出 現(xiàn)亮點(diǎn)，表明AtREMl. 3在細(xì)胞膜上表達(dá)，但是無法確定其定位于PD;本試劑盒提供PD定位載 體PSCMV-P3N-PIP0-GFP標(biāo)記的是綠色巧光蛋白，采集綠色巧光信號時，也會出現(xiàn)亮點(diǎn)，表明 亮點(diǎn)所在位置即為胞間連絲；當(dāng)把兩張圖片合并時，紅色亮點(diǎn)和綠色亮點(diǎn)準(zhǔn)確疊加后顯示 為黃色的亮點(diǎn)，表明AtREMl.3定位于胞間連絲，如圖6所示。
[0061 ] (8)按照上述程序和方法，將GFP載體PSAT6-EGFP-C1和RFP載體PSAT6-ERFP-C1在 本氏煙葉片表皮細(xì)胞中表達(dá)，激光共聚焦顯微鏡下檢測巧光信號。綠色巧光信號為散布狀 態(tài)（圖7)，紅色巧光信號為散布狀態(tài)（圖8)，表明綠色巧光蛋白和紅色巧光蛋白沒有特異的 亞細(xì)胞定位，目標(biāo)蛋白的亞細(xì)胞定位不是綠色或紅色巧光蛋白引起的，由此，證明AtREMl.3 可W定位于胞間連絲。
[0062]所述瓊脂糖凝膠電泳，參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第二版)第六章第一節(jié)中瓊脂糖 凝膠電泳的方法;所述將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌D冊α中，轉(zhuǎn)化方法參照《分子克隆 實(shí)驗(yàn)指南》(第二版)第一章第五節(jié)中用氯化巧制備和轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌的方法;所述含 有陽性克隆的菌落的挑取，參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第二版)第一章第六節(jié)中含重組質(zhì)粒 的細(xì)菌菌落的鑒定方法;所述提取質(zhì)粒DNA的方法，參照質(zhì)粒提取試劑盒說明書;所述酶切 方法，參照限制性內(nèi)切酶的說明書;所述回收方法，參照膠回收試劑盒說明書;所述用Τ4- DNA連接酶進(jìn)行連接方法，參照T4-DNA連接酶操作說明書。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種利用甘蔗花葉病毒P3N-PIP0構(gòu)建的亞細(xì)胞定位試劑盒，其特征在于該試劑盒由 下列試劑組成： (1) 綠色熒光蛋白標(biāo)記的定位載體pSCMV-P3N-PIP0-GFP，作為陽性對照，1管，lOOng/ yL，50yL/管，-20°C冷凍保存?zhèn)溆茫? (2) 紅色熒光蛋白標(biāo)記的定位載體pSCMV-P3N-PIP0-RFP，作為陽性對照，1管，lOOng/ yL，50yL/管，-20°C冷凍保存?zhèn)溆茫? (3) 黃色熒光蛋白標(biāo)記的定位載體pSCMV-P3N-PIP0-YFP，作為陽性對照，1管，lOOng/ yL，50yL/管，-20°C冷凍保存?zhèn)溆茫? (4) 青色熒光蛋白標(biāo)記的定位載體pSCMV-P3N-PIP0-CFP，作為陽性對照，1管，lOOng/ yL，50yL/管，-20°C冷凍保存?zhèn)溆茫? (5) GFP 載體 pSAT6-EGFP-C 1:1 管，500ng/yL，50yL/管，-20 °C 冷凍保存?zhèn)溆茫? (6) RFP 載體 pSAT6-ERFP-C 1:1 管，500ng/yL，50yL/管，-20 °C 冷凍保存?zhèn)溆茫? (7) YFP 載體 pSAT6-EYFP-C 1:1 管，500ng/yL，50yL/管，-20 °C 冷凍保存?zhèn)溆茫? (8) CFP 載體 pSAT6-ECFP-C 1:1 管，500ng/yL，50yL/管，-20 °C 冷凍保存?zhèn)溆茫? (9) 限制性內(nèi)切酶 Xho 1:1管，500units，100yL/管； (10) 限制性內(nèi)切酶 Hind 111:1管，500units，100yL/管； (11) 無 RNase 水:2瓶，100mL/瓶； (12) 侵染液：1管，50mL/管，-20 °C冷凍保存?zhèn)溆谩?. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用甘蔗花葉病毒P3N-PIP0構(gòu)建的亞細(xì)胞定位試劑盒， 其特征在于所述綠色熒光蛋白標(biāo)記的PD定位載體pSCMV-P3N-PIP0-GFP的構(gòu)建方法:使用 Xho I和Hind III對載體pSAT6-EGFP-Cl進(jìn)行雙酶切，然后用T4DNA連接酶與插入片段S連 接，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌(Escherichia coli)DH5a中，挑取陽性克隆驗(yàn)證;所述插入片 段S，其核苷酸序列為序列表中SEQ ID N0:11所示的核苷酸序列。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用甘蔗花葉病毒P3N-PIP0構(gòu)建的亞細(xì)胞定位試劑盒， 其特征在于所述紅色熒光蛋白標(biāo)記的PD定位載體pSCMV-P3N-PIP0-RFP的構(gòu)建方法:使用 Xho I和Hind III對載體pSAT6-ERFP-Cl進(jìn)行雙酶切，然后用T4DNA連接酶與插入片段S連 接，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5a中，挑取陽性克隆驗(yàn)證;所述插入片段S，其核苷酸序列為 序列表中SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用甘蔗花葉病毒P3N-PIP0構(gòu)建的亞細(xì)胞定位試劑盒， 其特征在于所述黃色熒光蛋白標(biāo)記的PD定位載體pSCMV-P3N-PIP0-YFP的構(gòu)建方法:使用 Xho I和Hind III對載體pSAT6-EYFP-Cl進(jìn)行雙酶切，然后用T4DNA連接酶與插入片段S連 接，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5a中，挑取陽性克隆驗(yàn)證;所述插入片段S，其核苷酸序列為 序列表中SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用甘蔗花葉病毒P3N-PIP0構(gòu)建的亞細(xì)胞定位試劑盒， 其特征在于所述青色熒光蛋白標(biāo)記的PD定位載體pSCMV-P3N-PIP0-CFP的構(gòu)建方法:使用 Xho I和Hind III對載體pSAT6-ECFP-Cl進(jìn)行雙酶切，然后用T4DNA連接酶與插入片段S連 接，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5a中，挑取陽性克隆驗(yàn)證;所述插入片段S，其核苷酸序列為 序列表中SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列。
【文檔編號】C12N15/82GK105823889SQ201610217004
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月8日
【發(fā)明人】楊永慶, 程光遠(yuǎn), 彭磊, 徐倩, 董萌, 徐景升, 翟玉山, 鄧宇晴, 鄭艷茹, 高世武, 郭晉隆
【申請人】福建農(nóng)林大學(xué)