一種同時(shí)顯示肥大細(xì)胞與嗜酸性細(xì)胞的染色方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種同時(shí)顯示肥大細(xì)胞與嗜酸性細(xì)胞的染色方法，采用甲苯胺藍(lán)染色液和改良瑞氏?吉姆薩染色液相結(jié)合的染色方法，在同一張組織學(xué)切片上顯示肥大細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞，肥大細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)紫紅色或藍(lán)紫色，而嗜酸性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)粉色，其他組織結(jié)構(gòu)為藍(lán)色或淡藍(lán)色。本方法解決了分別染色后因位置結(jié)構(gòu)差異難以準(zhǔn)確判定試驗(yàn)結(jié)果的難題，本染色方法不僅直觀性強(qiáng)，而且是在同一個(gè)斷面上顯示，保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
【專利說(shuō)明】
一種同時(shí)顯示肥大細(xì)胞與嗜酸性細(xì)胞的染色方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種同時(shí)顯示肥大細(xì)胞與嗜酸性細(xì)胞的染色方法。
【背景技術(shù)】
[0002]1878年德國(guó)學(xué)者Paul EhrIich首次在大鼠的結(jié)締組織中發(fā)現(xiàn)了肥大細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)所含的具有獨(dú)特染色特點(diǎn)的顆粒。肥大細(xì)胞是一種包含嗜堿性顆粒、參與炎癥和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的多功能效應(yīng)細(xì)胞，而炎癥和免疫反應(yīng)常涉及嗜酸性細(xì)胞、肥大細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等，因此這些指標(biāo)也是科學(xué)研究中用于診斷疾病的重要參考指標(biāo)。肥大細(xì)胞與嗜酸性細(xì)胞染色方法所獲得的信息可有助于診斷、鑒別診斷與這兩種細(xì)胞有關(guān)疾病或病變，有助于分析這兩種細(xì)胞參與的生理調(diào)控反應(yīng)，為進(jìn)行深入的科學(xué)研究提供依據(jù)。因此分析這兩種細(xì)胞的數(shù)量和分布規(guī)律成為科學(xué)研究特別是有關(guān)粘膜免疫首選指標(biāo)，其科學(xué)研究應(yīng)用較為廣泛。
[0003]以往對(duì)嗜酸性細(xì)胞的顯示是采用瑞氏染色方法，關(guān)于肥大細(xì)胞的染色方法常采用甲苯胺藍(lán)染色液、中性紅染色液或阿爾新藍(lán)染色液進(jìn)行染色。雖然楊建平創(chuàng)建了改良的甲苯胺藍(lán)染色方法可以特異性的顯示子宮內(nèi)的肥大細(xì)胞，染色結(jié)果是胞質(zhì)中有紫紅色顆粒分布，但對(duì)這兩種細(xì)胞的顯示仍需要在兩張組織學(xué)切片上分別進(jìn)行染色后才能顯示出來(lái)，不能做到在一張組織學(xué)切片上同時(shí)顯示兩種細(xì)胞，這樣就導(dǎo)致多切片之間位置結(jié)構(gòu)差異影響對(duì)結(jié)果的判斷，減低檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的發(fā)明人針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的情況，結(jié)合長(zhǎng)期研究和探索，創(chuàng)建一種同時(shí)顯示肥大細(xì)胞與嗜酸性細(xì)胞的染色方法。采用甲苯胺藍(lán)染色液和改良瑞氏-吉姆薩染色液相結(jié)合的染色方法，在同一張組織學(xué)切片上顯示肥大細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞，肥大細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)藍(lán)紫色或紫紅色、嗜酸性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)粉色，其他細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)色或淡藍(lán)色。本方法解決了分別染色因位置結(jié)構(gòu)差異難以準(zhǔn)確判定試驗(yàn)結(jié)果的難題，本染色方法不僅直觀性強(qiáng)，而且是在同一個(gè)斷面上顯示，保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
[0005]發(fā)明人提供的具體技術(shù)方案如下:
[0006]—種同時(shí)顯示肥大細(xì)胞與嗜酸性細(xì)胞的染色方法，采用甲苯胺藍(lán)染色液和改良瑞氏-吉姆薩染色液相結(jié)合的染色方法，其中所述的甲苯胺藍(lán)染色液每150毫升配制方法如下:
[0007]配制A液:將1.0-1.2克甲苯胺藍(lán)放入100毫升的蒸餾水內(nèi)，使甲苯胺藍(lán)完全溶于蒸餾水中；
[0008]配制B液:將0.9-1.0克高錳酸鉀放入50毫升的蒸餾水內(nèi)，使高錳酸鉀完全溶于蒸餾水中；
[0009]將已經(jīng)配制好的A液在1000°C電磁爐上煮沸10分鐘，再將配制好的B液慢慢滴入A液中，形成甲苯胺藍(lán)混合染液;將混合染液煮沸10分鐘，使甲苯胺藍(lán)充分被氧化;將經(jīng)過(guò)煮沸的混合染液用蒸餾水補(bǔ)足使該混合染液的總體積為150毫升，室溫下使甲苯胺藍(lán)混合染液自然冷卻，過(guò)濾后即為甲苯胺藍(lán)染色液；
[0010]所述改良瑞氏-吉姆薩染色液配制包括瑞氏染色液的配制和吉姆薩染色液的配置，以及pH 6.4的磷酸緩沖液的配制，具體配制方法如下:
[0011 ]瑞氏染色液的配制:將0.2-0.3克Wright，s色素粉劑倒入100毫升的甲醇中，攪拌使Wright’s色素粉劑完全溶解在甲醇液體中，而后將此溶液放入棕色試劑瓶中保存，室溫放置30天后可以使用；
[0012]之所以瑞氏染色液需要在棕色試劑瓶中保存并室溫放置30天后可以使用，原因在于本發(fā)明中瑞氏染料由伊紅和美藍(lán)的氧化物組成，其溶于甲醇后，解離為帶正電的美藍(lán)和帶負(fù)電的伊紅離子，放置30天以上的時(shí)間可以使染料溶解、分解更充分，有利于其使用，并提尚染色效果；
[0013]吉姆薩染色液的配制:將1.8-2.0克Giemsa，s色素粉劑倒入100毫升的甲醇中，攪拌使Giemsa’s色素完全溶解在甲醇中；另將100毫升的甘油液體在水浴鍋內(nèi)加熱，水浴鍋溫度為58-60 °C，加熱時(shí)間持續(xù)120-140分鐘，將加熱后甘油慢慢加入到上述Giemsa’s色素與甲醇的染液中，將三者充分混勻后再放入37°C恒溫箱中保存10-11小時(shí)，取出混合液體裝入棕色試劑瓶中保存，室溫放置48小時(shí)后可以使用。
[0014]與瑞氏染色液配置后需要放置一定時(shí)間相同，本發(fā)明的吉姆薩染液為天青色素、伊紅、次甲藍(lán)的混合物，染液放置48小時(shí)后，才能保證染料溶解、分解充分，提高其染色效率。
[0015]pH6.4的磷酸緩沖液的配制:將6.63克磷酸二氫鉀和56.0克磷酸氫二鈉粉劑倒入體積為1000毫升的蒸餾水中，攪拌后使磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉完全溶解在蒸餾水中，檢測(cè)溶液的pH值，并用磷酸二氫鉀或磷酸氫二鈉調(diào)整溶液的pH值為6.4。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)中用甲苯胺藍(lán)進(jìn)行肥大細(xì)胞的染色和采用瑞氏染色液對(duì)嗜酸性細(xì)胞進(jìn)行染色是在兩張切片上分別進(jìn)行不同，本發(fā)明首創(chuàng)了對(duì)肥大細(xì)胞與嗜酸性細(xì)胞在同一張組織學(xué)切片上顯示的試驗(yàn)研究，其最主要的不同之處就在于上述提供的染色液，其中本發(fā)明所提供的瑞氏染色液與現(xiàn)有的瑞氏染色液相比，提高了 Wright’s粉的用量，使得瑞氏染色液濃度增大，同時(shí)本發(fā)明增加吉姆薩染色液及pH 6.4的磷酸緩沖液與瑞氏染色液按比例配比使用，目的在于增強(qiáng)對(duì)嗜酸性細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的顯色，提高染色的效果，在顯微鏡下呈現(xiàn)出清晰的粉色，屬于本領(lǐng)域的首次創(chuàng)新使用；
[0017]而對(duì)于甲苯胺藍(lán)染色液而言，本發(fā)明除提高染色液濃度之外，還額外添加了高錳酸鉀，并利用煮沸的方式使甲苯胺藍(lán)充分氧化，染色時(shí)間調(diào)整為3-5秒，減少其他組織結(jié)構(gòu)著色，有利于和嗜酸性細(xì)胞區(qū)分；
[0018]綜合上述幾點(diǎn)改進(jìn)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)肥大細(xì)胞與嗜酸性細(xì)胞在同一張組織學(xué)切片上顯示，填補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)的空白。
[0019]發(fā)明人在上述基礎(chǔ)上更進(jìn)一步的提供了染色的具體步驟為:
[0020]步驟a:石蠟組織學(xué)切片脫蠟后復(fù)水；
[0021]步驟b:嗜酸性細(xì)胞染色；
[0022]步驟c:肥大細(xì)胞染色；
[0023]步驟d:分色；
[0024]步驟e:脫水、透明、封片、觀察。
[0025]其中步驟a:石蠟組織學(xué)切片脫蠟后復(fù)水:
[0026]具體步驟包括:將已經(jīng)制備好厚度為5-8微米的石蠟組織切片經(jīng)過(guò)二甲苯浸泡后除去組織上的石蠟(二甲苯浸泡兩次，每次5-10分鐘)；然后入二甲苯:無(wú)水乙醇(體積比1:1)液體內(nèi)浸泡5-10分鐘；再依次放入無(wú)水乙醇、95 %酒精、90 %酒精、85 %酒精、80 %酒精、70 %酒精、50 %酒精、蒸餾水8種液體內(nèi)分別浸泡5分鐘；
[0027]步驟b:進(jìn)行嗜酸性細(xì)胞染色
[0028]首先制備染色液，將已經(jīng)配制好的吉姆薩染色液、瑞氏染色液和pH6.4的磷酸緩沖液按照體積比為1:5:14的比例進(jìn)行混合形成改良的瑞氏-吉姆薩染色液，用于嗜酸性細(xì)胞染色，將步驟a中在蒸餾水中的組織學(xué)切片放入該染色液中浸泡染色，時(shí)間為10-15分鐘，再入蒸餾水沖洗多余染色液；
[0029]此步驟的判定標(biāo)準(zhǔn):普通光學(xué)顯微鏡下400倍放大觀察組織內(nèi)除嗜酸性細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)被染成分粉色外，其他組織結(jié)構(gòu)均被染成深藍(lán)色即可，而后進(jìn)入步驟c;
[0030]步驟c:進(jìn)行肥大細(xì)胞染色
[0031]將步驟b中在蒸餾水中的組織學(xué)切片放入配制好的甲苯胺藍(lán)染色液浸染3-5秒，馬上入蒸餾水沖洗多余染液；
[0032]此步驟的判定標(biāo)準(zhǔn):普通光學(xué)顯微鏡下400倍放大觀察組織內(nèi)除肥大細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)被染成紫紅色或藍(lán)紫色、嗜酸性細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)被染成粉色外，其他組織結(jié)構(gòu)均被染成深藍(lán)色，而后進(jìn)入步驟d;
[0033]步驟d:分色
[0034]將步驟c中在蒸餾水中的組織學(xué)切片放入95%酒精中浸泡30-60秒，除去多余染料，顯微鏡下觀察分色效果；
[0035]此步驟的判定標(biāo)準(zhǔn):普通光學(xué)顯微鏡下400倍放大觀察組織內(nèi)除嗜酸性細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)染成粉色、肥大細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)被染成紫紅色或藍(lán)紫色外，其他組織結(jié)構(gòu)均被染成藍(lán)色或淡藍(lán)色即可;在該步驟中，需要控制在95%酒精中浸泡的時(shí)間，在上述時(shí)間范圍內(nèi)才能確保上述的結(jié)果準(zhǔn)確無(wú)誤；
[0036]步驟e:脫水、透明、封片、觀察
[0037]將步驟d中在95%酒精中進(jìn)行浸泡分色的組織學(xué)切片馬上放入無(wú)水乙醇中浸泡3-5分鐘，然后放入二甲苯中浸泡3-5分鐘，取出組織學(xué)切片，用中性樹(shù)脂膠將蓋玻片蓋在組織上，到此步驟即完成肥大細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞共顯示的組織學(xué)切片制備。
[0038]將步驟e中完成染色的組織學(xué)切片放在普通光學(xué)顯微鏡下400倍放大觀察，可見(jiàn)到組織內(nèi)分布的肥大細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞。嗜酸性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)染成粉色、肥大細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)被染成紫紅色或藍(lán)紫色外，其他組織結(jié)構(gòu)均被染成藍(lán)色或淡藍(lán)色。
[0039]與現(xiàn)有技術(shù)相比，步驟b的嗜酸性細(xì)胞染色與常規(guī)的嗜酸性細(xì)胞的單獨(dú)染色雖然步驟相同，但本方法的嗜酸性細(xì)胞染色是采用發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)后確定的改良瑞氏-吉姆薩染色液，該染色液的濃度和配制方法均不同于常規(guī)的嗜酸性細(xì)胞單獨(dú)染色，較傳統(tǒng)方法更易于掌握分色時(shí)間，對(duì)嗜酸性細(xì)胞的染色效果更佳。
[0040]步驟c的肥大細(xì)胞染色與常規(guī)的肥大細(xì)胞的單獨(dú)染色步驟上雖然相同，但因?yàn)槭呛褪人嵝约?xì)胞同在一個(gè)切片上顯示，所以本方法的染色液的濃度高于常規(guī)的肥大細(xì)胞的單獨(dú)染色，而染色時(shí)間較常規(guī)的肥大細(xì)胞的單獨(dú)染色短，目的是減少其他組織結(jié)構(gòu)著色過(guò)深影響后期的判定。
[0041]本方法中的步驟b嗜酸性細(xì)胞染色和步驟c肥大細(xì)胞染色順序不能改變，這也是填補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的一大空白之處。
[0042]綜上所述，本發(fā)明的發(fā)明人首次提供了一種同時(shí)顯示肥大細(xì)胞與嗜酸性細(xì)胞的染色方法，采用甲苯胺藍(lán)染色液和改良瑞氏-吉姆薩染色液相結(jié)合的染色方法，在一張組織學(xué)切片上同時(shí)顯示肥大細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞，解決了分別染色造成著色程度不均一及位置結(jié)構(gòu)差異大的難題，本染色方法的直觀性強(qiáng)，而且是在同一個(gè)斷面上顯示。
【附圖說(shuō)明】
[0043]圖1為實(shí)施例1中大鼠子宮內(nèi)肥大細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞共染結(jié)果示意灰度圖，
[0044]圖中細(xì)箭頭為嗜酸性細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)染成粉色;粗箭頭為肥大細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)染成紫紅色或藍(lán)紫色，圖1的放大倍數(shù)為400倍；
[0045]圖2為實(shí)施例2中豬小腸內(nèi)肥大細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞共染結(jié)果示意灰度圖，
[0046]圖中細(xì)箭頭為嗜酸性細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)染成粉色;粗箭頭為肥大細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)染成紫紅色，圖2中的A放大倍數(shù)為1000倍，B放大倍數(shù)為400倍。
【具體實(shí)施方式】
[0047]下述實(shí)施例中除特殊說(shuō)明之外，所采用的均為本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)；
[0048]實(shí)施例1大鼠子宮內(nèi)肥大細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞共染結(jié)果
[0049]—種同時(shí)顯示大鼠子宮內(nèi)肥大細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞的染色方法，采用甲苯胺藍(lán)染色液和改良瑞氏-吉姆薩染色液相結(jié)合的染色方法，其中所述的甲苯胺藍(lán)染色液每150毫升配制方法如下:
[0050]配制A液:將1.0-1.2克甲苯胺藍(lán)放入100毫升的蒸餾水內(nèi)，使甲苯胺藍(lán)完全溶于蒸餾水中；
[0051 ]配制B液:將0.9-1.0克高錳酸鉀放入50毫升的蒸餾水內(nèi)，使高錳酸鉀完全溶于蒸餾水中；
[0052]將已經(jīng)配制好的A液在1000°C電磁爐上煮沸10分鐘，再將配制好的B液慢慢滴入A液中，形成甲苯胺藍(lán)混合染液;將混合染液繼續(xù)煮沸10分鐘，使甲苯胺藍(lán)充分被氧化;將經(jīng)過(guò)煮沸的混合染液用蒸餾水補(bǔ)足使該混合染液的總體積為150毫升，室溫下使甲苯胺藍(lán)混合染液自然冷卻，過(guò)濾后即為甲苯胺藍(lán)染色液；
[0053]所述改良瑞氏-吉姆薩染色液中:
[0054]瑞氏染色液的配制:將0.2-0.3克Wright’s色素粉劑倒入100毫升的甲醇中，攪拌使Wright’s色素粉劑完全溶解在甲醇液體中，而后將此溶液放入棕色試劑瓶中保存，室溫放置30天后可以使用；
[0055]吉姆薩染色液的配制:將1.8-2.0克Giemsa，s色素粉劑倒入100毫升的甲醇中，攪拌使Giemsa’s色素完全溶解在甲醇中；另將100毫升的甘油液體在水浴鍋內(nèi)加熱，水浴鍋溫度為58-60 °C，加熱時(shí)間持續(xù)120-140分鐘，將加熱后甘油慢慢加入到上述Giemsa’s色素與甲醇的染液中，將三者充分混勻后再放入37°C恒溫箱中保存10-11小時(shí)，取出混合液體裝入棕色試劑瓶中保存，室溫放置48小時(shí)后可以使用；
[0056]pH6.4的磷酸緩沖液的配制:將6.63克磷酸二氫鉀和56.0克磷酸氫二鈉粉劑倒入體積為1000毫升的蒸餾水中，攪拌后使磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉完全溶解在蒸餾水中，檢測(cè)調(diào)整溶液的pH值，并用磷酸二氫鉀或磷酸氫二鈉調(diào)整溶液的pH值為6.4。
[0057]所述吉姆薩染色液、瑞氏染色液和pH6.4的磷酸緩沖液按照體積比為1:5:14。
[0058]染色的具體步驟為:
[0059]步驟a:將已經(jīng)制備好厚度為5-8微米大鼠子宮組織石蠟切片脫蠟后復(fù)水；
[0060]步驟b:將步驟a中在蒸餾水中的子宮組織學(xué)切片放入已經(jīng)配制好的改良的瑞氏-吉姆薩染色液中浸泡染色10-15分鐘，用蒸餾水洗去多余染色液;此步驟的判定標(biāo)準(zhǔn):普通光學(xué)顯微鏡下觀察子宮組織內(nèi)除嗜酸性細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)被染成粉色外，其他組織結(jié)構(gòu)均被染成藍(lán)色，即完成嗜酸性細(xì)胞染色，而后進(jìn)入步驟c;
[0061]步驟c:將步驟b中在蒸餾水中的子宮組織學(xué)切片放入配制好的甲苯胺藍(lán)染色液浸染3-5秒，立即入蒸餾水沖洗多余染液;此步驟的判定標(biāo)準(zhǔn):普通光學(xué)顯微鏡下觀察組織內(nèi)除肥大細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)被染成紫紅色或藍(lán)紫色、嗜酸性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)被染成粉色外，子宮內(nèi)的其他組織結(jié)構(gòu)均是深藍(lán)色，即完成肥大細(xì)胞染色，而后進(jìn)入步驟d;
[0062]步驟d:分色:將步驟c中在蒸餾水中的組織學(xué)切片放入95%酒精中浸泡30-60秒，除去多余染料，顯微鏡下觀察分色效果;此步驟的判定標(biāo)準(zhǔn):普通光學(xué)顯微鏡下觀察子宮組織內(nèi)除嗜酸性細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)染成粉色、肥大細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)被染成紫紅色或藍(lán)紫色外，其他組織結(jié)構(gòu)均被染成藍(lán)色或淡藍(lán)色即完成分色；
[0063]步驟e:脫水、透明、封片、觀察
[0064]將步驟d中在95%酒精中進(jìn)行浸泡分色的組織學(xué)切片里立即放入無(wú)水乙醇中浸泡3-5分鐘，然后放入二甲苯中浸泡3-5分鐘，取出子宮組織學(xué)切片，用中性樹(shù)脂膠將蓋玻片蓋在組織上，到此步驟即完成肥大細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞共顯示的組織學(xué)切片制備。
[0065]將步驟e中完成染色的子宮組織學(xué)切片放在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，可見(jiàn)到組織內(nèi)分布的肥大細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞:嗜酸性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)被染成粉色、肥大細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)被染成紫紅色或藍(lán)紫色外，其他組織結(jié)構(gòu)均被染成藍(lán)色或淡藍(lán)色(如圖1所示)。
[0066]實(shí)施例2豬小腸內(nèi)肥大細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞共染結(jié)果
[0067]一種同時(shí)顯示豬小腸內(nèi)肥大細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞的染色方法，采用甲苯胺藍(lán)染色液和改良瑞氏-吉姆薩染色液相結(jié)合的染色方法，其中所述的甲苯胺藍(lán)染色液每150毫升配制方法如下:
[0068]配制A液:將1.0-1.2克甲苯胺藍(lán)放入100毫升的蒸餾水內(nèi)，使甲苯胺藍(lán)完全溶于蒸餾水中；
[0069]配制B液:將0.9-1.0克高錳酸鉀放入50毫升的蒸餾水內(nèi)，使高錳酸鉀完全溶于蒸餾水中；
[0070]將已經(jīng)配制好的A液在1000°C電磁爐上煮沸10分鐘，再將配制好的B液慢慢滴入A液中，形成甲苯胺藍(lán)混合染液;將混合染液繼續(xù)煮沸10分鐘，使甲苯胺藍(lán)充分被氧化;將經(jīng)過(guò)煮沸的混合染液用蒸餾水補(bǔ)足使該混合染液的總體積為150毫升，室溫下使甲苯胺藍(lán)混合染液自然冷卻，過(guò)濾后即為甲苯胺藍(lán)染色液；[0071 ]所述改良瑞氏-吉姆薩染色液中:
[0072]瑞氏染色液的配制:將0.2-0.3克Wright’s色素粉劑倒入100毫升的甲醇中，攪拌使Wright’s色素粉劑完全溶解在甲醇液體中，而后將此溶液放入棕色試劑瓶中保存，室溫放置30天后可以使用；
[0073]吉姆薩染色液的配制:將1.8-2.0克Giemsa，s色素粉劑倒入100毫升的甲醇中，攪拌使Giemsa’s色素完全溶解在甲醇中；另將100毫升的甘油液體在水浴鍋內(nèi)加熱，水浴鍋溫度為58-60 °C，加熱時(shí)間持續(xù)120-140分鐘，將加熱后甘油慢慢加入到上述Giemsa’s色素與甲醇的染液中，將三者充分混勻后再放入37°C恒溫箱中保存10-11小時(shí)，取出混合液體裝入棕色試劑瓶中保存，室溫放置48小時(shí)后可以使用；
[0074]pH6.4的磷酸緩沖液的配制:將6.63克磷酸二氫鉀和56.0克磷酸氫二鈉粉劑倒入體積為1000毫升的蒸餾水中，攪拌后使磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉完全溶解在蒸餾水中，檢測(cè)調(diào)整溶液的pH值，并用磷酸二氫鉀或磷酸氫二鈉調(diào)整溶液的pH值為6.4。
[0075]所述吉姆薩染色液、瑞氏染色液和pH6.4的磷酸緩沖液按照體積比為1:5:14。
[0076]染色的具體步驟為:
[0077]步驟a:將已經(jīng)制備好厚度為5-8微米豬小腸組織石蠟切片脫蠟后復(fù)水；
[0078]步驟b:將步驟a中在蒸餾水中的小腸組織學(xué)切片放入已經(jīng)配制好的改良的瑞氏_吉姆薩染色液中浸泡染色10-15分鐘，用蒸餾水洗去多余染色液，此步驟的判定標(biāo)準(zhǔn):普通光學(xué)顯微鏡下觀察小腸組織內(nèi)除嗜酸性細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)被染成粉色外，其他組織結(jié)構(gòu)均被染成藍(lán)色，即完成嗜酸性細(xì)胞染色，而后進(jìn)入步驟c;
[0079]步驟c:將步驟b中在蒸餾水中的小腸組織學(xué)切片放入配制好的甲苯胺藍(lán)染色液浸染3-5秒，立即入蒸餾水沖洗多余染液，此步驟的判定標(biāo)準(zhǔn):普通光學(xué)顯微鏡下觀察組織內(nèi)除肥大細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)被染成紫紅色、嗜酸性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)被染成粉色外，小腸內(nèi)的其他組織結(jié)構(gòu)均是深藍(lán)色，即完成肥大細(xì)胞染色，而后進(jìn)入步驟d;
[0080]步驟d:分色。將步驟c中在蒸餾水中的組織學(xué)切片放入95%酒精中浸泡30-60秒，除去多余染料，顯微鏡下觀察分色效果。此步驟的判定標(biāo)準(zhǔn):普通光學(xué)顯微鏡下觀察小腸組織內(nèi)除嗜酸性細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)染成粉色、肥大細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)被染成紫紅色或藍(lán)紫色外，其他組織結(jié)構(gòu)均被染成藍(lán)色或淡藍(lán)色即完成分色；
[0081]步驟e:脫水、透明、封片、觀察
[0082]將步驟d中在95%酒精中進(jìn)行浸泡分色的組織學(xué)切片里立即放入無(wú)水乙醇中浸泡3-5分鐘，然后放入二甲苯中浸泡3-5分鐘，取出小腸組織學(xué)切片，用中性樹(shù)脂膠將蓋玻片蓋在組織上，到此步驟即完成肥大細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞共顯示的組織學(xué)切片制備。
[0083]將步驟e中完成染色的小腸組織學(xué)切片放在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，可見(jiàn)到組織內(nèi)分布的肥大細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞:嗜酸性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)被染成粉色、肥大細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)被染成紫紅色，其他組織結(jié)構(gòu)均被染成藍(lán)色或淡藍(lán)色(如圖2所示)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種同時(shí)顯示肥大細(xì)胞與嗜酸性細(xì)胞的染色方法，其特征在于:采用甲苯胺藍(lán)染色液和改良瑞氏-吉姆薩染色液相結(jié)合的染色方法，其中所述的甲苯胺藍(lán)染色液每150毫升配制方法如下: 配制A液:將1.0-1.2克甲苯胺藍(lán)放入100毫升的蒸餾水內(nèi)，使甲苯胺藍(lán)完全溶于蒸餾水中； 配制B液:將0.9-1.0克高錳酸鉀放入50毫升的蒸餾水內(nèi)，使高錳酸鉀完全溶于蒸餾水中； 將已經(jīng)配制好的A液在1000°C電磁爐上煮沸10分鐘，再將配制好的B液慢慢滴入A液中，形成甲苯胺藍(lán)混合染液;將混合染液繼續(xù)煮沸10分鐘，使甲苯胺藍(lán)充分被氧化;將經(jīng)過(guò)煮沸的混合染液用蒸餾水補(bǔ)足使該混合染液的總體積為150毫升，室溫下使甲苯胺藍(lán)混合染液自然冷卻，過(guò)濾后即為甲苯胺藍(lán)染色液； 所述改良瑞氏-吉姆薩染色液配制包括瑞氏染色液的配制和吉姆薩染色液的配置，以及pH 6.4的磷酸緩沖液的配制，具體配制方法如下: 瑞氏染色液的配制:將0.2-0.3克Wright’s色素粉劑倒入100毫升的甲醇中，攪拌使Wright’s色素粉劑完全溶解在甲醇液體中，而后將此溶液放入棕色試劑瓶中保存，室溫放置30天后可以使用； 吉姆薩染色液的配制:將1.8-2.0克Giemsa，s色素粉劑倒入100毫升的甲醇中，攪拌使Giemsa，s色素完全溶解在甲醇中；另將100毫升的甘油液體在水浴鍋內(nèi)加熱，水浴鍋溫度為58-60°C，加熱時(shí)間持續(xù)120-140分鐘，將加熱后甘油慢慢加入到上述Giemsa’s色素與甲醇的染液中，將三者充分混勻后再放入37 0C恒溫箱中保存10-11小時(shí)，取出混合液體裝入棕色試劑瓶中保存，室溫放置48小時(shí)后可以使用； PH6.4的磷酸緩沖液的配制:將6.63克磷酸二氫鉀和56.0克磷酸氫二鈉粉劑倒入體積為1000毫升的蒸餾水中，攪拌后使磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉完全溶解在蒸餾水中，檢測(cè)溶液的pH值，并用磷酸二氫鉀或磷酸氫二鈉調(diào)整溶液的pH值為6.4。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時(shí)顯示肥大細(xì)胞與嗜酸性細(xì)胞的染色方法，其特征在于:吉姆薩染色液、瑞氏染色液和PH 6.4的磷酸緩沖液按照體積比為1:5:14。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時(shí)顯示肥大細(xì)胞與嗜酸性細(xì)胞的染色方法，其特征在于:染色的具體步驟為: 步驟a:石蠟組織學(xué)切片脫蠟后復(fù)水； 步驟b:嗜酸性細(xì)胞染色； 步驟c:肥大細(xì)胞染色； 步驟d:分色； 步驟e:脫水、透明、封片、觀察； 其中步驟b:嗜酸性細(xì)胞染色時(shí)使用改良瑞氏-吉姆薩染色液;步驟c:肥大細(xì)胞染色使用甲苯胺藍(lán)染色液染色。
【文檔編號(hào)】G01N1/30GK105842037SQ201610160520
【公開(kāi)日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年3月21日
【發(fā)明人】黃麗波, 姜淑貞, 袁學(xué)軍
【申請(qǐng)人】山東農(nóng)業(yè)大學(xué)