煙曲霉Asp f 3的線性抗原表位最小基序肽Asp f 3^123-127及其擴(kuò)展短肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體為煙曲霉Asp f 3的線性抗原表位最小基序肽及其擴(kuò)展短肽。本發(fā)明的煙曲霉Asp f 3的線性抗原表位最小基序肽為Asp f 3123?127，最小基序肽的擴(kuò)展短肽為Asp f 3119?127、Asp f 3120?128、Asp f 3121?129、Asp f 3122?130和Asp f 3123?131，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1~SEQ ID No. 6所示。它們可作為抗原單獨(dú)或組合用于特異檢測(cè)煙曲霉感染患者血清。
【專利說(shuō)明】
煙曲霉Asp f 3的線性抗原表位最小基序肽Asp f 3123—127及其擴(kuò)展短肽
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及導(dǎo)致侵襲性曲霉病、變應(yīng)性支氣管炎和曲霉腫發(fā)生的煙曲霉主要抗原蛋白Asp f 3的線性B細(xì)胞表位(B cell epitope, BCE，或稱抗原表位或決定簇)及其最小基序肽，以及這些表位基序肽的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]煙曲霉(Aspergillus fumigatus)是一種廣泛存在于自然界中的條件致病菌，易感人群吸入其孢子，定植于肺部，從而產(chǎn)生三種曲霉病:導(dǎo)致咯血的曲霉腫、導(dǎo)致肺纖維化的變應(yīng)性支氣管炎和具有較高死亡率的侵襲性曲霉病(Warris A，et al.The b1logy ofpulmonary aspergillus infect1ns.J Infect, 69 Suppl 1:S36-41，2014)。
[0003]血清免疫學(xué)指標(biāo)對(duì)于曲霉病的診斷非常重要(Chabi ML, et al.Pulmonaryaspergillosis.Diagn Interv Imaging, 96(5):435-42,2015)oGM(Galactomannan，半乳甘露聚糖)和BG((l，3)-13-D-gluCanS，(l，3)-13-D -葡聚糖)是煙曲霉細(xì)胞壁的多糖成分，隨著孢子的萌發(fā)和菌絲體的生長(zhǎng)而進(jìn)入宿主的血循環(huán)，因此可分別用GM和BG單抗檢測(cè)血清中相應(yīng)的循環(huán)抗原，為目前臨床上診斷煙曲霉感染的常用方法，但在特異性和靈敏度方面存在一定的局限性(廖萬(wàn)清.侵襲性真菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，25(7): 503-506，2010)。已有的研究表明利用煙曲霉免疫原性強(qiáng)的體外重組蛋白，可以檢測(cè)感染者血清中相應(yīng)的循環(huán)抗體，但單個(gè)重組蛋白同樣在特異性和靈敏度方面存在一定的局限性(SarfatiJ,et al.Recombinant antigens as diagnostic markers for aspergillosis.DiagnMicrobil infect Dis, 55(4): 279-91，2006)。一個(gè)蛋白抗原的長(zhǎng)表位肽可能與其它抗原蛋白的抗體起交叉反應(yīng)，因此鑒定蛋白抗原表位的最小基序可以提高檢測(cè)的特異性;將多個(gè)蛋白抗原表位的最小基序組成嵌合肽可以提高檢測(cè)的靈敏度。
[0004]Asp f 3作為變應(yīng)原之一，功能為過(guò)氧化物酶體蛋白，其命名由世界衛(wèi)生組織和國(guó)際免疫學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)變應(yīng)原命名分委員會(huì)(World Health Organizat1n andInternat1nal Un1n of Immunological Societies (WH0/IUIS) AllergenNomenclature Sub-committee)批準(zhǔn)同意(http: //www.al lergen.0rg/search.php?TaxSource=Fungi Ascomycota)。人體感染煙曲霉后，免疫系統(tǒng)產(chǎn)生相應(yīng)的抗Asp f 3的IgG、IgE 和 IgA 抗體(Kurup VP , et al.Specific antibodies to recombinantallergens of Aspergillus fumigatus in cystic fibrosis patients with ΑΒΡΑ.Cl inMol Allergy，4:11，2006)。鑒定Asp f 3的抗原表位最小基序，將其和煙曲霉其它抗原表位肽的最小表位基序構(gòu)建檢測(cè)血清嵌合肽，有助于提高診斷煙曲霉感染的特異性和靈敏度。因此，我們用大腸桿菌表達(dá)Asp f 3，經(jīng)鎳柱純化后免疫新西蘭白兔，得到Asp f 3抗血清。用改良的生物合成肽策略表達(dá)相互重疊9個(gè)氨基酸殘基、覆蓋Asp f 3全長(zhǎng)的18肽融合蛋白，繼而用Asp f 3抗血清進(jìn)行免疫印跡，鑒定陽(yáng)性18肽;對(duì)陽(yáng)性18肽進(jìn)一步構(gòu)建相互重疊8個(gè)氨基酸殘基的9肽融合蛋白，鑒定最小表位基序(Xu, et al.Minimal motif mappingof a known epitope on human zona pellucida protein-4 using peptideb1synthesis strategy.J Reprod Immunol, 81: 9-16, 2009)0

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供煙曲霉Aspf 3蛋白的抗原表位最小基序肽，并提供含有所述最小基序肽的擴(kuò)展短肽，同時(shí)提供含所述基序肽的短肽的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明提供的煙曲霉Aspf 3蛋白的線性抗原表位最小基序妝，其氣基酸序列為SEQ ID N0.1所示，記為Asp f 3123—m，一字簡(jiǎn)寫(xiě)的氨基酸序列為:IGWAD。
[0007]本發(fā)明還提供煙曲霉Aspf 3蛋白的線性抗原表位最小基序肽Asp f 3123—127的擴(kuò)展短肽(9肽)，其序列如SEQ.1D N0.2— SEQ.1D Νο.6所示，其中:
SEQ.1D N0.2-XiX2X3X4IGWAD,記為Asp f 3119—127。
[0008]其中乂1是？，乂2是S，X3是K，X4是S，為最小基序Aspf 3123—127擴(kuò)展殘基，在化學(xué)合成或融合表達(dá)9肽融合蛋白的場(chǎng)合，擴(kuò)展的殘基部分可增刪或用其它殘基替代。
[0009]SEQ.1D N0.3:XiX2X3lGWADX4，記為Asp f 312°—128。其中Xi是S，X2是K，X3是S，X4是E，為最小基序Asp f 3123—127擴(kuò)展殘基，在化學(xué)合成或融合表達(dá)9肽融合蛋白的場(chǎng)合，擴(kuò)展的殘基部分可增刪或用其它殘基替代。
[0010]SEQ.1D N0.4:XiX2IGWADX3X4,記為Asp f 3121—129。其中Xi是K，X2是S，X3是E，X4是E，為最小基序Asp f 3123—127擴(kuò)展殘基，在化學(xué)合成或融合表達(dá)9肽融合蛋白的場(chǎng)合，擴(kuò)展的殘基部分可增刪或用其它殘基替代。
[0011]SEQ.1D N0.5:XiIgwadX2X3X4JBSasp f 3122—13°。其中Xi是S，X2是E，X3是E，X4是G，為最小基序Asp f 3123—127擴(kuò)展殘基，在化學(xué)合成或融合表達(dá)9肽融合蛋白的場(chǎng)合，擴(kuò)展的殘基部分可增刪或用其它殘基替代。
[0012]SEQ.1D N0.6:1GWADXiX2X3X4，記為Asp f 3123—131。其中Xi是E，X2是E，X3是G，X4是R，為最小基序Asp f 3123—127擴(kuò)展殘基，在化學(xué)合成或融合表達(dá)9肽融合蛋白的場(chǎng)合，擴(kuò)展的殘基部分可增刪或用其它殘基替代。
[0013]本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)一步具體描述如下:
1.根據(jù)煙曲霉Af293菌株的Aspf 3 (NCBI access1n No:XP_747849)的蛋白序列，依據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性，全合成Asp f 3編碼基因，從EcoR I和Hind ΙΠ酶切位點(diǎn)克隆于pET-21 (b+)質(zhì)粒，構(gòu)建pET-21 (b)-Asp f 3重組質(zhì)粒；將C端帶有6 XHis標(biāo)簽的重組質(zhì)粒pET-21 (b)-Asp f 3轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)，誘導(dǎo)表達(dá)得到重組Asp f 3蛋白；通過(guò)鎳柱親和層析后獲得純化Asp f 3蛋白；純化Asp f 3蛋白免疫新西蘭白兔，得到高特異性兔抗Aspf 3抗血清(圖1);
2.用pXXGST-Ι融合表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建相互重疊9個(gè)氨基酸殘基、覆蓋Aspf 3全長(zhǎng)的GST-18肽融合蛋白(Xu, et al.Minimal motif mapping of a known epitope on humanzona pellucida protein-4 using peptide b1synthesis strategy.J ReprodImmunol, 81: 9-16，2009)。繼而用兔Asp f 3抗血清進(jìn)行免疫印跡，鑒定得到其中的一個(gè)陽(yáng)性18肽:Asp f 3118—135忖81^丨8￥3(16681^10^(圖2)。構(gòu)建相互重疊8個(gè)氨基酸殘基、覆蓋Asp f 3118—135的GST-9肽融合蛋白，免疫印跡鑒定得到5個(gè)陽(yáng)性9肽:Asp f 3119—127FSKSIGffAD^Asp f 312?！?28SKSIGWADE、Asp f 3121—129KSIGWADEE、Asp f 3122—13°SIGWADEEG和Asp f 3123—131Igwadeegr，其共有序列Asp f 3123—127Igwad為Asp f 3抗原最小表位基序肽(圖 3)。
[0014]本發(fā)明所述的表位最小基序肽Aspf 3123—127可用于制備作為臨床診斷由煙曲霉感染導(dǎo)致侵襲性曲霉病、變應(yīng)性支氣管炎和曲霉腫血清識(shí)別表位標(biāo)志物。
[0015]本發(fā)明所述的表位最小基序肽的擴(kuò)展短肽Aspf 3119—m、Asp f 312Q—128、Asp f3m—129、Asp f 3122—13(3和Asp f 3123—131單獨(dú)或組合用于制備作為臨床診斷由煙曲霉感染導(dǎo)致侵襲性曲霉病、變應(yīng)性支氣管炎和曲霉腫血清識(shí)別表位標(biāo)志物。
【附圖說(shuō)明】
[0016]
圖1兔抗Asp f 3抗血清ELISA結(jié)果。I號(hào)、2號(hào)、3號(hào)和4號(hào)為Asp f 3免疫兔血清，對(duì)照為免疫前兔血清。
[0017]圖2Asp f 3 18肽融合蛋白電泳和免疫印跡圖。上方藍(lán)色條帶為電泳圖譜，下方黑色條帶為免疫印跡圖譜。O號(hào)泳道為pXXGST-2表達(dá)的GST188，I至18號(hào)泳道為跨域Asp f 3全長(zhǎng)、相互重疊9個(gè)氨基酸殘基的18肽與GST188融合蛋白；由于Asp f 3全長(zhǎng)168aa，故18號(hào)泳道為Asp f 3154—168。其中14號(hào)泳道免疫印跡陽(yáng)性條帶為Asp f 3118—135。
[0018]圖3f 3123—127最小表位肽基序免疫印跡圖。14-1表示Asp f 3118—126，14-2表示Aspf 3119—127，14-3表示Asp f 312°—128，14-4表示Asp f 3121—129，14-5表示Asp f 3122—13°，14-6表示Asp f 3123—131，14-7表示Asp f 3124—132，箭頭表示免疫印跡反應(yīng)陽(yáng)性條帶。最小表位肽基序?yàn)閒 3123—127IGWAD。
【具體實(shí)施方式】
[0019]本發(fā)明可進(jìn)一步通過(guò)下列實(shí)例描述。這些例子并不意味限制本發(fā)明所涉及的范圍，該范圍在之前的描述中已被充分陳述闡明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，均按照常規(guī)條件以及[美]J.薩姆布魯克和D.W.拉塞爾編著黃培堂等翻譯的第三版“分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”(科學(xué)出版社，2002)和[美]E.哈洛和D.萊恩編著沈關(guān)心等翻譯的“抗體技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南”(科學(xué)出版社，2002)中所述的步驟，或按照生產(chǎn)銷(xiāo)售商建議的條件進(jìn)行。
[0020]材料和方法:
1.pET-21 (b+)質(zhì)粒和E.coli BL21(DE3)菌株購(gòu)自德國(guó)Novagen公司，熱誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒pXXGST-Ι和對(duì)照質(zhì)粒pXXGST-2由本專利發(fā)明人構(gòu)建(專利號(hào):200710173305.2);
2.限制性內(nèi)切酶EcoRKBamH 1、Sal I購(gòu)自美國(guó)New England B1labs公司，DL2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，T4 DNA連接酶和預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自美國(guó)Thermo-Fermentas公司，小鼠6 X His單克隆抗體和弗氏完全佐劑以及弗氏不完全佐劑購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz B1technology公司，0.2umPVDF膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，ECL化學(xué)發(fā)光顯色液購(gòu)自美國(guó)GE公司；
3.Gel Extract1n凝膠回收試劑盒和Plasmid Mini質(zhì)粒小量抽提試劑盒購(gòu)于美國(guó)Omega公司；
4.新西蘭白兔購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司； 5.Asp f 3基因全由上海旭冠生物科技發(fā)展有限公司合成。兩端分別為BamH I和SalI粘性末端，中間為覆蓋Asp f 3全長(zhǎng)且相互重疊9個(gè)氨基酸殘基的18肽編碼DNA序列加TAA終止密碼子的正負(fù)鏈DNA片段以及覆蓋免疫印跡反應(yīng)18肽且相互重疊8個(gè)氨基酸殘基的9肽編碼DNA序列加TAA終止密碼子的正負(fù)鏈DNA片段由上海杰李生物技術(shù)有限公司合成。DNA重組子測(cè)序由上海睿迪生物科技有限公司完成。
[0021]Asp f 3123—127最小表位肽基序鑒定的具體步驟如下:
1.煙曲霉Asp f 3的表達(dá)與純化
1.1表達(dá)載體pET-21(b)-Asp f 3的構(gòu)建
根據(jù)煙曲霉Af293菌株的Asp f 3CNCBI access1n No:XP_747849)的蛋白序列，依據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性，由上海旭冠生物科技發(fā)展有限公司全合成基因，分別從EcoR I和Hind ΙΠ酶切位點(diǎn)克隆于pET-21 (b+)，構(gòu)建pET-21 (b)-Asp f 3重組質(zhì)粒，Asp f 3蛋白的全長(zhǎng)為168個(gè)氨基酸。
[0022]1.2 重組Asp f 3表達(dá)
將C端帶有6 XHis標(biāo)簽的重組質(zhì)粒pET-21 (b)-Asp f 3取IyL(約lOOng/yL)轉(zhuǎn)化到1yL大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min后42°C熱激90s，冰上冷卻5min，加入900ULLB液體培養(yǎng)基37°C復(fù)蘇40min?60min，最后10000r/min離心Imin棄去約800 yL培養(yǎng)基，其余混勻后涂氨芐青霉素抗性的LB平板。待菌液被培養(yǎng)基吸收后37 °C倒置培養(yǎng)16?24h。
[0023]挑取單克隆菌落于含SOyg/mL氨芐青霉素的3mLLB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。翌日，按照1: 50的比例將過(guò)夜菌轉(zhuǎn)接至新的3mL LB液體培養(yǎng)基中，氨芐青霉素的工作濃度不變，37°C培養(yǎng)約2.5?3K0D600為0.6?0.8)后，取出ImL菌液樣本作為誘導(dǎo)前對(duì)照，其余菌液加入終濃度為ImM的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，表達(dá)條件為37°C培養(yǎng)4h。取500 yL誘導(dǎo)后菌液樣本，10000r/min離心5min，收集菌體，用150yL I X PBS緩沖液溶菌，并加入50 pL 4XSDS-PAGE Loading Buffer混勾，沸水煮樣7?1min保存待用。
[0024]配制2塊相同的12%的SDS-PAGE膠，按照同樣的順序(蛋白分子量marker—誘導(dǎo)前全菌蛋白—誘導(dǎo)后全菌蛋白)和同樣的上樣量(5 nL)在同一電泳系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。電泳完成后，其中一塊膠用于考馬斯亮藍(lán)R250染色分析誘導(dǎo)表達(dá)條帶，另一塊用小鼠6 X把8單克隆抗體為一抗、!11^標(biāo)記的羊抗鼠]^6為二抗進(jìn)行￥68七61'11-13101:驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明成功表達(dá)了重組Asp f 3蛋白。
[0025]1.3重組Asp f 3蛋白的純化
選取表達(dá)量高的單克隆菌株作為保種菌。取保種菌1yL接入50mL含50ug/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中37 °C培養(yǎng)過(guò)夜。次日，按照1:50的比例將菌液轉(zhuǎn)入500mL含50μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，用ImM IPTG誘導(dǎo)4h，5000r/min 4°C離心5min，棄去培養(yǎng)基收集菌體。菌體稱重(事先稱好500mL塑料瓶的重量)后，加入菌體重量10陪的I Xstartbuffer(Ig菌體加1mL I X start buffer ； start buffer: 5OmM Na2HP04/NaH2P04，pH8.0，300mM NaCl，1mM咪唑，ImM β_巰基乙醇)，重懸菌體。用高壓細(xì)胞破碎機(jī)在合適的壓力下破菌，重復(fù)破菌3次后，4°C、15000rpm離心30分鐘，收集上清。5mL His Trap HP預(yù)裝柱事先用5倍柱體積的純水沖凈，并以5倍柱體積以上的Start Buffer平衡。上樣完畢后，以StartBuffer沖洗柱子，去除未吸附的蛋白。以含40 mM咪卩坐濃度的Start Buffer沖洗柱子，盡量去除雜蛋白，隨后設(shè)置 15mL 長(zhǎng)度，12%-100% Elut1n Buffer (50mM Na2HPO4ZNaH2PO4,300mM NaCl，250mM咪唑，pH 8.0)洗脫，收集目的蛋白。與此同時(shí)將pET_21(b)空質(zhì)粒作為陰性對(duì)照與實(shí)驗(yàn)重組質(zhì)粒pET-21 (b)-Asp f 3做平行實(shí)驗(yàn)，并收集兩個(gè)空質(zhì)粒的誘導(dǎo)前菌體及IPTG誘導(dǎo)4h后菌體，用于SDS-PAGE電泳。
[0026]分別收集全菌液、上清和純化產(chǎn)物20ul，加入工作濃度為I X SDS Loading BufferLoading混勻，煮沸5min，冷卻后取10 yL上樣，用于變性SDS-PAGE電泳檢測(cè)。將蛋白條帶和預(yù)計(jì)分子量測(cè)吻合，純度達(dá)到80%以上的樣品合并，并進(jìn)行超濾、濃縮處理，用Bradford法估測(cè)純化后蛋白濃度。用像素計(jì)算軟件估測(cè)詳細(xì)的純化蛋白的純度。
[0027]2.兔抗重組蛋白Asp f 3抗血清的制備
取Img Asp f 3純化蛋白與等體積弗氏完全佐劑乳化后皮下注射新西蘭白兔，進(jìn)行初次免疫;3周后取0.5mg Asp f 3純化蛋白與等體積弗氏不完全佐劑乳化后皮下注射新西蘭白兔，進(jìn)行第一次加強(qiáng)免疫；2周后取0.5mg Asp f 3純化蛋白與等體積弗氏不完全佐劑乳化后皮下注射新西蘭白兔，進(jìn)行第二次加強(qiáng)免疫;第二次加強(qiáng)免疫一周后，在實(shí)驗(yàn)兔子的耳緣靜脈取血約3?5mL，離心得到抗血清，ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)后備用。
[0028]3.Asp f 3123—127最小表位肽基序鑒定
3.1Asp f 3118—135陽(yáng)性表位肽鑒定
依據(jù)Asp f 3基因序列公開(kāi)信息，設(shè)計(jì)跨越Asp f 3全序列的系列相互重疊9個(gè)氨基酸殘基的18肽編碼DNA正負(fù)鏈片段(正鏈5，-端加5，-gatcc, 3，-端加taag-3，；負(fù)鏈5，-端加5，-tcgactta，3 ’ -端加g_3’ )，外送DNA合成。將I或2個(gè)OD的互補(bǔ)正負(fù)鏈片段用ddifcO溶解成20 μmol/tiL儲(chǔ)存液(根據(jù)DNA合成報(bào)告單數(shù)據(jù))，各取10 yL儲(chǔ)存液和20 (1詘20于1.5 mLEppendorf管中，94°C水浴加熱5 min，自然降至室溫后，在15 yL反應(yīng)體積中吸入2 yL退火片段、I pL約200 ng/yL經(jīng)BamH I和Sal I雙酶切的pXXGST-Ι質(zhì)粒、I yL T4 DNA連接酶和其1.5 yL緩沖液，連接過(guò)夜;連接液轉(zhuǎn)化感受態(tài)BL21 (DE3)宿主菌，涂布含Amp的LB平板上，于37°C培養(yǎng)過(guò)夜;第二天挑取氨芐LB平板上長(zhǎng)出的單克隆轉(zhuǎn)接3 mL LB培養(yǎng)液誘導(dǎo)表達(dá)，以由pXXGST-2表達(dá)的GST188蛋白為對(duì)照，各表達(dá)的GST188-18肽融合蛋白經(jīng)15% SDS-PAGE分析確認(rèn)(與對(duì)照蛋白電泳迀移率相差約2 kDa)，挑取各重組克隆外送進(jìn)行DNA測(cè)序。將插入片段測(cè)序結(jié)果正確的克隆接種加入Amp的3 mL LB培養(yǎng)液中，于30°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，翌日晨按1/50比例轉(zhuǎn)接新鮮含Amp的LB培養(yǎng)液中，30°C振蕩培養(yǎng)2?3 h至菌體濃度達(dá)到0.6?
0.8 OD后，調(diào)高溫度至42°C熱誘導(dǎo)4 h，離心收集菌體，加上樣裂解液煮沸5 min，進(jìn)行15%SDS-PAGE。用兔抗Asp f 3抗血清為一抗，羊抗兔IgG /HRP為二抗，進(jìn)行免疫印跡。Asp f3118-135為陽(yáng)性表位肽之一。
[0029]3.2 Asp f 3123—127最小表位基序肽鑒定
以pXXGST-Ι為表達(dá)載體，構(gòu)建表達(dá)跨越Asp f 3118—135、相互重疊8個(gè)氨基酸殘基的系列9肽GST188融合蛋白，用兔抗Asp f 3抗血清為一抗，羊抗兔IgG /HRP為二抗，進(jìn)行免疫印跡，Asp f 3119—127 FSKSIGffAD^Asp f 3120—128SKSIGWADE、Asp f 3121—129KSIGWADEE、Asp f3122—13Qsigwadeeg和Asp f 3123—131Igwadeegr為陽(yáng)性表位肽，其共有序列Asp f 3123—127Igwad為Asp f 3抗原最小表位基序肽。
[0030]應(yīng)用例
應(yīng)用Asp f 3119—127、Asp f 312°—128、Asp f 3121—129、Asp f 3122—13t^PAsp f 3123—131 檢測(cè)血清中Asp f 3抗體 1.用Asp f 3蛋白免疫新西蘭白兔后取血清，以免疫前血清為對(duì)照，4只實(shí)驗(yàn)兔的Aspf 3抗體滴度均達(dá)到1.28 X 15以上(圖1)，用于后續(xù)免疫印跡反應(yīng)。
[0031]2.以pXXGST-Ι為載體，表達(dá)Asp f 3118-126、Asp f 3119-127、Asp f 3120-128、Asp f3121-129、Asp f 3122-13Q、Asp f 131 和Asp f 3124—132融合蛋白。
[0032]3.表達(dá)的Asp f 3118—126、Asp f 3119—m、Asp f 312。—128、Asp f 3121—129、Asp f 3122一 13°、Asp f 3123—131 和Asp f 3124—132融合蛋白進(jìn)行 15% SDS-PAGE電泳。
[0033]4.將電泳凝膠蛋白條帶電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，印跡膜用封閉液(TBSTMgf閉后，用封閉緩沖液(TBST)洗膜，然后以一定比例稀釋的實(shí)驗(yàn)兔血清為一抗，4°C振蕩孵育過(guò)夜。
[0034]4.次日，用TBST洗膜后將印跡膜置于TBSTM中，加入一定比例稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，室溫震蕩孵育1.5h。用TBST洗膜3遍后將膜置于TBS緩沖液中，加入ECL化學(xué)發(fā)光劑，約Imin后進(jìn)行曝光，判斷檢測(cè)結(jié)果。包含最小表位基序肽Asp f 3123—mIGWAD的Aspf 3119—m、Asp f 312°—128、Asp f 3121—129、Asp f 3122—13t^PAsp f 3123—131 印跡反應(yīng)為陽(yáng)性；而Asp f 3118—126Rfsksigwa與Asp f 3124—132gwadeegrt由于分別缺少包含于最小表位基序肽Asp f 3123—m中的第127位殘基D和第123位殘基I，印跡反應(yīng)為陰性(圖3)。
[0035]盡管本發(fā)明描述了Aspf 3蛋白抗原表位最小基序Asp f 3123—mIGWAD，以及可單獨(dú)和/或組合用含最小基序的9肽或9肽融合蛋白研制用作檢測(cè)人煙曲霉感染的抗原肽(或化學(xué)合成或融合表達(dá))，但有一點(diǎn)對(duì)于相關(guān)領(lǐng)域研究技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，即在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可對(duì)本發(fā)明的表位肽基序和擴(kuò)展的含最小基序9肽融合蛋白作各種變化改動(dòng)。因此，所附權(quán)利要求覆蓋了所有這些在本發(fā)明范圍內(nèi)的變動(dòng)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種煙曲霉Asp f 3蛋白的最小表位基序肽，其特征在于具有SEQ.1D N0.1所示氨基酸序列，記為Asp f 3123—m，其一字簡(jiǎn)寫(xiě)氨基酸序列為IGWAD。2.一種含如權(quán)利要求1所述煙曲霉Asp f 3蛋白的最小表位基序肽的擴(kuò)展短肽，其特征在于: 具有SEQ.1D N0.2所示氨基酸序列，記為Asp f 3119—m，擴(kuò)展9肽一字簡(jiǎn)寫(xiě)氨基酸序列為 FSKSIGWAD;或者， 具有SEQ.1D N0.3所示氨基酸序列，記為Asp f 312()—128，擴(kuò)展9肽一字簡(jiǎn)寫(xiě)氨基酸序列為 SKSIGWADE;或者 具有SEQ.1D N0.4所示氨基酸序列，記為Asp f 3m—129，擴(kuò)展9肽一字簡(jiǎn)寫(xiě)氨基酸序列為 KSIGWADEE;或者， 具有SEQ.1D N0.5所示氨基酸序列，Asp f 3122—13'擴(kuò)展9肽一字簡(jiǎn)寫(xiě)氨基酸序列為SIGWADEEG;或者， 具有SEQ.1D N0.6所示氨基酸序列，記為Asp f 3123—131，擴(kuò)展9肽一字簡(jiǎn)寫(xiě)氨基酸序列Sigwadeegr; 在化學(xué)合成或融合表達(dá)9肽融合蛋白的場(chǎng)合，擴(kuò)展的殘基部分可增刪或用其它殘基替代。3.如權(quán)利要求1所述的表位最小基序肽在制備作為臨床診斷由煙曲霉感染導(dǎo)致侵襲性曲霉病、變應(yīng)性支氣管炎和曲霉腫血清識(shí)別表位標(biāo)志物中的應(yīng)用。4.如權(quán)利要求2所述的表位最小基序肽的擴(kuò)展短肽單獨(dú)或組合在制備作為臨床診斷由煙曲霉感染導(dǎo)致侵襲性曲霉病、變應(yīng)性支氣管炎和曲霉腫血清識(shí)別表位標(biāo)志物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK105866435SQ201610366970
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年5月30日
【發(fā)明人】顧少華, 霍克克, 徐萬(wàn)祥, 高巖, 石晶, 季朝能, 謝毅
【申請(qǐng)人】復(fù)旦大學(xué)