一種使用專屬性肽段組鑒別美國肉參的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種使用專屬性肽段組鑒別美國肉參(Isostichopus badionotus)的方法，以及一組單獨(dú)或組合使用時，可用來鑒別美國肉參的特征多肽，所述特征多肽為美國肉參蛋白的低同源性多肽片段，所述的低同源性多肽片段指該肽段為美國肉參獨(dú)有的，且長度在5～30個氨基酸的多肽片段，所述的蛋白雖然發(fā)現(xiàn)有部分和植物或細(xì)菌等物種和其一致，但對比梅花參、海地瓜、刺參、墨西哥參時，所述特征多肽是美國肉參獨(dú)有的。
【專利說明】
一種使用專屬性肽段組鑒別美國肉參的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種使用專屬性肽段組鑒別美國肉參 (Isostichopus badionotus)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 海參富含酸性黏多糖，對人體有免疫調(diào)節(jié)劑、抗凝血、控制血糖和降血脂等功效。 故此，海參享有"營養(yǎng)寶庫"之美譽(yù)，現(xiàn)代人把海參譽(yù)為"海味八珍之首"。市場上海參種類繁 多，不同海參因其營養(yǎng)價值、口感等不同而價格相差巨大。美國肉參是海參的一種，自然生 長在冷水海域中，其生長期較長，一般為7-10年，故營養(yǎng)價值極高，除具一般海參擁有的富 含蛋白質(zhì)和多種微量元素的優(yōu)點(diǎn)外，還具有參體肥壯，發(fā)漲率高，參肉厚實(shí)，口感爽滑等特 點(diǎn)。是烹飪和藥用倶佳的極品。
[0003] 不同品種的海參相比較，有的粘多糖含量高，對心腦血管有好處;有的皂甙含量 高，對抗癌有益。海參同人參一樣，如果皂甙含量高，則藥用價值高，但可能味道不好;而有 的海參蛋白質(zhì)含量尚，如前參和刺參，可以大量用在賓館和家庭餐桌上，對蛋白質(zhì)缺之、營 養(yǎng)不良的人群提供身體所需的營養(yǎng)物質(zhì)。
[0004] 由于目前缺乏特別有效的識別海參品種的方法，鑒別海參種類的方法還只是靠傳 統(tǒng)的外觀觀察，缺乏技術(shù)水平的支持，導(dǎo)致不少不良商人以次充好、以假充真欺騙消費(fèi)者， 因此需要一種高效準(zhǔn)確的鑒定海參的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明對美國肉參（Isostichopus badionotus)的肽段進(jìn)行了研究，建立了從多 肽水平對美國肉參進(jìn)行鑒別的技術(shù)，填補(bǔ)了國內(nèi)外海參鑒別的空白。
[0006] 本發(fā)明首先涉及一組單獨(dú)或組合使用時，可用來鑒別美國肉參的特征多肽，所述 特征多肽為美國肉參蛋白的低同源性多肽片段，所述的低同源性多肽片段指該肽段為美國 肉參獨(dú)有的，且長度在5~30個氨基酸的多肽片段，所述的蛋白為美國肉參中的如下蛋白：
[0007] (1 ) ac t in i soform 2、h i s tone H2B 和gl y ceral dehy de-3-pho sphat e dehydrogenase蛋白；
[0008] (2)arginine kinase、translationally controlled tumor protein和major yolk protein 2蛋白；
[0009] (3)heat_shock protein 70和heat-shock protein gp96蛋白；
[0010] (4) tropomyosin蛋白。
[0011] 優(yōu)選的，所述來源于actin isoform 2、histone H2B和glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase蛋白的特征多肽，其序列為：
[0012] SEQ ID N0.1：EIAALAPPTMK；
[0013] SEQ ID N0.2：LCYVFLDFEQEMATAASSSSLEK；
[0014] SEQ ID N0.3：CDETLFQPSFIGMESAGIHETTYNSIMK；
[0015] SEQ ID N0.4：ETYSIYIYK；
[0016] SEQ ID N0.5：AGIALSENFVK；
[0017] SEQ ID N0.6:VPVPDVSWDLTLR。
[0018] 上述肽段1-6的m/z分別為：
[0019] 571·3;876·1;1069·5;393·9;574·8;754·9。
[0020] 優(yōu)選的，所述來源于arginine kinase、translationally controlled tumor protein和major yolk protein 2蛋白的特征多肽，其序列為：
[0021] SEQ ID N0.7：PYDDVLDPAYVISSR；
[0022] SEQ ID N0.8：IMDDVLDPAYVISSR；
[0023] SEQ ID N0.9：DVITGEELFSDSYK；
[0024] SEQ ID NO.10：LVDDLYWR；
[0025] SEQ ID NO.11：IGSVFESLNR；
[0026] SEQ ID N0.12:PWFLNPER。
[0027] 上述肽段7-12的m/z分別為：
[0028] 855.4;565.3;801.9;540.3;561.3;535.8。
[0029] 優(yōu)選的，所述來源于heat-shock protein 70和heat-shock protein gp96蛋白的 特征多肽，其序列為：
[0030] SEQ ID N0.13：DAGVIAGLQVLR；
[0031] SEQ ID N0.14：SEIHELVLVGGSTR；
[0032] SEQ ID NO.15：VEIESFFDGEDFSETLTR；
[0033] SEQ ID NO.16：DDLVNNLGTIAK；
[0034] SEQ ID NO.17：EEAYDYLEPDTIEQLVK；
[0035] SEQ ID N0.18:YSQFINFPIYLWGSK。
[0036] 上述肽段13-18的m/z分別為：
[0037] 606.4；748.9；1061.0；636.8；1028.0；932.0 〇
[0038]優(yōu)選的，所述來源于tropomyosin蛋白的特征多肽，其序列為：
[0039] SEQ ID NO.19：MSELESQVTSSK；
[0040] SEQ ID N0.20：MSELESQVMGSK；
[0041] SEQ ID N0.21：QLESELDDTSEK；
[0042] SEQ ID N0.22：YDDIEQSSEESER；
[0043] SEQ ID N0.23:YNDIEQSSEESER。
[0044] 上述肽段19-23的m/z分別為：
[0045] 442.5；442.5；465.2；529.6；529.2 〇
[0046] 本發(fā)明還涉及一種檢測美國肉參的方法，所述方法包括如下步驟：
[0047] (1)對待測樣本進(jìn)行質(zhì)譜前處理，獲得待測多肽濾液：
[0048] (2)通過質(zhì)譜法檢驗(yàn)待測樣本的多肽成分，分析樣本中的美國肉參成分。
[0049]所述的質(zhì)譜前處理步驟如下：
[0050] (1)稱取lg海參樣品均質(zhì)成粉末狀態(tài)，加入10mL蛋白提取液（8Μ尿素，50mM NH4HC03)震蕩提取蛋白，高速低溫離心(20000r/min)，取上清液200ul轉(zhuǎn)移到lml EP管中；
[0051 ] (2)取2yL lmol/L DTT加入到100yL上述蛋白溶液中37°C應(yīng)1小時；
[0052] (3)取10yL現(xiàn)配的lmol/L的IAA(配置過程需避光，現(xiàn)用現(xiàn)配)加入到已經(jīng)冷卻至室 溫的上述反應(yīng)液中，室溫避光反應(yīng)1小時；
[0053] (4)采用10K濾膜20000g超濾30分鐘，使用50mmol/L碳酸氫銨溶液反復(fù)沖洗濾膜上 層，轉(zhuǎn)移至新的EP管中；
[0054] (5)再加入碳酸氫銨溶液重復(fù)此步驟，合并溶液完成膜下蛋白提取；
[0055] (6)取5ul Trypsin酶溶液（1μg/μL的Trypsin酶溶液)加入到上述蛋白溶液中37°C 解16-18小時；
[0056] (7)采用10K濾膜14000g超濾20分鐘，收集下層的肽段濾液，待上機(jī)檢測。
[0057] 所述的質(zhì)譜法檢測為，采用AB SCIEXTripleT〇F?5600檢測，
[0058] 流動相A: 0.1 %甲酸-乙腈，流動相B: 0.1 %甲酸-水，
[0059] 流速:0.25mL/min，
[0060] T0F掃描范圍：350-1500Da，
[0061 ]正離子反應(yīng)模式，GS1:35，GS2:45，Curtain Gas: 35，ISVF: 5500，TEM: 500，DP: 100， CE：10〇
[0062] 采用AB SCIEX三重四級桿檢測，
[0063] 流動相A: 0 · 1 %甲酸-乙腈，流動相B: 0 · 1 %甲酸-水，
[0064] 流速：0.3mL/min，
[0065] 電噴霧離子源，正離子反應(yīng)模式，檢測方式:MRM，噴霧電壓：5500V，離子傳輸管溫 度:475°C;鞘氣壓力:40;輔助氣壓力:6。
[0066] 所述的分析樣本中的美國肉參成分為，將待測樣品的質(zhì)譜結(jié)果對比所述美國肉參 蛋白的低同源性多肽片段(特征多肽)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜譜圖，出現(xiàn)所述美國肉參蛋白的低同源性 多肽片段的質(zhì)譜檢測譜圖時，即可判斷該組織樣本為美國肉參樣本。
[0067]優(yōu)選的，所述的美國肉參蛋白的低同源性多肽片段(特征多肽）為SEQ ID NO.1~ 23所示的各條特異性多肽。
[0068] 本發(fā)明還涉及使用上述美國肉參蛋白的獨(dú)有特征多肽鑒別美國肉參的方法以及 使用所述特征多肽制備獲得的用于鑒別美國肉參的試劑/試劑盒等檢測產(chǎn)品。
[0069] 本發(fā)明還涉及所述的特征多肽在制備用于鑒別美國肉參的試劑/試劑盒等檢測產(chǎn) 品中的應(yīng)用。
[0070] 最后，雖然所述的蛋白或特征多肽的部分有植物或細(xì)菌等物種和其一致，但僅對 比梅花參、海地瓜、刺參、墨西哥參等海參屬種時，所述特征多肽是美國肉參獨(dú)有的。
【附圖說明】
[0071] 圖 1，EIAALAPPTMK 色譜圖
[0072] 圖 2，LCYVFLDFEQEMATAASSSSLEK 色譜圖
[0073] 圖 3，CDETLFQPSFIGMESAGIHETTYNS 頂K色譜圖
[0074] 圖4，ETYSHIYK 色譜圖
[0075] 圖5，AGIALSENFVK 色譜圖
[0076] 圖6，VPVPDVSVVDLTLR 色譜圖
[0077] 圖7，PYDDVLDPAYVISSR 色譜圖
[0078] 圖8JMDDVLDPAYVISSR 色譜圖
[0079] 圖9，DVITGEELFSDSYK 色譜圖
[0080] 圖 10，LVDDLYWR 色譜圖 [0081 ]圖 11，IGSVFESLNR 色譜圖
[0082] 圖 12，PVVFLNPER 色譜圖
[0083] 圖 13，DAGVIAGLQVLR 色譜圖
[0084] 圖 14，SEIHELVLVGGSTR 色譜圖
[0085] 圖 15，VEIESFFDGEDFSETLTR 色譜圖
[0086] 圖 16，DDLVNNLGTIAK 色譜圖
[0087] 圖 17，EEAYDYLEPDTIEQLVK 色譜圖
[0088] 圖 18，YSQFINFPIYLWGSK 色譜圖
[0089] 圖 19，MSELESQVTSSK 色譜圖
[0090] 圖 20，MSELESQVMGSK 色譜圖
[0091] 圖 21，QLESELDDTSEK 色譜圖
[0092] 圖 22，YDDIEQSSEESER 色譜圖
[0093] 圖 23，YNDIEQSSEESER 色譜圖
【具體實(shí)施方式】
[0094] 實(shí)施例1，特異性多肽的序列來源和比對信息
[0095] 1.上述多肽 SEQ ID N0.1:EIAALAPPTMK;SEQ ID N0.2: LCYVFLDFEQEMATAASSSSLEK; SEQ ID NO · 3: CDETLFQPSFIGMESAGIHETTYNSMK均來自于蛋白 actin isoform 2[Holothria glaberrima]，其在NCBI上的Accesion number是gi | 215882299。經(jīng)過質(zhì)譜分析，多肽SEQ ID N0.1:EIAALAPPTMK;SEQ ID N0.2: LCYVFLDFEQEMATAASSSSLEK;SEQ ID N0.3:CDETLFQPSFIGMESAGIHETTYNSMK在美國肉參中 確實(shí)存在，且峰形好，強(qiáng)度高。
[0096] 圖1是多肽EIAALAPPTMK在美國肉參中的色譜圖，其m/z為571.3。
[0097] 圖2是多肽LCYVFLDFEQEMATAASSSSLEK在美國肉參中的色譜圖，其m/z為876.1。
[0098] 圖3是多肽CDETLFQPSFIGMESAGIHETTYNSIMK在美國肉參中的色譜圖，其m/z為 1069.5 〇
[0099] 2.上述多肽SEQ ID N0.4:ETYSIYIYK來自于蛋白histone H2B[Holothuria rubulosa]，其在NCBI 上的Accesion number是gi |559457。經(jīng)過質(zhì)譜分析，多肽SEQ ID NO. 4: ETYSIYIYK在美國肉參中確實(shí)存在，且峰形好，強(qiáng)度高。
[0100] 圖4是多肽ETYSHIYK在美國肉參中的色譜圖，其m/z為393.9。
[0101] 3.上述多肽SEQ ID N0.5:AGIALSENFVK;SEQ ID N0.6:VPVPDVSVVDLTLR來自于蛋 白glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase[Apostichopus japonicus]，其在NCBI上 的Accesion number是gi|334821165。經(jīng)過質(zhì)譜分析，多肽SEQ ID N0.5:AGIALSENFVK;SEQ ID NO. 6: VPVPDVSVVDLTLR在美國肉參中確實(shí)存在，且峰形好，強(qiáng)度高。
[0102] 圖5是多肽AGIALSENFVK在美國肉參中的色譜圖，其m/z為574.8。
[0103] 圖6是多肽￥?￥?0￥3"01^1^在美國肉參中的色譜圖，其111/2為754.9。
[0104] 4.經(jīng)過質(zhì)譜分析，多肽SEQ ID NO. 1-6在梅花參、海地瓜、刺參、墨西哥參中不存 在。
[0105] 實(shí)施例2,特異性多肽的序列來源和比對信息
[0106] 1.上述多肽SEQ ID N0.7:PYDDVLDPAYVISSR;SEQ ID N0.8:n?DVLDPAYVISSR均來 自于蛋白arginine kinase[Apostichopus japonicus]，其在NCBI上的Accesion number是 gi |4586462。經(jīng)過質(zhì)譜分析，多肽SEQ ID N0.7:PYDDVLDPAYVISSR;SEQ ID N0.8: 頂DDVLDPAYVISSR在美國肉參中確實(shí)存在，且峰形好，強(qiáng)度高。
[0107] 圖7是多肽PYDDVLDPAYVISSR在美國肉參中的色譜圖，其m/z為855.4。
[0108] 圖8是多肽頂DDVLDPAYVISSR在美國肉參中的色譜圖，其m/z為565.3。
[0109] 2.上述多肽SEQ ID N0.9:DVITGEELFSDSYK;SEQ ID N0.10:LVDDLYWR來自于蛋白 translationally controlled tumor protein[Stichopus monotuberculatus]，其在NCBI 上的 Accesion number 是 gi|659902918。經(jīng)過質(zhì)譜分析，多肽 SEQ ID N0.9: DVITGEELFSDSYK;SEQ ID N0.10:LVDDLYWR在美國肉參中確實(shí)存在，且峰形好，強(qiáng)度高。 [0110] 圖9是多肽DVITGEELFSDSYK在美國肉參中的色譜圖，其m/z為801.9。
[0111] 圖10是多肽LVDDLYWR在美國肉參中的色譜圖，其m/z為540.3。
[0112] 3.上述多肽 SEQ ID N0.11:IGSVFESLNR;SEQ ID N0.12:PVVFLNPER 來自于蛋白 major yolk protein 2[Apostichopus japonicus]，其在NCBI上的Accesion number是gi | 240846033。經(jīng)過質(zhì)譜分析，多肽SEQ ID N0.11:IGSVFESLNR;SEQ ID N0.12:PVVFLNPER在美 國肉參中確實(shí)存在，且峰形好，強(qiáng)度高。
[0113] 圖ll是多肽IGSVFESLNR在美國肉參中的色譜圖，其m/z為561.3。
[0114] 圖12是多肽?"?^^^1?在美國肉參中的色譜圖，其111/2為535.8。
[0115] 4.經(jīng)過質(zhì)譜分析，多肽SEQ ID N0.7-12在梅花參、海地瓜、刺參、墨西哥參中不存 在。
[0116] 實(shí)施例3,特異性多肽的序列來源和比對信息
[0117] 1.上述多肽 SEQ ID N0.13:DAGVIAGLQVLR;SEQ ID N0.14:SEIHELVLVGGSTR;SEQ ID NO. 15:VEIESFFDGEDFSETLTR均來自于蛋白heat shock protein 70[Apostichopus japonicus]，其在NCBI上的Accesion number是gi 1194465888。經(jīng)過質(zhì)譜分析，多肽SEQ ID NO. 113：DAGVIAGLQVLR；SEQ ID NO .14：SEIHELVLVGGSTR；SEQ ID NO .15： VEIESFFDGEDFSETLTR在美國肉參中確實(shí)存在，且峰形好，強(qiáng)度高。
[0118] 圖13是多肽DAGVIAGLQVLR在美國肉參中的色譜圖，其m/z為606.4。
[0119] 圖14是多肽SEIHELVLVGGSTR在美國肉參中的色譜圖，其m/z為748.9。
[0120] 圖15是多肽VEIESFFDGEDFSETLTR在美國肉參中的色譜圖，其m/z為1061.0。
[0121] 2.上述多肽 SEQ ID N0.16:DDLVNNLGTIAK;SEQ ID N0.17:EEAYDYLEPDTIEQLVK; SEQ ID NO. 18:YSQFINFPIYLWGSK均來自于蛋白heat shock protein gp96[Apostichopus japonicus]，其在NCBI上的Accesion number是gi | 355344590。經(jīng)過質(zhì)譜分析，多肽SEQ ID NO.16：DDLVNNLGTIAK；SEQ ID NO. 1 7：EEAYDYLEPDTIEQLVK；SEQ ID NO .18： YSQFINFPHLWGSK在美國肉參中確實(shí)存在，且峰形好，強(qiáng)度高。
[0122] 圖16是多肽001^順1^1六1(在美國肉參中的色譜圖，其111/2為636.8。
[0123] 圖17是多肽EEAYDYLEPDTIEQLVK在美國肉參中的色譜圖，其m/z為1028.0。
[0124] 圖18是多肽YSQFINFPIYLWGSK在美國肉參中的色譜圖，其m/z為932.0。
[0125] 3.經(jīng)過質(zhì)譜分析，多肽SEQ ID N0.13-18在梅花參、海地瓜、刺參、墨西哥參中不存 在。
[0126] 實(shí)施例4,特異性多肽的序列來源和比對信息
[0127] 1.上述多肽SEQ ID N0.19:MSELESQVTSSK;SEQ ID N0.20:MSELESQVMGSK;SEQ ID N0.21:QLESELDDTSEK;SEQ ID N0.22:YDDIEQSSEESER;SEQ ID N0.23:YNDIEQSSEESER均來 自于蛋白tropomyosin[Apostichopus japonicus]，其在NCBI上的Accesion number是gi 302340969。經(jīng)過質(zhì)譜分析，多肽SEQ ID N0.19:MSELESQVTSSK;SEQ ID N0.20: MSELESQVMGSK；SEQ ID NO.21：QLESELDDTSEK；SEQ ID NO.22：YDDIEQSSEESER；SEQ ID NO. 23: YNDIEQSSEESER在美國肉參中確實(shí)存在，且峰形好，強(qiáng)度高。
[0128] 圖19是多肽MSELESQVTSSK在美國肉參中的色譜圖，其m/z為442.5。
[0129] 圖20是多肽MSELESQVMGSK在美國肉參中的色譜圖，其m/z為442.5。
[0130] 圖21是多肽QLESELDDTSEK在美國肉參中的色譜圖，其m/z為465.2。
[0131] 圖22是多肽YDDIEQSSEESER在美國肉參中的色譜圖，其m/z為529.6。
[0132] 圖23是多肽YNDIEQSSEESER在美國肉參中的色譜圖，其m/z為529.2。
[0133] 2.經(jīng)過質(zhì)譜分析，多肽SEQ ID N0.19-23在梅花參、海地瓜、刺參、墨西哥參中不存 在。
[0134] 實(shí)施例5，海參樣本處理及檢測步驟
[0135] 對待測海參樣本進(jìn)行分析的步驟包括
[0136] ( - )樣本前處理步驟：
[0137] (1)稱取lg海參樣品均質(zhì)成粉末狀態(tài)，加入10mL蛋白提取液（8M尿素，50mM NH4HC03)震蕩提取蛋白，高速低溫離心(20000r/min)，取上清液200ul轉(zhuǎn)移到lml EP管中；
[0138] (2)取2yL lmol/L DTT加入到100yL上述蛋白溶液中37°C反應(yīng)1小時；
[0139] (3)取10yL現(xiàn)配的lmol/L的IAA(配置過程需避光）加入到已經(jīng)冷卻至室溫的上述 反應(yīng)液中，室溫避光反應(yīng)1小時；
[0140] (4)采用10K濾膜20000g超濾30分鐘，使用200yL 50mmol/L碳酸氫銨溶液反復(fù)沖洗 濾膜上層，轉(zhuǎn)移至新的EP管中；
[0141] (5)再加入200yL碳酸氫銨溶液重復(fù)此步驟，合并溶液完成膜下蛋白提??；
[0142] (6)取5ul Trypsin酶溶液（1μg/μL的Trypsin酶溶液)加入到上述蛋白溶液中37°C 酶解16-18小時；
[0143] (7)采用10K濾膜14000g超濾20分鐘，收集下層的肽段濾液，待上機(jī)檢測。
[0144] (二)上機(jī)檢測，
[0145] 采用AB SCIEXTripleT0F?5600檢測，
[0146] 流動相A: 0.1 %甲酸-乙腈，流動相B: 0.1 %甲酸-水，
[0147] 流速:0.25mL/min，
[0148] T0F掃描范圍：350-1500Da，
[0149] 正離子反應(yīng)模式，GS1:35，GS2:45，Curtain Gas: 35，ISVF: 5500，TEM: 500，DP: 100， CE：10〇
[0150] 采用AB SCIEX三重四級桿檢測，
[0151] 流動相A: 0.1 %甲酸-乙腈，流動相B: 0.1 %甲酸-水，
[0152] 流速:0.3mL/min，
[0153] 電噴霧離子源，正離子反應(yīng)模式，檢測方式:MRM，噴霧電壓：5500V，離子傳輸管溫 度:475°C;鞘氣壓力:40;輔助氣壓力:6。
[0154] 檢測結(jié)果對比實(shí)施例1-4中的各條特異性多肽的質(zhì)譜譜圖，出現(xiàn)實(shí)施例1-4所述質(zhì) 譜檢測譜圖時，即可判斷該組織樣本為美國肉參樣本。
[0155] 經(jīng)進(jìn)一步鑒定，所述肽段為美國肉參專有肽段，在其他海地瓜、墨西哥參、刺參、梅 花參等不同海參品種中未見表達(dá)。
[0156]最后需要說明的是，以上實(shí)施例僅用作幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)， 并不用作對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。






【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一組通過單獨(dú)使用或任意組合使用對美國肉參（Isostichopus badionotus)進(jìn)行鑒 別的特征多肽，所述特征多肽為美國肉參蛋白的低同源性多肽片段，所述的低同源性多肽 片段指該肽段為美國肉參獨(dú)有的，且長度在5~30個氨基酸的多肽片段，所述的美國肉參蛋 白選自美國肉參中的如下蛋白： (1) actin isoform 2、histone H2B和glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 蛋白； (2) arginine kinase>translationally controlled tumor protein和major yolk protein 2蛋白； (3) heat-shock protein 70和heat-shock protein gp96蛋白； (4) tropomyosin蛋白。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的特征多肽，其特征在于，所述的特征多肽的序列為： 來源于actin isoform 2、histone H2B和glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase蛋白的特征多肽，其序列為： SEQ ID N0.1：EIAALAPPTMK； SEQ ID N0.2：LCYVFLDFEQEMATAASSSSLEK； SEQ ID N0.3:CDETLFQPSFIGMESAGIHETTYNSMK; SEQ ID N0.4：ETYSIYIYK； SEQ ID N0.5：AGIALSENFVK； SEQ ID N0.6：VPVPDVSVVDLTLR； 來源于arginine kinase>translationally controlled tumor protein和major yolk protein 2蛋白的特征多肽，其序列為： SEQ ID N0.7：PYDDVLDPAYVISSR； SEQ ID N0.8：IMDDVLDPAYVISSR； SEQ ID N0.9：DVITGEELFSDSYK； SEQ ID N0.10：LVDDLYWR； SEQ ID N0.11：IGSVFESLNR； SEQ ID N0.12：PVVFLNPER； 來源于heat-shock protein 70和heat-shock protein gp96蛋白的特征多肽，其序列 為： SEQ ID N0.13：DAGVIAGLQVLR； SEQ ID N0.14：SEIHELVLVGGSTR； SEQ ID N0.15：VEIESFFDGEDFSETLTR； SEQ ID N0.16：DDLVNNLGTIAK； SEQ ID N0.17：EEAYDYLEPDTIEQLVK； SEQ ID N0.18：YSQFINFPIYLWGSK； 來源于tropomyosin蛋白的特征多肽，其序列為： SEQ ID N0.19：MSELESQVTSSK； SEQ ID N0.20：MSELESQVMGSK； SEQ ID N0.21：QLESELDDTSEK； SEQ ID N0.22：YDDIEQSSEESER； SEQ ID N0.23：YNDIEQSSEESER〇3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述特征多肽，其特征在于，所述的SEQ ID NO. 1~23的多肽片段的 m/z依次分別為： 肽段1-6的m/z分別為： 571.3；876.1；1069.5；393.9；574.8；754.9； 肽段7-12的m/z分別為： 855.4；565.3；801.9；540.3；561.3；535.8； 肽段13-18的m/z分別為： 606.4；748.9；1061.0；636.8；1028.0；932.0； 肽段19-23的m/z分別為： 442.5；442.5；465.2；529.6；529.2〇4. 一種檢測美國肉參的方法，所述方法包括如下步驟： (1) 對待測樣本進(jìn)行質(zhì)譜前處理，獲得待測多肽濾液： (2) 通過質(zhì)譜法檢驗(yàn)待測樣本的多肽成分，分析樣本中的刺參成分。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的質(zhì)譜前處理步驟如下： (1) 稱取海參樣品均質(zhì)成粉末狀態(tài)，加入蛋白提取液(8M尿素，50mM NH4HC03)震蕩提取 蛋白，高速低溫離心，取上清液轉(zhuǎn)移到EP管中； (2) 取DTT加入到上述蛋白溶液中，37 °C反應(yīng)1小時； (3) 取現(xiàn)配的IAA加入到已經(jīng)冷卻至室溫的上述反應(yīng)液中，室溫避光反應(yīng)1小時； (4) 采用10K濾膜超濾30分鐘，使用碳酸氫銨溶液反復(fù)沖洗濾膜上層，轉(zhuǎn)移至新的EP管 中； (5) 再加入碳酸氫銨溶液重復(fù)此步驟，合并溶液完成膜下蛋白提?。? (6) 取Tryps in酶溶液加入到上述蛋白溶液，中37 °C酶解16-18小時； (7) 采用10K濾膜超濾20分鐘，收集下層的肽段濾液，待上機(jī)檢測。6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述的質(zhì)譜法檢測為： 采用AB SCIEXTrip丨eTOF?5600檢測， 流動相A: 0.1 %甲酸-乙腈，流動相B: 0.1 %甲酸-水， 流速:〇 · 25mL/min， T0F掃描范圍：350-1500Da， 正離子反應(yīng)模式，GS1:35，GS2:45，Curtain Gas: 35，ISVF: 5500，TEM: 500，DP: 100，CE: 10。7. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述的質(zhì)譜法檢測為： 采用AB SCIEX三重四級桿檢測， 流動相A: 0.1 %甲酸-乙腈，流動相B: 0.1 %甲酸-水， 流速:〇.3mL/min， 電噴霧離子源，正離子反應(yīng)模式，檢測方式:MRM，噴霧電壓：5500V，離子傳輸管溫度： 475°C;鞘氣壓力:40;輔助氣壓力:6。8. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述的分析樣本中的美國肉參成分為， 將待測樣品的質(zhì)譜結(jié)果對比SEQ ID NO. 1~23的各條特異性多肽的質(zhì)譜譜圖，出現(xiàn)與SEQ ID NO. 1~23的各條特異性多肽的質(zhì)譜檢測譜圖相同的譜圖時，即可判斷該組織樣本為美 國肉參樣本。9. 權(quán)利要求1-3任一所述的特征多肽在制備用于鑒別美國肉參的試劑/試劑盒等產(chǎn)品 中的應(yīng)用。10. 包含權(quán)利要求1-3任一所述的特征多肽的用于鑒別美國肉參的試劑/試劑盒等檢測 廣品。
【文檔編號】G01N33/68GK105866438SQ201610410893
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月8日
【發(fā)明人】張曉梅, 張鴻偉, 梁成珠, 鮑蕾, 王境堂
【申請人】山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心