亞硫酸鹽的作用
【專利摘要】本發(fā)明公開了亞硫酸鹽的作用，其能夠促進(jìn)肝細(xì)胞分泌極低密度脂蛋白。本發(fā)明的有益之處在于：本發(fā)明證實(shí)了亞硫酸鹽能夠促進(jìn)肝細(xì)胞VLDL的分泌，這就提示亞硫酸鹽很可能與動脈粥樣硬化等心血管疾病相關(guān)，提示人們在食用含有亞硫酸鹽添加劑的食品時要注意安全使用量，這對于保障人群健康有很大的借鑒意義。
【專利說明】
亞硫酸鹽的作用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種化學(xué)物質(zhì)的作用，具體涉及亞硫酸鹽的作用，屬于化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 亞硫酸鹽是一種在食品、藥品中極為常見的添加劑，其廣泛使用在干果和葡萄酒、 啤酒等飲料中，也被添加于氨基酸輸注液中，此外還是中藥硫磺熏蒸后的常見殘留物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于研究亞硫酸鹽是否能夠促進(jìn)肝細(xì)胞極低密度脂蛋白（VLDL)的 分泌。
[0004] 為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：
[0005] 亞硫酸鹽的作用，其特征在于，能夠促進(jìn)肝細(xì)胞分泌極低密度脂蛋白。
[0006] 前述的亞硫酸鹽的作用，其特征在于，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測亞硫酸鹽處理肝 細(xì)胞后細(xì)胞外培養(yǎng)上清中VLDL的含量。
[0007] 前述的亞硫酸鹽的作用，其特征在于，采用磷鎢酸鹽沉淀、蛋白雜交法檢測亞硫酸 鹽處理肝細(xì)胞后細(xì)胞外培養(yǎng)上清中VLDL的含量。
[0008] 本發(fā)明的有益之處在于:本發(fā)明證實(shí)了亞硫酸鹽能夠促進(jìn)肝細(xì)胞VLDL的分泌，這 就提示亞硫酸鹽很可能與動脈粥樣硬化等心血管疾病相關(guān)，提示人們在食用含有亞硫酸鹽 添加劑的食品時要注意安全使用量，這對于保障人群健康有很大的借鑒意義。
【附圖說明】
[0009] 圖1是不同濃度亞硫酸鹽對HL-7702肝細(xì)胞VLDL分泌的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0010] 以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作具體的介紹。
[00?1 ]目如，只有文獻(xiàn)提不亞硫酸鹽能夠引起尚脂血癥，但對引起尚脂血癥可能的原因 缺乏深入研究。臨床上常見病人因VLDL分泌增加而導(dǎo)致高脂血癥，為研究亞硫酸鹽是否也 通過此途徑實(shí)現(xiàn)這種作用，本發(fā)明檢測了亞硫酸鹽處理肝細(xì)胞后肝細(xì)胞外的VLDL含量。
[0012] 一、酶聯(lián)免疫吸附法
[0013] ( - )實(shí)驗(yàn)分組
[0014] 依據(jù)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果，將Na2S03處理組濃度調(diào)整為10mM、2.5mM、0.5mM、 O.lmM，同時設(shè)陰性對照組（完全培養(yǎng)基）及陽性對照組（ImM油酸（0A)，10mM四氯化碳 (CCl4))〇
[0015] (二)培養(yǎng)細(xì)胞
[0016] 選對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞常規(guī)消化，單細(xì)胞懸液以5 X104/ml分7組接 種于24孔培養(yǎng)板中，每孔加lml細(xì)胞懸液，每組設(shè)兩個復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。置37 °C、5 %⑶2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。
[0017](三)細(xì)胞染毒
[0018] 24h待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行染毒，棄去舊液，實(shí)驗(yàn)組加lml Na2S03工作液（終濃度為 10mM、2.5mM、0.5mM、0.1 mM)，陰性對照組和陽性對照組分別加lml完全培養(yǎng)基和終濃度為 ImM 0A和10mM CC14,將24孔板置C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至既定染毒時間。染毒結(jié)束后，收集細(xì)胞 培養(yǎng)上清液，離心后-80°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0019](四）試驗(yàn)檢測
[0020] 按照VLDL檢測試劑盒說明進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測，具體的操作過程如下：
[0021] 1、稀釋：將標(biāo)準(zhǔn)品原液用標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋液梯度稀釋至所用濃度，分別為1600ng/ ml、800ng/ml、400ng/ml、200ng/ml、100ng/ml。
[0022] 2、加樣:每個孔均需作復(fù)孔，包括標(biāo)準(zhǔn)品孔以及空白孔。①空白孔:不加任何樣品， 也不加任何試劑。②標(biāo)準(zhǔn)品孔:加入標(biāo)準(zhǔn)品50μ1，鏈霉親和素-HRP 50μ1。③待測樣品孔:加 入樣品40μ1，抗VLDL抗體10μ1，鏈霉親和素-HRP 50μ1。蓋好封板膜，輕輕震蕩混勻，37°C溫 水孵育60分鐘。
[0023] 3、配液:將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。
[0024] 4、洗滌:輕輕的揭掉封板膜，吸棄液體，甩干，之后，每孔加滿洗滌液，室溫靜至30s 后，棄去洗滌液，重復(fù)此操作5次，拍干。
[0025] 5、顯色:每孔先加入顯色劑Α 50μ1，再加入顯色劑Β 50μ1，輕輕震蕩混勻，37°C避 光顯色10min。之后每孔加50μ1終止液，終止反應(yīng)，此時的藍(lán)色立即轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。
[0026] 6、測定：以空白管調(diào)零，450nm波長依次測量各孔的吸光度值(0D值）。測定應(yīng)該在 加入終止液lOmin內(nèi)進(jìn)行。
[0027] 7、計算：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，以及相對應(yīng)的0D值，計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方 程，再根據(jù)樣品的0D值，在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度。
[0028](五)檢測結(jié)果
[0029] 我們采用酶聯(lián)免疫吸附法對亞硫酸鹽處理肝細(xì)胞后細(xì)胞外培養(yǎng)上清中VLDL的含 量的檢測結(jié)果見表1。
[0030] 表1不同濃度亞硫酸鈉鹽HL-7702肝細(xì)胞VLDL(ymol/L)分泌水平的影響（n = 3，
[0032] 注：*與陰性對照組比較，Ρ〈0·05
[0033] 由表1中的檢測結(jié)果我們發(fā)現(xiàn):亞硫酸鹽能夠引起正常培養(yǎng)的肝細(xì)胞VLDL分泌水 平增加。
[0034]二、磷鎢酸鹽沉淀、蛋白雜交法
[0035](一)磷鎢酸鹽沉淀法沉淀細(xì)胞培養(yǎng)上清中VLDL
[0036] 1、將細(xì)胞常規(guī)接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，染毒濃度同酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，每組兩個復(fù) 孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。染毒24h、48h后，收集培養(yǎng)上清。參照文獻(xiàn)方法，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)上清中 VLDL的沉淀：即每2ml上清中加入2ml磷鎢酸鈉-氯化鎂(4:1，V/V)工作液。室溫孵育5min后， 4000r/min離心 15min〇
[0037] 2、小心吸棄上清，視沉淀量，加入50-100μ1上樣緩沖液（1 X loading buffer)，充 分混勾，l〇〇°C煮蛋白lOmin后，混旋，4°C，9500r/min離心15min，取5μ1上清進(jìn)行TCA蛋白定 量。
[0038](二)蛋白雜交試驗(yàn)檢測VLDL含量
[0039] 1、SDS-PAGE凝膠配制：使用梯度混合器配制5%-18%梯度膠。原理是根據(jù)不同的 推進(jìn)速度而將兩種不同濃度的膠加以混合而成。
[0040] 具體的過程如下：
[0041] (1)在制板支架上裝配好玻璃凝膠板。
[0042] (2)用直徑約2mm的聚乙烯管連接好梯度混合器、恒流栗、凝膠模。
[0043] (3)取兩個50ml離心管分別配制5%和18%分離膠。
[0044] (4)灌制梯度月父：
[0045] 將兩膠液中搖勻，分別吸取18ml膠液于梯度混合器相應(yīng)的混合杯中。關(guān)閉混合閥 門和輸出閥門，將18 %分離膠倒入左杯，打開混合閥門讓溶液經(jīng)過通道滲入右杯，立即關(guān)閉 混合閥門。將5%分離膠倒入右杯，使兩杯液位相同，然后打開混合閥門，使兩液面保持平 衡。打開磁力攪拌器和梯度混合器開關(guān)，接通恒流栗，將梯度混合器中的膠液緩緩輸入膠腔 中。使凝膠從頂部到底部丙烯酰胺的濃度由上至下逐漸升高，通常頂部凝膠濃度為5%，底 部凝膠濃度為18 %。事先應(yīng)將輸液管出口由膠腔上口中央伸向底部，隨著膠腔內(nèi)液面的升 高逐漸提高輸液管，使管口始終接近液面而不伸入液體內(nèi)部。灌膠的流速要適當(dāng)，以管口流 出液對液面不形成沖擊為好。
[0046] (5)灌膠完畢后，在液面上小心地加入異丙醇約lml封閉膠面。靜置40min左右即可 聚合。
[0047] (6)待凝膠聚合后，倒掉異丙醇溶液，用濾紙條吸干上層殘留液，配制5%濃縮膠， 輕輕搖勻后吸取5ml加到梯度膠上，迅速插入樣品梳，樣品梳下沿剛好觸及梯度膠面為宜， 靜置聚合約30min。
[0048] (7)凝膠聚合后，拔掉樣品梳，裝好電泳槽，在槽中注入電泳緩沖液待上樣。
[0049] 2、樣品處理：將收集的蛋白樣品100°C或沸水浴加熱lOmin，以充分變性蛋白?；?旋，4°C，9500r/min離心15min后待上樣。
[0050] 3、上樣與電泳:取蛋白樣品10yg上樣，5% -18 %梯度膠進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳。上 層膠時使用80V電壓恒壓電泳，在溴酚藍(lán)進(jìn)入下層膠時使用90V電壓恒壓電泳。根據(jù)預(yù)染蛋 白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的電泳情況，預(yù)計目的蛋白已經(jīng)被適當(dāng)分離后停止電泳。
[0051 ] 4、轉(zhuǎn)膜:使用標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置。設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為400mA恒流轉(zhuǎn)膜lh 30min，表達(dá) 產(chǎn)物電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。轉(zhuǎn)膜會有發(fā)熱現(xiàn)象，將轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。
[0052] 5、封閉：轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把載有蛋白的硝酸纖維素膜放置于5%脫脂奶粉封閉液 中，室溫?fù)u床封閉2h。
[0053] 6、一抗孵育:吸盡封閉液，加入稀釋好的一抗，室溫?fù)u床緩慢搖動孵育20min后4 °C 兩次過夜。PBST洗膜lOmin X 3次。
[0054] 7、二抗孵育：吸盡洗滌液，加入稀釋好的二抗，室溫?fù)u床上緩慢搖動孵育2小時。 PBST 洗膜 10minX3次。
[0055] 8、蛋白表達(dá)水平檢測:參考相關(guān)說明書，使用化學(xué)發(fā)光法(ECL發(fā)光法)來檢測各處 理組VLDL的表達(dá)水平。采用專用的壓片暗盒進(jìn)行壓片，根據(jù)蛋白信號強(qiáng)弱，采用不同曝光時 間。用顯影定影試劑盒自行配制顯影液和定影液進(jìn)行手工洗片。膠片顯影后通過Image-Pro Plus 6.0軟件對雜交圖進(jìn)行光密度值半定量分析，以判斷不同處理組VLDL分泌情況。
[0056] 9、檢測結(jié)果：
[0057]我們采用磷鎢酸鹽沉淀、蛋白雜交法對亞硫酸鹽處理肝細(xì)胞后細(xì)胞外培養(yǎng)上清中 VLDL的含量的檢測結(jié)果見圖1。
[0058]由圖1所顯示的檢測結(jié)果我們發(fā)現(xiàn):亞硫酸鹽能夠引起正常培養(yǎng)的肝細(xì)胞VLDL分 泌水平增加。
[0059] 三、結(jié)論：
[0060]我們采用酶聯(lián)免疫吸附法(elisa)和磷鎢酸鹽沉淀、蛋白雜交法這兩種被廣泛認(rèn) 可的方法檢測亞硫酸鹽處理肝細(xì)胞后細(xì)胞外培養(yǎng)上清中VLDL的含量，證實(shí)了亞硫酸鹽能夠 促進(jìn)肝細(xì)胞VLDL的分泌，這就提示亞硫酸鹽很可能與動脈粥樣硬化等心血管疾病相關(guān)，提 示人們在食用含有亞硫酸鹽添加劑的食品時要注意安全使用量，這對于保障人群健康有很 大的借鑒意義。
[0061]需要說明的是，上述實(shí)施例不以任何形式限制本發(fā)明，凡采用等同替換或等效變 換的方式所獲得的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 亞硫酸鹽的作用，其特征在于，能夠促進(jìn)肝細(xì)胞分泌極低密度脂蛋白。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞硫酸鹽的作用，其特征在于，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測亞硫 酸鹽處理肝細(xì)胞后細(xì)胞外培養(yǎng)上清中VLDL的含量。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞硫酸鹽的作用，其特征在于，采用磷鎢酸鹽沉淀、蛋白雜交 法檢測亞硫酸鹽處理肝細(xì)胞后細(xì)胞外培養(yǎng)上清中VLDL的含量。
【文檔編號】G01N33/92GK105866446SQ201610227426
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月13日
【發(fā)明人】白劍英, 雷佩玉
【申請人】山西醫(yī)科大學(xué)