一種單組份tmb顯色液及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種單組份TMB顯色液，所述單組份TMB顯色液包含TMB和L?甲硫氨酸。本發(fā)明所述單組份TMB顯色液添加了L?甲硫氨酸作為抗氧化劑，可防止TMB的氧化，使本發(fā)明中的TMB能穩(wěn)定保存24個月，同時，在終止反應(yīng)后能穩(wěn)定放置3小時以上，與現(xiàn)有TMB需在終止反應(yīng)后30min內(nèi)讀數(shù)更加方便，更具靈活性。同時，本發(fā)明還公開了所述單組份TMB顯色液的制備方法。
【專利說明】
一種單組份TMB顯色液及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種生物體外診斷試劑及其制備方法，尤其是一種TMB顯色液及其制 備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] TMB(3,3'，5,5'_四甲基聯(lián)苯胺）是一種新型安全的色原試劑，作為過氧化物酶的 新底物，在酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)中獲得了廣泛應(yīng)用。底物產(chǎn)生一種可溶性淡藍(lán)色的末 端產(chǎn)物，可在370或630nm在分光光度計上讀取。其適用于酶聯(lián)免疫反應(yīng)中的顯色階段的定 量和定性分析。其檢驗的原理是：當(dāng)標(biāo)記在抗體或抗原上的酶與顯色液中的TMB、雙氧水等 反應(yīng)，加入終止液后溶液由無色變成黃色，黃色深淺反應(yīng)ELISA體系中抗原抗體結(jié)合的多 少，從而判斷某種抗原或抗體的多少。在通過酶標(biāo)儀測度吸光值，判斷免疫反應(yīng)的程度。
[0003] 現(xiàn)有市售的酶聯(lián)免疫試劑盒所采用TMB顯色劑液分為兩種，一種為雙組份，分A液 和B液，使用之前需要先混勻，由于在使用上易造成操作不方便，且混合后保存時間短等缺 點，逐漸被第二種取代;第二種即為單組份TMB，操作方便，但目前市面上所使用的單組份 TMB穩(wěn)定性差，保存時間短，大部分的保存時間在3-6個月，且顯色背景高，均一性不好。TMB 為脂溶性化合物，難溶于水，且容易在空氣環(huán)境中被氧化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種TMB溶解度高、TMB溶 液穩(wěn)定性強、反應(yīng)終止后結(jié)果能穩(wěn)定保存一段時間、讀數(shù)更加方便的單組份TMB顯色液；同 時，本發(fā)明還提供了所述單組份TMB顯色液的制備方法。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:一種單組份TMB顯色液，包含TMB，所 述TMB顯色液還包含L-甲硫氨酸。
[0006] TMB在顯色反應(yīng)中為供氫體，反應(yīng)中除了在相關(guān)酶的催化下進(jìn)行顯色反應(yīng)，容易被 空氣或溶液中存在的O2IPOiT氧化。本申請發(fā)明人在此基礎(chǔ)上選擇使用抗氧化劑阻止TMB的 非酶氧化，在眾多的抗氧化劑中，經(jīng)過大量研究及試驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)選擇L-甲硫氨酸作為TMB的 抗氧化劑，不僅能夠防止TMB被O 2IPOiT氧化，而且能夠提高TMB溶液的穩(wěn)定性及檢測的靈敏 度。
[0007] 作為本發(fā)明所述單組份TMB顯色液的優(yōu)選實施方式，所述L-甲硫氨酸在TMB顯色液 中的質(zhì)量濃度為0.02~lg/L。作為本發(fā)明所述單組份TMB顯色液的更優(yōu)選實施方式，所述L-甲硫氨酸在TMB顯色液中的質(zhì)量濃度為0.1~0.3g/L。
[0008] 作為本發(fā)明所述單組份TMB顯色液的優(yōu)選實施方式，所述單組份TMB顯色液還包含 吐溫80和羥丙基-β-環(huán)糊精。
[0009] 本發(fā)明的單組份TMB顯色液，通過引入吐溫-80和羥丙基-β-環(huán)糊精助溶TMB，使本 發(fā)明的單組份TMB顯色液形成穩(wěn)定的水溶液體系，同時羥丙基-β-環(huán)糊精有1個"內(nèi)疏水、外 親水"的特殊立體環(huán)狀結(jié)構(gòu)，能夠?qū)χ苄缘腡MB進(jìn)行包合，從而提高TMB分子的水溶性、穩(wěn) 定性和抗氧化、抗光解能力，配合其它組分可使本發(fā)明在2-8°C下，能保存24個月。同時羥丙 基-β-環(huán)糊精作為穩(wěn)定劑，能使TMB顯色液在強酸終止反應(yīng)后，信號穩(wěn)定時間更長。
[0010] 作為本發(fā)明所述單組份TMB顯色液的優(yōu)選實施方式，所述吐溫-80在TMB顯色液中 的質(zhì)量濃度為1~15g/L;所述羥丙基-β-環(huán)糊精在TMB顯色液中的質(zhì)量濃度為2~9g/L。作為 本發(fā)明所述單組份TMB顯色液的更優(yōu)選實施方式，所述吐溫-80在TMB顯色液中的質(zhì)量濃度 為4~10g/L;所述羥丙基-β-環(huán)糊精在TMB顯色液中的質(zhì)量濃度為2.5~5g/L。
[0011] 作為本發(fā)明所述單組份TMB顯色液的優(yōu)選實施方式，所述單組份TMB顯色液還包含 DMS0、磷酸氫二鈉、檸檬酸和過氧化氫;所述DMSO在TMB顯色液中的體積濃度為5~40ml/L; 所述磷酸氫二鈉在TMB顯色液中的摩爾濃度為0.05-0. lmol/L;所述檸檬酸在TMB顯色液中 的摩爾濃度為0.03-0.05mol/L;所述過氧化氫在TMB顯色液中的體積濃度為1-1.25ml/L;所 述TMB在所述TMB顯色液中的質(zhì)量濃度為0.1-lg/L。
[0012] 二甲基亞砜(DMSO)是一種含硫有機(jī)化合物，常溫下為無色無臭的透明液體，是一 種吸濕性的可燃液體。具有高極性、高沸點、熱穩(wěn)定性好、非質(zhì)子、與水混溶的特性，能溶于 乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多數(shù)有機(jī)物，被譽為"萬能溶劑"。采用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液 作為基礎(chǔ)溶液，來溶解各物質(zhì)成分。TMB在過氧化氫的存在下，被氧化成最終產(chǎn)物。
[0013] 作為本發(fā)明所述單組份TMB顯色液的更優(yōu)選實施方式，所述DMSO在TMB顯色液中的 體積濃度為I〇~20ml/L;所述TMB在所述TMB顯色液中的質(zhì)量濃度為0.1-0.4g/L。本發(fā)明人 經(jīng)過大量實驗研究發(fā)現(xiàn)，各物質(zhì)在此含量范圍內(nèi)，TMB顯色液的各項性能達(dá)到最優(yōu)。
[0014] 作為本發(fā)明所述單組份TMB顯色液的優(yōu)選實施方式，所述TMB顯色液的pH為2.5-4.8。作為本發(fā)明所述單組份TMB顯色液的更優(yōu)選實施方式，所述TMB顯色液的pH為3.8-4.2。 [0015]同時，本發(fā)明還提供一種如上所述單組份TMB顯色液的制備方法，所述方法包括以 下步驟：
[0016] (1)配制磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液:稱取磷酸氫二鈉、檸檬酸溶于去離子水中，用 HCl調(diào)節(jié)pH至2.5~3.0，即得磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液；
[0017] ⑵稱取吐溫-80、羥丙基-β-環(huán)糊精和L-甲硫氨酸，邊攪拌邊將其加入到步驟（1) 所得的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，將其溶解直到溶液不再含有微小顆粒；
[0018] (3)稱取TMB，加入DMSO，使之充分溶解；
[0019] ⑷將步驟⑶所得的溶液加入步驟⑵所得的溶液中，充分?jǐn)嚢?，直到溶液不再?有微小顆粒；
[0020] (5)在步驟(4)所得溶液的上液中加入過氧化氫，邊加入邊攪拌，使之充分溶解；
[0021] (6)用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至2 · 0-4 · 8，加純水定容；
[0022] (7)過濾獲得均一的溶液，即為單組份TMB顯色液。
[0023]作為本發(fā)明所述單組份TMB顯色液的制備方法的優(yōu)選實施方式，所述步驟(6)中用 稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至3.8~4.2，然后再加純水定容。
[0024] 本發(fā)明所述單組份TMB顯色液，通過抗氧化劑L-甲硫氨酸的使用，可防止TMB的氧 化，使本發(fā)明中的TMB能穩(wěn)定保存24個月，同時，在終止反應(yīng)后能穩(wěn)定放置3小時以上，與現(xiàn) 有TMB需在終止反應(yīng)后30min內(nèi)讀數(shù)更加方便，更具靈活性。本發(fā)明所述單組份TMB顯色液的 制備方法，操作方便，能夠快速高效制備得到本發(fā)明的單組份TMB顯色液。
【具體實施方式】
[0025] 為更好的說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點，下面將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明 作進(jìn)一步說明。
[0026] 實施例1
[0027] 本發(fā)明單組份TMB顯色液的一種實施例，本實施例所述單組份TMB顯色液包含以下 成分:TMB、吐溫80、羥丙基-β-環(huán)糊精、L-甲硫氨酸、DMSO、磷酸氫二鈉、檸檬酸、過氧化氫;其 中，所述TMB在所述單組份TMB顯色液中的質(zhì)量濃度為0. lg/L，所述吐溫80在所述單組份TMB 顯色液中的質(zhì)量濃度為4g/L，所述羥丙基-β-環(huán)糊精在所述單組份TMB顯色液中的質(zhì)量濃度 為2.5g/L，所述L-甲硫氨酸在所述單組份TMB顯色液中的質(zhì)量濃度為0.3g/L，所述DMSO在所 述單組份TMB顯色液中的體積濃度為20ml/L，所述磷酸氫二鈉在所述單組份TMB顯色液中的 摩爾濃度為〇.lmol/L，所述檸檬酸在所述單組份TMB顯色液中的摩爾濃度為0.05mol/L，所 述過氧化氫在所述單組份TMB顯色液中的體積濃度為lml/L。
[0028] 本實施例所述單組份TMB顯色液采用以下方法制備而成：
[0029] (1)配制磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液:將稱量好的磷酸氫二鈉、檸檬酸溶于去離子 水中，用HCl調(diào)節(jié)pH至2.5~3.0，即得磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液；
[0030] (2)將稱量好的吐溫-80、羥丙基-β-環(huán)糊精和L-甲硫氨酸，邊攪拌邊將其加入到步 驟(1)所得的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，將其溶解直到溶液不再含有微小顆粒；
[0031] (3)將稱量好的ΤΜΒ，加入到量取好的DMSO中，使之充分溶解；
[0032] (4)將步驟(3)所得的溶液加入步驟(2)所得的溶液中，充分?jǐn)嚢?，直到溶液不再?有微小顆粒；
[0033] (5)在步驟(4)所得溶液的上液中加入量取好的過氧化氫，邊加入邊攪拌，使之充 分溶解；
[0034] (6)用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0-4.8，加純水定容至1000 ml;
[0035] (7)過濾獲得均一的溶液，即為本實施例所述一種單組份TMB顯色液。
[0036] 實施例2
[0037] 本發(fā)明單組份TMB顯色液的一種實施例，本實施例所述單組份TMB顯色液包含以下 成分:TMB、吐溫80、羥丙基-β-環(huán)糊精、L-甲硫氨酸、DMSO、磷酸氫二鈉、檸檬酸、過氧化氫;其 中，所述TMB在所述單組份TMB顯色液中的質(zhì)量濃度為0.2g/L，所述吐溫80在所述單組份TMB 顯色液中的質(zhì)量濃度為6g/L，所述羥丙基-β-環(huán)糊精在所述單組份TMB顯色液中的質(zhì)量濃度 為4g/L，所述L-甲硫氨酸在所述單組份TMB顯色液中的質(zhì)量濃度為0.2g/L，所述DMSO在所述 單組份TMB顯色液中的體積濃度為15ml/L，所述磷酸氫二鈉在所述單組份TMB顯色液中的摩 爾濃度為〇.〇8mol/L，所述檸檬酸在所述單組份TMB顯色液中的摩爾濃度為0.04mol/L，所述 過氧化氫在所述單組份TMB顯色液中的體積濃度為I. lml/L。
[0038]本實施例所述單組份TMB顯色液采用如實施例1所述方法制備而成。
[0039] 實施例3
[0040] 本發(fā)明單組份TMB顯色液的一種實施例，本實施例所述單組份TMB顯色液包含以下 成分:TMB、吐溫80、羥丙基-β-環(huán)糊精、L-甲硫氨酸、DMSO、磷酸氫二鈉、檸檬酸、過氧化氫;其 中，所述TMB在所述單組份TMB顯色液中的質(zhì)量濃度為0.4g/L，所述吐溫80在所述單組份TMB 顯色液中的質(zhì)量濃度為l〇g/L，所述羥丙基-β-環(huán)糊精在所述單組份TMB顯色液中的質(zhì)量濃 度為5g/L，所述L-甲硫氨酸在所述單組份TMB顯色液中的質(zhì)量濃度為0. lg/L，所述DMSO在所 述單組份TMB顯色液中的體積濃度為10ml/L，所述磷酸氫二鈉在所述單組份TMB顯色液中的 摩爾濃度為〇.〇5mol/L，所述檸檬酸在所述單組份TMB顯色液中的摩爾濃度為0.03mol/L，所 述過氧化氫在所述單組份TMB顯色液中的體積濃度為1.2ml/L。
[0041 ]本實施例所述單組份TMB顯色液采用如實施例1所述方法制備而成。
[0042] 實施例4
[0043] 本發(fā)明單組份TMB顯色液的一種實施例，本實施例所述單組份TMB顯色液包含以下 成分:TMB、吐溫80、羥丙基-β-環(huán)糊精、L-甲硫氨酸、DMSO、磷酸氫二鈉、檸檬酸、過氧化氫;其 中，所述TMB在所述單組份TMB顯色液中的質(zhì)量濃度為0.6g/L，所述吐溫80在所述單組份TMB 顯色液中的質(zhì)量濃度為lg/L，所述羥丙基-β-環(huán)糊精在所述單組份TMB顯色液中的質(zhì)量濃度 為2g/L，所述L-甲硫氨酸在所述單組份TMB顯色液中的質(zhì)量濃度為I g/L，所述DMSO在所述單 組份TMB顯色液中的體積濃度為40ml/L，所述磷酸氫二鈉在所述單組份TMB顯色液中的摩爾 濃度為O.lmol/L，所述檸檬酸在所述單組份TMB顯色液中的摩爾濃度為0.03mol/L，所述過 氧化氫在所述單組份TMB顯色液中的體積濃度為1.25ml/L。
[0044] 本實施例所述單組份TMB顯色液采用如實施例1所述方法制備而成。
[0045] 實施例5
[0046] 本發(fā)明單組份TMB顯色液的一種實施例，本實施例所述單組份TMB顯色液包含以下 成分:TMB、吐溫80、羥丙基-β-環(huán)糊精、L-甲硫氨酸、DMSO、磷酸氫二鈉、檸檬酸、過氧化氫;其 中，所述TMB在所述單組份TMB顯色液中的質(zhì)量濃度為0.8g/L，所述吐溫80在所述單組份TMB 顯色液中的質(zhì)量濃度為8g/L，所述羥丙基-β-環(huán)糊精在所述單組份TMB顯色液中的質(zhì)量濃度 為6g/L，所述L-甲硫氨酸在所述單組份TMB顯色液中的質(zhì)量濃度為0.5g/L，所述DMSO在所述 單組份TMB顯色液中的體積濃度為30ml/L，所述磷酸氫二鈉在所述單組份TMB顯色液中的摩 爾濃度為〇.〇5mol/L，所述檸檬酸在所述單組份TMB顯色液中的摩爾濃度為0.04mol/L，所述 過氧化氫在所述單組份TMB顯色液中的體積濃度為1.15ml/L。
[0047] 本實施例所述單組份TMB顯色液采用如實施例1所述方法制備而成。
[0048] 實施例6
[0049] 本發(fā)明單組份TMB顯色液的一種實施例，本實施例所述單組份TMB顯色液包含以下 成分:TMB、吐溫80、羥丙基-β-環(huán)糊精、L-甲硫氨酸、DMSO、磷酸氫二鈉、檸檬酸、過氧化氫;其 中，所述TMB在所述單組份TMB顯色液中的質(zhì)量濃度為I g/L，所述吐溫80在所述單組份TMB顯 色液中的質(zhì)量濃度為15g/L，所述羥丙基-β-環(huán)糊精在所述單組份TMB顯色液中的質(zhì)量濃度 為9g/L，所述L-甲硫氨酸在所述單組份TMB顯色液中的質(zhì)量濃度為0.02g/L，所述DMSO在所 述單組份TMB顯色液中的體積濃度為5ml/L，所述磷酸氫二鈉在所述單組份TMB顯色液中的 摩爾濃度為〇.〇8mol/L，所述檸檬酸在所述單組份TMB顯色液中的摩爾濃度為0.05mol/L，所 述過氧化氫在所述單組份TMB顯色液中的體積濃度為1.05ml/L。
[0050]本實施例所述單組份TMB顯色液采用如實施例1所述方法制備而成。
[0051 ] 實施例7
[0052] 本發(fā)明所述單組份TMB顯色液和商品化TMB顯色液的顯色效果對比測試
[0053] 本實施例分別設(shè)置對照組1~2、試驗組1~6,所述對照組的TMB顯色液采用商品化 的TMB顯色液，直接購買于市場(對照組1的TMB顯色液購買自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公 司，Substrate TMB;對照組2的TMB顯色液購買自深圳欣博盛生物科技有限公司，顯色底物 (TMB))。所述試驗組1~6的TMB顯色液分別采用實施例1~6制備而成的TMB顯色液。
[0054] 采用如下具體實驗方法進(jìn)行本發(fā)明所述TMB顯色液和對照組TMB顯色液的顯色效 果對比測試：
[0055] (1)于空白測試板中加入IOOyL商品化的HRP(用0.OlM PBS稀釋成一定的濃度梯 度），同時設(shè)置未含HRP的空白對照組；
[0056] (2)各孔分別加入IOOyL對照組1~2、試驗組1~6的TMB顯色液，室溫避光靜置 15min；
[0057] (3)各孔加入50yL終止液，輕微平行振蕩30秒；
[0058] (4)于450nm波長處讀取各孔OD值，結(jié)果如表1所示。
[0059] 表1本發(fā)明所述TMB顯色液和商品化TMB顯色液各組的OD值
[0061 ] 從以上結(jié)果可以看出，當(dāng)HRP稀釋比例相同時，對照組1~2和試驗組1~6中各孔的 OD值相當(dāng)，由此可以看出，本發(fā)明所述的TMB顯色液與商品化的TMB顯色液的顯色效果相當(dāng)。 [0062] 實施例8
[0063] 本發(fā)明TMB顯色液的穩(wěn)定性試驗
[0064] 試驗設(shè)置對照組1~3和試驗組1~6,試驗組1~6分別采用實施例1~6制備得到的 TMB顯色液，對照組1~3的顯色液配方分別如下：
[0065]對照組1的TMB顯色液除不含L-甲硫氨酸外，其余成分及含量均與本發(fā)明相同； [0066]對照組2的TMB顯色液除不含吐溫80外，其余成分及含量均與本發(fā)明相同；
[0067]對照組3的TMB顯色液除不含羥丙基-β-環(huán)糊精外，其余成分及含量均與本發(fā)明相 同。
[0068]對照組1~3的TMB顯色液均采用本發(fā)明的方法制備而成。
[0069] 分別將對照組1~3和試驗組1~6的TMB顯色液在常溫下放置1個月，然后觀察各組 TMB顯色液的澄明度和顏色，結(jié)果如表2所示。
[0070] 表2各組TMB顯色液放置1個月后的澄明度和顏色
[0072]由表2可看出，L-甲硫氨酸的加入可有效防止TMB的非酶氧化，提高TMB溶液的穩(wěn)定 性。而只含有吐溫80和羥丙基-β-環(huán)糊精中一種的對照組2和3,放置一個月后會有結(jié)晶析 出，即對照組2和3的TMB顯色液放置1個月后有TMB析出，而同時含有吐溫80和羥丙基-β-環(huán) 糊精的試驗組和對照組1，放置1個月后液體仍然澄清無結(jié)晶，由此可證明，吐溫80和羥丙 基-β-環(huán)糊精的加入具有相互作用的協(xié)同作用，能夠顯著提高TMB的水溶性。
[0073] 實施例9
[0074] 本發(fā)明所述TMB顯色液的顯色信號穩(wěn)定性測試。
[0075] 試驗設(shè)置對照組1~3和試驗組1~6，對照組1~3和試驗組1~6同實施例8。
[0076]測試方法為：
[0077] (1)于空白測試板中加入IOOyL商品化的HRP(用0.OlM PBS稀釋成一定的濃度梯 度），同時設(shè)置未含HRP的空白對照組；
[0078] (2)各孔分別加入IOOyL對照組1~2、試驗組1~6的TMB顯色液，室溫避光靜置 15min；
[0079] (3)各孔加入50yL終止液終止反應(yīng)后，于Oh、0.5h、Ih、2h、3h進(jìn)行0D450檢測，各孔 每次的OD值如下表所示。
[0080] 表3各組反應(yīng)終止后隨著放置時間的不同各組OD值的變化情況對比
[0083] 由以上結(jié)果可知，對照組1~3的TMB顯色液在反應(yīng)終止后3h內(nèi)OD值的變化率為 50 %~70 %，試驗組1~6的TMB顯色液在反應(yīng)終止后3h內(nèi)OD值的變化率最大不超過7.50 %， 由此可以得出，本發(fā)明所述的單組份TMB顯色液可以在反應(yīng)后穩(wěn)定保存3h，與現(xiàn)有TMB需要 在反應(yīng)終止后30min內(nèi)讀數(shù)更加方便，更具靈活性。
[0084] 實施例10
[0085]本發(fā)明所述TMB顯色液的穩(wěn)定性測試。
[0086] 本試驗分為試驗組1~6，六組試驗組中的TMB顯色液分別為實施例1~6中所述的 TMB顯色液。試驗方法為將實施例1~6中所述的TMB顯色液分別放置于2-8°C環(huán)境下，保存至 O個月、6個月、12個月、18個月、24個月，然后按照實施例7中所述的方法進(jìn)行試驗。其中空白 對照組為不含HRP的PBS為樣本。各組的OD值測試結(jié)果表4所示。
[0087] 表4本發(fā)明所述TMB顯色液的穩(wěn)定性測試

[0090] 由以上結(jié)果可以看出，本發(fā)明所述的單組份TMB顯色液放置至0個月、6個月、12個 月、18個月、24個月后其數(shù)值變化率最大不超過7.0%，表明本發(fā)明所述的TMB顯色液穩(wěn)定性 良好，可以在2_8°C下穩(wěn)定保存24個月。
[0091] 最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保 護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng) 理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì) 和范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種單組份TMB顯色液，包含TMB，其特征在于，所述單組份TMB顯色液還包含L-甲硫 氨酸。2. 如權(quán)利要求1所述的單組份TMB顯色液，其特征在于，所述L-甲硫氨酸在TMB顯色液中 的質(zhì)量濃度為0.02~lg/L。3. 如權(quán)利要求2所述的單組份TMB顯色液，其特征在于，所述L-甲硫氨酸在TMB顯色液中 的質(zhì)量濃度為0.1~〇.3g/L。4. 如權(quán)利要求1~3任一項所述的單組份TMB顯色液，其特征在于，所述單組份TMB顯色 液還包含吐溫80和羥丙基-β-環(huán)糊精。5. 如權(quán)利要求4所述的單組份TMB顯色液，其特征在于，所述吐溫-80在TMB顯色液中的 質(zhì)量濃度為1~15g/L;所述羥丙基-β-環(huán)糊精在TMB顯色液中的質(zhì)量濃度為2~9g/L。6. 如權(quán)利要求5所述的單組份TMB顯色液，其特征在于，所述吐溫-80在TMB顯色液中的 質(zhì)量濃度為4~10g/L;所述羥丙基-β-環(huán)糊精在TMB顯色液中的質(zhì)量濃度為2.5~5g/L。7. 如權(quán)利要求1-6任一項所述的單組份TMB顯色液，其特征在于，所述TMB顯色液還包含 DMS0、磷酸氫二鈉、檸檬酸和過氧化氫;所述DMSO在TMB顯色液中的體積濃度為5~40ml/L; 所述磷酸氫二鈉在TMB顯色液中的摩爾濃度為0.05-0. lmol/L;所述檸檬酸在TMB顯色液中 的摩爾濃度為0.03-0.05mol/L;所述過氧化氫在TMB顯色液中的體積濃度為1-1.25ml/L;所 述TMB在所述TMB顯色液中的質(zhì)量濃度為0.1-lg/L。8. 如權(quán)利要求7所述的單組份TMB顯色液，其特征在于，所述DMSO在TMB顯色液中的體積 濃度為10~20ml/L;所述TMB在所述TMB顯色液中的質(zhì)量濃度為0.1-0.4g/L。9. 如權(quán)利要求1~8任一項所述的單組份TMB顯色液，其特征在于，所述TMB顯色液的pH 為2·5-4·8〇10. -種如權(quán)利要求1~9所述單組份TMB顯色液的制備方法，其特征在于，所述方法包 括以下步驟： (1) 配制磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液:稱取磷酸氫二鈉、檸檬酸溶于去離子水中，用HCl 調(diào)節(jié)pH至2.5~3.0，即得磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液； (2) 稱取吐溫-80、羥丙基-β-環(huán)糊精和L-甲硫氨酸，邊攪拌邊將其加入到步驟（1)所得 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，將其溶解直到溶液不再含有微小顆粒； (3) 稱取TMB，加入DMSO，使之充分溶解； (4) 將步驟(3)所得的溶液加入步驟(2)所得的溶液中，充分?jǐn)嚢?，直到溶液不再含有?小顆粒； (5) 在步驟(4)所得溶液的上液中加入過氧化氫，邊加入邊攪拌，使之充分溶解； (6) 用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0-4.8，加純水定容； (7) 過濾獲得均一的溶液，即為單組份TMB顯色液。
【文檔編號】G01N33/531GK105891202SQ201610391284
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年6月3日
【發(fā)明人】李民友, 張玲, 李妙紅, 藍(lán)媛, 齊宗獻(xiàn)
【申請人】廣州市進(jìn)德生物科技有限公司