一種抗體修飾納米微球電泳流動(dòng)型elisa的方法
【專(zhuān)利摘要】一種抗體修飾納米微球電泳流動(dòng)型ELISA的方法，屬于生物材料領(lǐng)域。第一抗體吸附在多孔膜表面，再進(jìn)行封閉劑蛋白吸附；抗原?第一抗體反應(yīng)；電泳驅(qū)動(dòng)抗體修飾納米微球，進(jìn)行第二抗體?抗原反應(yīng)，對(duì)酶標(biāo)第二抗體進(jìn)行顯色定量：電泳驅(qū)動(dòng)第二抗體?抗原反應(yīng)后，將多孔膜清洗，所得多孔膜基片放入第二抗體標(biāo)識(shí)酶的底物溶液中，進(jìn)行顯色；通過(guò)檢測(cè)吸光度，進(jìn)行抗原定量分析。采用正電性PDDA/PSS修飾醋酸纖維素膜PEMs?CA，羧基聚苯乙烯納米微球?yàn)槊笜?biāo)第二抗體修飾的載體。PEMs修飾降低了非特異性吸附，抗體修飾納米微球起到信號(hào)放大的作用，電泳驅(qū)動(dòng)力使第二抗體短時(shí)間內(nèi)局部濃縮到抗原周?chē)?，?shí)現(xiàn)了快速靈敏的檢測(cè)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種抗體修飾納米微球電泳流動(dòng)型EL ISA的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物材料技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及抗體修飾納米微球(NP-Ab)的制備，及電 泳驅(qū)動(dòng)NP-Ab流動(dòng)檢測(cè)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)，酶（一般為辣 根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶)標(biāo)記在抗原或者抗體上，由于抗原和抗體的特異性反應(yīng)和酶 催化底物作用結(jié)合，通過(guò)其顏色變化檢測(cè)和定量少量蛋白質(zhì)的試驗(yàn)方法，其檢測(cè)限(L0D)為 O.lng到lyg/mL，廣泛應(yīng)用于食品、工業(yè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、和臨床醫(yī)學(xué)等諸多領(lǐng)域。由于近年來(lái)越 來(lái)越多蛋白質(zhì)標(biāo)志物的出現(xiàn)，對(duì)疾病檢測(cè)的要求也越來(lái)越高。但是ELI SA在常規(guī)的聚苯乙烯 基板(polystyrene:PS)基板上的靜態(tài)溫育反應(yīng)存在以下幾個(gè)問(wèn)題：（1)在PS上的第一抗體 容易變性，并且與抗原反應(yīng)的部位不容易裸露在基片表面；（2)封閉效果不佳，導(dǎo)致抗原及 第二抗體的非特異性吸附，影響了ELISA系統(tǒng)的靈敏度；（3)在抗原抗體反應(yīng)過(guò)程中，抗原需 要長(zhǎng)時(shí)間的自由擴(kuò)散，長(zhǎng)時(shí)間的溫育反應(yīng)成為限速步驟，導(dǎo)致緩慢的結(jié)合速度，影響了分析 的靈敏度和動(dòng)態(tài)量程。雖然有很多通過(guò)納米材料制備來(lái)提高ELISA系統(tǒng)靈敏度的研究，但其 操作復(fù)雜及成本過(guò)高，導(dǎo)致難以實(shí)際應(yīng)用。另外，微細(xì)加工芯片牌組器、微陣列芯片、微流體 技術(shù)，卻由于其表面修飾技術(shù)的欠缺、操作的復(fù)雜性等弊端不能廣泛的應(yīng)用于高靈敏度的 臨床檢測(cè)。針對(duì)以上ELISA系統(tǒng)的檢測(cè)弊端，因此，尋找一種可以"快速-靈敏-簡(jiǎn)便"檢測(cè) ELISA系統(tǒng)顯得尤為重要。將抗體修飾納米微球與電泳技術(shù)有機(jī)融合在ELISA系統(tǒng)中，解決 常規(guī)ELISA體系非特異性吸附高、反應(yīng)效率低、混合樣品檢測(cè)困難等問(wèn)題，具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于解決ELISA系統(tǒng)中樣品檢測(cè)低效率問(wèn)題并進(jìn)一步解決低靈敏度 的問(wèn)題，而提供一種聚電解質(zhì)多層膜基片電泳流動(dòng)型ELISA方法，尤其提供一種NP-Ab電泳 流動(dòng)型ELI SA方法，以解決【背景技術(shù)】中存在的問(wèn)題。本發(fā)明所提供一種NP-Ab電泳流動(dòng)型 ELISA方法中，表面羧基化納米微球修飾酶標(biāo)識(shí)抗體，在抗原抗體特異性反應(yīng)中起到信號(hào)放 大的作用，大大提高了檢測(cè)靈敏度。其次電泳技術(shù)作為ELISA體系中NP-Ab流動(dòng)檢測(cè)的驅(qū)動(dòng) 方式，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。
[0004] 本發(fā)明所提供的一種NP-Ab電泳流動(dòng)型ELISA的方法，其特征在于，包括以下步驟：
[0005] (1)將第一抗體吸附到聚電解質(zhì)修飾的多孔膜基片上；
[0006] (2)吸附第一抗體的多孔膜基片再進(jìn)行封閉劑蛋白吸附；
[0007] (3)抗原-第一抗體反應(yīng):將步驟(2)第一抗體和封閉劑蛋白吸附后的多孔膜基片 加入到抗原溶液中，進(jìn)行抗原-第一抗體反應(yīng)；
[0008] (4)電泳驅(qū)動(dòng)NP-Ab-抗原反應(yīng):將步驟(3)抗原-第一抗體反應(yīng)后的多孔膜基片固 定在電泳裝置中，在電泳裝置中所述的多孔膜基片一側(cè)注入NP-Ab磷酸鹽緩沖液即電泳溶 液，插入負(fù)電極，多孔膜基片另一側(cè)注入磷酸鹽緩沖溶液，插入正電極;正電極和負(fù)電極加 電壓，進(jìn)行抗原-第二抗體反應(yīng)；
[0009] (5)對(duì)酶標(biāo)第二抗體進(jìn)行顯色定量:將步驟(4)電泳驅(qū)動(dòng)NP-Ab-抗原反應(yīng)后的多孔 膜基片放入到第二抗體標(biāo)識(shí)酶的底物溶液中，進(jìn)行顯色;通過(guò)檢測(cè)吸光度，進(jìn)行抗原定量分 析。
[0010] 優(yōu)選上述步驟(1)多孔膜基片是聚電解質(zhì)多層膜修飾的醋酸纖維素多孔膜(PEMs-CA)，PEMs-CA是依次利用聚(二烯丙基二甲基氯化銨)和聚苯乙烯硫酸鈉交叉層疊修飾的CA 多孔膜且修飾的最外層是聚（二烯丙基二甲基氯化銨），得到正電性的PDDA/PSS修飾CA，即 PEMs-CA，優(yōu)選PEMs-CA中聚(二烯丙基二甲基氯化銨)和聚苯乙烯硫酸鈉交叉層疊修飾7層， 通過(guò)其表面電荷性提高第一抗體與封閉劑(卵清蛋白o(hù)valbumin: 0VA)的吸附量，提高抗原 與抗體反應(yīng)的密度(信號(hào)）、抑制抗原和第二抗體的非特異性吸附（噪音），進(jìn)而大幅度提高 靈敏性(信號(hào)與噪音比例）。上述多孔膜基片選取醋酸纖維素(cellulose acetate，CA)多孔 膜基片，醋酸纖維素多孔膜的孔徑優(yōu)選450nm;選取TODA/PSS修飾的醋酸纖維素膜為PEMs-CA作為檢測(cè)溶液透過(guò)基片。
[0011] 進(jìn)一步優(yōu)選步驟(4)NP-Ab為:羧基化聚苯乙烯納米微球(微球直徑優(yōu)選為200nm)， 通過(guò)化學(xué)方法將納米微球表面的羧基和酶標(biāo)抗體分子的氨基偶聯(lián)，進(jìn)行偶聯(lián)時(shí)酶標(biāo)抗體分 子濃度為15-240yg/mL，微球濃度為l-5mg/mL; B y G作為模型蛋白優(yōu)化酶標(biāo)第二抗體及納米 微球偶聯(lián)濃度條件，優(yōu)選酶標(biāo)抗體分子濃度與微球濃度分別為60iig/mL，lmg/mL，得到每個(gè) 納米微球表面修飾酶標(biāo)第二抗體的數(shù)量約48個(gè)。
[0012] 進(jìn)一步優(yōu)選步驟(4)電泳驅(qū)動(dòng)NP-Ab-抗原反應(yīng)的電泳電壓和電泳時(shí)間，電泳的電 壓大小決定NP-Ab的移動(dòng)速度；電泳時(shí)間的長(zhǎng)短影響NP-Ab與抗原的結(jié)合效率。所以進(jìn)一步 調(diào)節(jié)電泳的電壓與時(shí)間，從而進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度。電泳電壓與時(shí)間優(yōu)化范圍為25-35V 和l_5min，進(jìn)一步優(yōu)選電泳電壓與時(shí)間為30v、2min。
[0013] 在此電泳流動(dòng)型ELISA系統(tǒng)中，NP-Ab濃度可進(jìn)行調(diào)節(jié)，通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)NP-Ab濃度 進(jìn)行最優(yōu)化，確定NP-Ab的最佳濃度為100iig/mL。利用此濃度檢測(cè)抗原的定量曲線(xiàn)，得到最 低檢測(cè)限為〇.13pM。比傳統(tǒng)ELISA檢測(cè)水平高出254倍，檢測(cè)速度提高了30倍。
[0014]本發(fā)明具有以下有益效果：
[0015] 1)本發(fā)明所提供的NP-Ab電泳流動(dòng)型ELI SA的方法，創(chuàng)制電泳環(huán)境中能夠高效抑制 ELISA非特異性吸附的PEMs。
[0016] 2)本發(fā)明所提供的NP-Ab電泳流動(dòng)型ELISA的方法，創(chuàng)制能夠起到信號(hào)放大作用的 NP-Ab〇
[0017] 3)本發(fā)明所提供的NP-Ab電泳流動(dòng)型ELISA的方法，創(chuàng)制靈敏、快速、簡(jiǎn)便的電泳流 動(dòng)型ELISA系統(tǒng)。電泳驅(qū)動(dòng)型有效控制帶負(fù)電NP-Ab向正極電極方向流動(dòng)，所以在短時(shí)間的 流動(dòng)過(guò)程中使NP-Ab局部濃縮到多孔膜(即抗原)近旁，完成靈敏、快速的抗體-抗原反應(yīng)，與 傳統(tǒng)ELISA相比，既提高了靈敏度又大幅度縮短了反應(yīng)時(shí)間。
【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1本發(fā)明實(shí)施例所用電泳裝置示意圖。
[0019] 圖2 NP-Ab流動(dòng)型ELISA的檢測(cè)曲線(xiàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。如所用 溶液的濃度、pH值等可根據(jù)需要調(diào)節(jié)等。
[0021] 本發(fā)明實(shí)施例采用的電泳裝置見(jiàn)圖1。電泳裝置為一平放發(fā)的圓桶結(jié)構(gòu)，多孔膜位 于中間將圓桶一分為二，多孔膜的一側(cè)為NP-Ab溶液，端面設(shè)有溶液進(jìn)口和電極;另一側(cè)為 PB緩沖液，端面設(shè)有溶液進(jìn)口和電極。
[0022] 實(shí)施例1 [0023] 1 ?溶液的配置：
[0024] a)50mM Tris-HC1@0.15M NaCl溶液的配置：將1.15175g Tris-base固體溶于 125mL超純水中，取0.84mL HC1溶于100mL超純水中得0.1M HC1溶液，待溶解后將HC1溶液滴 加入Tris-base溶液中調(diào)pH = 7.4為止，定容至250mL，稱(chēng)量2.208g NaCl固體加入Tris-HCl 中。
[0025] b)pH=7.4濃度為0.15M磷酸鹽緩沖液(PB)的配置:稱(chēng)取10.74g Na2HP〇4 ? 12H20固 體加入到200mL超純水中，稱(chēng)取4.68g NaH2P〇4 ? 2H20固體加入到200mL超純水中，待溶解后 將NaH2P〇4溶液加入到Na2HP〇4溶液中，調(diào)pH=7 ? 4。
[0026] c)0.05%Tween 2000.03M PB配置：取250yL Tween-20加入到500mL 0.03M PB緩 沖液中。
[0027] d)2M H2SO4配置：取8mL超純水加入lmL濃H2S〇4(98%)。
[0028] 2.抗體修飾納米微球的制備方法：
[0029]活化緩沖液:0.1M PB，pH 6.3 [0030]偶聯(lián)緩沖液:0.1M PB，pH 7.4 [0031] 封閉液:5mg/ml卵清蛋白（OVA)溶液
[0032] 活化劑：10mg/ml碳化二亞胺鹽酸(EDC)與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)。
[0033] 1)配置微球溶液:取一定質(zhì)量羧基化聚苯乙烯微球(體積根據(jù)固含量計(jì)算)置于離 心管中（羧基化聚苯乙烯微球粒徑為200nm)，加入活化緩沖液稀釋?zhuān)暬靹颍x心 (14000rpm，13min)，隨后加入活化緩沖液，超聲混勻。
[0034] 2)活化聚苯乙烯表面的羧基：采用活化緩沖液配置EDC和NHS溶液，將一定體積的 EDC和NHS溶液迅速加入微球溶液中，漩渦混勻，靜置20分鐘。
[0035] 3)清洗微球:將活化后的納米微球離心，棄去上清液，加入偶聯(lián)緩沖液超聲分散， 上述步驟重復(fù)兩次。
[0036] 4)偶聯(lián)酶標(biāo)抗體:將步驟3)得到的納米微球中加入酶標(biāo)抗體溶液，（微球濃度lmg/ mL，酶標(biāo)抗體濃度60yg/mL)立刻渦旋混勻，并超聲分散，隨后室溫反應(yīng)2h。
[0037] 5)封閉未反應(yīng)羧基:將步驟4)微球超聲分散，加入封閉液，室溫反應(yīng)lh，反應(yīng)后離 心清洗兩次。
[0038] 3.PEMS修飾CA多孔膜制備
[0039] 1)配制PDDA與PSS溶液。分別稱(chēng)取PDDA和PSS固體各2mg，分別溶于10mL 50mM Tris-HC1@0.15M NaCl pH=7.4的溶液中，得PDDA和PSS濃度為0.2mg/mL。
[0041 ] 2)PEMs修飾CA多孔膜制備。超純水浸濕的CA膜(孔徑450nm)放入roDA溶液中，室溫 下浸漬2min，之后用超純水清洗30s，洗去未吸附的聚電解質(zhì)溶液。然后放入PSS溶液中，室 溫下浸漬2min，之后用超純水清洗30s，以上TODA與PSS交替進(jìn)行，制備7層正電性的自組裝 多層膜PEMs ((PDDA/PSS) 3roDA)。
[0042] 4.NP-Ab電泳流動(dòng)型ELISA檢測(cè)
[0043] 1)第一抗體吸附實(shí)驗(yàn)。將TOMs-CA基片浸泡在60yg/mL兔抗鼠IgG抗體（rabbit anti-mouse IgG@0.03M PB)溶液中，室溫下吸附2h后，將CA膜用0.03M PB緩沖液清洗3次。 [0044] 2)封閉劑蛋白（卵清蛋白，0VA)吸附實(shí)驗(yàn)。第一抗體吸附的PEMs-CA基片放入lmg/ mL OVA溶液中，37°C下吸附lh，將PEMs-CA基片用0.03M PB緩沖液清洗3次。
[0045] 3)抗原與第一抗體反應(yīng)。將帶有第一抗體及0VA的TOMs-CA基片放入抗原溶液 (mouse IgG@0.03M PB)中，37°C下吸附lh后，用0.03M TO緩沖液清洗3次，不加抗原的溶液 PEMs-CA為對(duì)照組；
[0046] 4)優(yōu)化電泳電壓與時(shí)間，電泳驅(qū)動(dòng)N P - A b -抗原反應(yīng)。將吸附第一抗體與抗原的 PEMs-CA基片固定在玻璃分離腔中央(圖1)，分離腔入口側(cè)注入lmL 100yg/mLNP-Ab溶液，分 離腔出口處加入0.03M PB溶液。入口側(cè)接入電源負(fù)極，出口側(cè)接入電源正極。分別調(diào)節(jié)電壓 為25￥、3(^、35￥，時(shí)間為1111111、2111111、5111111，進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)。將電泳后的?￡]\^-04基片，經(jīng) 過(guò)0.05%了￥6611-20@0.0311?8緩沖液清洗1次、0.0311?8緩沖液清洗3次 ；
[0047] 5)酶標(biāo)顯色定量。將PEMs-CA基片加入到0.4mL的四甲基聯(lián)苯胺溶液(TMB)，室溫下 避光反應(yīng)30min后，再加入0.4mL 2M H2S〇4溶液，終止反應(yīng)。通過(guò)檢測(cè)450nm處吸光度，進(jìn)行抗 原定量。
[0048] 6)PEMs-CA基片電泳流動(dòng)型ELISA檢測(cè)曲線(xiàn)測(cè)定。通過(guò)測(cè)定不同電壓與時(shí)間下的檢 測(cè)靈敏度(信噪比值(S/N))(信號(hào)S即為抗原存在時(shí)的第二抗體反應(yīng)信號(hào);噪音N即為無(wú)抗原 時(shí)，第二抗體非特異性吸附的信號(hào)），得到最優(yōu)的電壓與時(shí)間條件為30v，2min。再此條件下， 檢測(cè)不同濃度抗原的信號(hào)，獲得PEMs-CA基片電泳流動(dòng)型ELISA檢測(cè)曲線(xiàn)（圖2)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種抗體修飾納米微球電泳流動(dòng)型ELISA的方法，其特征在于，（I)將第一抗體吸附 到聚電解質(zhì)修飾的多孔膜基片上； (2) 吸附第一抗體的多孔膜基片再進(jìn)行封閉劑蛋白吸附； (3) 抗原-第一抗體反應(yīng):將步驟(2)第一抗體和封閉劑蛋白吸附后的多孔膜基片加入 到抗原溶液中，進(jìn)行抗原-第一抗體反應(yīng)； (4) 電泳驅(qū)動(dòng)NP-Ab-抗原反應(yīng):將步驟(3)抗原-第一抗體反應(yīng)后的多孔膜基片固定在 電泳裝置中，在電泳裝置中所述的多孔膜基片一側(cè)注入NP-Ab磷酸鹽緩沖液即電泳溶液，插 入負(fù)電極，多孔膜基片另一側(cè)注入磷酸鹽緩沖溶液，插入正電極;正電極和負(fù)電極加電壓， 進(jìn)行抗原-第二抗體反應(yīng)； (5) 對(duì)酶標(biāo)第二抗體進(jìn)行顯色定量:將步驟(4)電泳驅(qū)動(dòng)NP-Ab-抗原反應(yīng)后的多孔膜基 片放入到第二抗體標(biāo)識(shí)酶的底物溶液中，進(jìn)行顯色;通過(guò)檢測(cè)吸光度，進(jìn)行抗原定量分析。2. 按照權(quán)利要求1所述的一種抗體修飾納米微球電泳流動(dòng)型E LIS A的方法，其特征在 于，步驟(1)多孔膜基片是聚電解質(zhì)多層膜修飾的醋酸纖維素多孔膜PEMs-CA，PEMs-CA是依 次利用聚(二烯丙基二甲基氯化銨)和聚苯乙烯硫酸鈉交叉層疊修飾的CA多孔膜且修飾的 最外層是聚(二烯丙基二甲基氯化銨），得到正電性的H)DA/PSS修飾CA，即PEMs-CA。3. 按照權(quán)利要求2所述的一種抗體修飾納米微球電泳流動(dòng)型E LIS A的方法，其特征在 于，PEMs-CA中聚(二烯丙基二甲基氯化銨)和聚苯乙烯硫酸鈉交叉層疊修飾7層。4. 按照權(quán)利要求2所述的一種抗體修飾納米微球電泳流動(dòng)型E LIS A的方法，其特征在 于，醋酸纖維素多孔膜的孔徑優(yōu)選450nm。5. 按照權(quán)利要求1所述的一種抗體修飾納米微球電泳流動(dòng)型E LIS A的方法，其特征在 于，步驟(4)NP-Ab為:羧基化聚苯乙烯納米微球，通過(guò)化學(xué)方法將納米微球表面的羧基和酶 標(biāo)抗體分子的氨基偶聯(lián)，進(jìn)行偶聯(lián)時(shí)酶標(biāo)抗體分子濃度為15_240yg/mL，微球濃度為l-5mg/ mL〇6. 按照權(quán)利要求5所述的一種抗體修飾納米微球電泳流動(dòng)型E LIS A的方法，其特征在 于，B YG作為模型蛋白優(yōu)化酶標(biāo)第二抗體及納米微球偶聯(lián)濃度條件，得到酶標(biāo)抗體分子濃 度與微球濃度分別為60yg/mL、lmg/mL，每個(gè)納米微球表面修飾酶標(biāo)第二抗體的數(shù)量約48 個(gè)。7. 按照權(quán)利要求5所述的一種抗體修飾納米微球電泳流動(dòng)型E LIS A的方法，其特征在 于，微球直徑為200nm〇8. 按照權(quán)利要求1所述的一種抗體修飾納米微球電泳流動(dòng)型E LIS A的方法，其特征在 于，電泳電壓與時(shí)間范圍為25-35V和l-5min。9. 按照權(quán)利要求1所述的一種抗體修飾納米微球電泳流動(dòng)型E LIS A的方法，其特征在 于，電泳電壓與時(shí)間為30v、2min。10. 按照權(quán)利要求1所述的一種抗體修飾納米微球電泳流動(dòng)型ELI SA的方法，其特征在 于，NP-Ab的濃度為100yg/mL。
【文檔編號(hào)】G01N33/53GK105891306SQ201610476330
【公開(kāi)日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年6月24日
【發(fā)明人】申鶴云, 張芳芳
【申請(qǐng)人】北京化工大學(xué)