一種同時(shí)檢測(cè)中藥注射劑中多種真菌毒素的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種同時(shí)檢測(cè)中藥注射劑中多種真菌毒素的方法，通過(guò)樣品干燥、提取、離心處理后上清液干燥、復(fù)溶、經(jīng)固相萃取柱后進(jìn)行淋洗、洗脫、收集洗脫液、干燥再進(jìn)行復(fù)溶、過(guò)濾后進(jìn)入液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行定性或定量檢測(cè)。本發(fā)明在銀杏葉注射液、刺五加注射液、黃芪注射液、血塞通粉針等品種中驗(yàn)證了方法的線性、靈敏度、回收率、精密度及重現(xiàn)性，結(jié)果表明本發(fā)明檢測(cè)方法的上述指標(biāo)均良好。本發(fā)明方法為首次應(yīng)用于中藥注射劑中多種真菌毒素的檢測(cè)與分析，具有快速、簡(jiǎn)便、適用性廣等特點(diǎn)，對(duì)于控制中藥注射劑的風(fēng)險(xiǎn)、提高患者的用藥安全性具有重要的意義。
【專利說(shuō)明】
一種同時(shí)檢測(cè)中藥注射劑中多種真菌毒素的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于中藥檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種同時(shí)檢測(cè)中藥注射劑中多種真菌毒素的方 法，具體涉及采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定中藥注射劑中10種真菌毒素的方法，
【背景技術(shù)】
[0002] 中藥注射劑作為傳統(tǒng)醫(yī)藥理論與現(xiàn)代生產(chǎn)工藝相結(jié)合的產(chǎn)物，在心腦血管、腫瘤、 呼吸道等疾病治療中一直發(fā)揮著極其重要的作用。從上世紀(jì)四十年代問(wèn)世以來(lái)，中藥注射 劑的生產(chǎn)工藝愈加規(guī)范科學(xué)，有效性也在使用中得到了驗(yàn)證和肯定，然而在近年來(lái)的臨床 使用中，隨著不良反應(yīng)的日益暴露，其安全性已經(jīng)成為業(yè)內(nèi)目前最為關(guān)心的問(wèn)題。
[0003] 目前我國(guó)僅對(duì)少數(shù)中藥材中黃曲霉毒素進(jìn)行了限量，我國(guó)《藥用植物及制劑外經(jīng) 貿(mào)綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定中成藥及藥材中黃曲霉毒素Bl<5iig ? kgH;2010年版中國(guó)藥典規(guī) 定陳皮、僵蠶、胖大海、酸棗仁、桃仁五種藥材需要檢測(cè)黃曲霉毒素，規(guī)定黃曲霉毒素出不得 過(guò)5yg ? kg一S黃曲霉毒素出、82、61、62總量不得過(guò)10辟*1^一1。
[0004] 藥材從生長(zhǎng)、采集、貯存以及加工過(guò)程中均可能污染各種真菌并產(chǎn)生真菌毒素。中 藥注射劑的生產(chǎn)原料大多為中藥材及其提取物，一旦原材料受到真菌毒素的污染，常規(guī)的 方法一般無(wú)法將其徹底去除，往往會(huì)不可避免的污染注射劑成品。
[0005] 如果人們攝入的中藥被真菌毒素污染，則非但不能達(dá)到防病治病的效果，反而可 能深受其害。雖然真菌毒素殘留作為痕量外源性有毒有害物質(zhì)一般不表現(xiàn)出急性毒性，但 通常有較強(qiáng)的蓄積性，致癌、致畸、致突變作用明顯，并且由于使用中藥的人大多患有疾病 或者體質(zhì)虛弱，抵抗力不如健康人群，加之中藥注射劑獨(dú)特的給藥方式，真菌毒素造成的危 害可能更為嚴(yán)重。
[0006] 由于中藥注射劑往往基質(zhì)復(fù)雜，且含有很多如表面活性劑等成型用輔料，加之真 菌毒素種類繁雜，含量通常為ng級(jí)，這樣的特點(diǎn)要求檢測(cè)方法必須靈敏度高，對(duì)多種毒素盡 可能同時(shí)做出分析，以節(jié)省時(shí)間、成本和提高結(jié)果的全面性、可靠性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種同時(shí)檢測(cè)中藥注射劑中多種真菌毒素的方法，該方法 先對(duì)注射劑樣品進(jìn)行提取凈化處理，然后采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定樣品中多種真菌毒 素的含量。
[0008] 本發(fā)明通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)：
[0009] (1)取適量中藥注射劑液體或固體樣品，進(jìn)行干燥;干燥方法為氮?dú)獯蹈?、冷凍?燥或旋蒸中的任意一種；
[0010] (2)加入提取溶劑，進(jìn)行提取;提取溶劑為80 %~100 %乙臆-水溶液(v/v )，提取方 式為振蕩、禍旋、超聲中的任意一種；
[0011] (3)提取后，進(jìn)行離心處理，取部分上清液進(jìn)行干燥；
[0012] (4)將干燥后的樣品用純水或低濃度有機(jī)溶劑的水溶液進(jìn)行復(fù)溶;復(fù)溶用低濃度 有機(jī)溶劑為0.1%~5%乙腈-水溶液&八)或0.1%~20%甲醇-水溶液&八）；
[0013] (5)復(fù)溶液緩慢通過(guò)已活化好的固相萃取柱，然后用水或PBS溶液或低濃度有機(jī)溶 劑水溶液進(jìn)行淋洗;固相萃取柱為Waters HLB多功能柱；
[0014] (6)以適量洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集洗脫液;洗脫劑為甲醇、乙腈、酸化甲醇、酸化乙 腈中的任意一種；
[0015] (7)將洗脫液進(jìn)行干燥，并用30%乙腈溶液溶解，過(guò)濾，進(jìn)入液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行定性 或定量檢測(cè);檢測(cè)方法為同位素內(nèi)標(biāo)稀釋法。
[0016] 所述的中藥注射劑為銀杏葉注射液、丹紅注射液、銀杏達(dá)莫注射液、參麥注射液、 丹參川芎嗪注射液、醒腦靜注射液、血栓通注射液、川芎嗪注射液、疏血通注射液、康艾注射 液、參芪扶正注射液、香菇多糖注射液、艾迪注射液、炎琥寧注射液、痰熱清注射液、喜炎平 注射液、血必靜注射液、舒血寧注射液、刺五加注射液、黃芪注射液、雙黃連注射液或血塞通 粉針。
[0017] 所述的真菌毒素是黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、 赭曲霉毒素A、霉酸酸、T2毒素、玉米赤霉稀酮、玉米赤霉稀醇、嘔吐毒素。
[0018] 注射劑通常分為水針和粉針兩種，成品的生產(chǎn)實(shí)際上是原藥材的提取純化過(guò)程， 然而，大量的有效成分、色素及藥用輔料對(duì)于痕量的毒素測(cè)定來(lái)說(shuō)，仍存在著嚴(yán)重的基質(zhì)干 擾，大量預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，直接稀釋進(jìn)樣或稀釋后通過(guò)固相萃取柱的方法，檢測(cè)效果均不理想， 因此，本發(fā)明將干燥后的樣品先進(jìn)行提取，以期達(dá)到更好的凈化效果。
[0019] 提取溶劑的選擇尤為重要，適合提取溶劑的選擇原則是，對(duì)有效成分等有著較小 溶解性的同時(shí)，對(duì)毒素有著良好的溶解性。通過(guò)對(duì)多種注射劑品種及真菌毒素的基質(zhì)效應(yīng) 及提取效率的考察，高濃度的乙腈溶液成為了理想的選擇，加入后，能沉淀大部分雜質(zhì)，顯 著提高檢測(cè)的靈敏度。
[0020] 在固相萃取柱的選擇上，本發(fā)明比較了Romer Mycosep226和Waters HLB柱對(duì)多種 真菌毒素的回收效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Romer Mycosep226對(duì)0TA的回收率極低，而Waters HLB柱 對(duì)各毒素的回收率均較高，故最終選擇Waters HLB柱。
[0021] 本發(fā)明方法中色譜分離采用反相色譜柱，比較了Waters BEH-C18色譜柱（100* 2.10mm，1.7mi)'Waters BEH-C8色譜柱（100*2.10mm，1.7wn)、Kinetex 1.7yXB-C18 100A柱 三種色譜柱，分離效果均良好。
[0022] 本發(fā)明分別在三臺(tái)液質(zhì)儀（日本SMMADZU LCMS-8030、日本SMMADZU LCMS-8050、 加拿大IONIC 3Q 120)上考察了通用性，結(jié)果表明，即使在靈敏度及抗干擾能力較差的 LCMS-8030液質(zhì)儀上，方法學(xué)各指標(biāo)也都能達(dá)到要求。
[0023]本發(fā)明在銀杏葉注射液、刺五加注射液、黃芪注射液、血塞通粉針等品種中驗(yàn)證了 本發(fā)明方法的線性、靈敏度、回收率、精密度及重現(xiàn)性，結(jié)果表明本發(fā)明檢測(cè)方法的上述指 標(biāo)均良好。本發(fā)明方法為首次應(yīng)用于中藥注射劑中多種真菌毒素的檢測(cè)與分析，具有快速、 簡(jiǎn)便、適用性廣等特點(diǎn)，對(duì)于控制中藥注射劑的風(fēng)險(xiǎn)、提高患者的用藥安全性具有重要的意 義。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1為混合對(duì)照品溶液的總離子流圖，圖中1 .G2，2 ? G1，3 ? B2，4 ? B1，5 ? 0TA，6 ? T2， 7.MPA，8.ZAN，9.ZEN，10.D0N〇
[0025] 圖2為加標(biāo)供試品溶液的總離子流圖，圖中1 ? G2，2 ? G1，3 ? B2，4 ? B1，5 ? OTA，6 ? T2， 7.MPA，8.ZAN，9.ZEN，10.D0N〇
[0026] 圖3為供試品溶液的總離子流圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0028] 實(shí)施例1
[0029] 1、實(shí)驗(yàn)儀器與試劑
[0030]液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：日本SMMADZU島津公司液相色譜一串聯(lián)三重四極桿串聯(lián) 質(zhì)譜儀^^一8050，配有電噴霧離子源(￡31);111^柱((^13@，3(^，6011^);微孔濾膜(30八八-114,0.22_，上海安譜科學(xué)儀器有限公司）。氮?dú)獯蹈蓛x（N-EVAPTM112型，美國(guó) Organomation Associates，Inc公司）；分析天平（BS2202/TE-612-L/CP225D型電子天平，德 國(guó)Sartorius公司）；超聲波清潔器(KQ-500E型）；高速禍旋儀(WH-861型Vortex Shaker，上 海華利達(dá)公司）
[0031]甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水。黃曲霉毒素混合對(duì)照品溶液(美國(guó)SUPELC0公司 批號(hào)：LB80734黃曲霉毒素 GhGi 濃度分別為 0 ? 3μg/ml、1 ? 0μg/ml、0 ? 3μg/ml、1 ? Oyg/ ml)、赭曲霉毒素A(美國(guó)R0MER公司批號(hào)S11263Z濃度100μg/ml)、T-2毒素（J&K公司批號(hào)： LHA0M26濃度100μg/ml)、霉酚酸（美國(guó)R0MER公司批號(hào)L13331A濃度100μg/ml)、玉米赤霉烯 酮(美國(guó)R0MER公司批號(hào)S10404Z)、玉米赤霉烯醇(美國(guó)R0MER公司批號(hào)S10207Z)、脫氧雪腐 鐮刀菌烯醇(FLuka公司提供，批號(hào)：SZE8150XV)。5種同位素內(nèi)標(biāo)均購(gòu)自于美國(guó)R0MER公司： 13C-B1 (批號(hào) I13202A 濃度 0.5邱/1111)、13(：-(^^(批號(hào)1130846濃度10辟/1111)、13(：-12(批號(hào) I13022T 濃度 25μg/ml)、13C-ZEN(批號(hào) I12505B 濃度 25μg/ml)、13C-D0N(批號(hào) I13084A 濃度 25 μg/ml)。銀杏葉注射液樣品購(gòu)自杭州市場(chǎng)。
[0032] 2實(shí)驗(yàn)方法
[0033] 2.1色譜及質(zhì)譜條件
[0034] 2.1.1色譜條件
[0035] Waters BE1H-C18色譜柱（100*2 ? 10mm，1 ? 7ym);流動(dòng)相為甲醇(B)_5mmol/L醋酸銨 (A)，梯度洗脫（此處百分比為有機(jī)相B相）：0~6min，25% ;6~8min，70%~95% ;8~ 8.51^11，95%~100%;8.5~9.5111111，100%;9.5~9.6，100%~25% ;9.6~12111111，25%。流 速:0.3mL ? min-1;柱溫40°C ;進(jìn)樣量1此，結(jié)果見(jiàn)附圖1。
[0036] 2.1.2質(zhì)譜條件
[0037] 質(zhì)譜檢測(cè)采用正負(fù)兩種離子模式，進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)控模式(MRM)檢測(cè)。黃曲霉毒素等 15種真菌毒素質(zhì)譜條件見(jiàn)表1。
[0038]表1. 15種真菌毒素的質(zhì)譜參數(shù)
[0040] 2.2對(duì)照品及供試品溶液的配制
[0041 ] 2.2.1對(duì)照品溶液的制備
[0042]將10種毒素溶解后以特定比例混合，于40°C下氮?dú)獯蹈?，?0%乙腈復(fù)溶，配制成 含有黃曲霉毒素B2、G2為15ng/mL，黃曲霉毒素B1、G1、赭曲霉毒素A、T-2毒素、霉酚酸為 50ng/mL，玉米赤霉稀酮、玉米赤霉稀醇為250ng/mL，脫氧雪腐鐮刀菌稀醇為lyg/mL的混合 對(duì)照品工作液。將5種毒素內(nèi)標(biāo)溶液以特定比例混合，以30%乙腈稀釋成混合內(nèi)標(biāo)工作液 (13081、1300了八、130了2、13(：-2￡113(：-〇0咐農(nóng)度分別為4〇1^/11^、4〇1^/11^、4〇1^/11^、 200ng/mL、800ng/mL)。
[0043] 使用30 %乙腈進(jìn)行稀釋，配成一系列的對(duì)照品溶液_20°C下避光保存。
[0044] 2.2.2供試品溶液的制備
[0045]量取相當(dāng)于生藥量2g的銀杏葉注射液，置于50ml離心管中，加入混合內(nèi)標(biāo)工作液 100ul，混勻，于50°C下氮吹至近干，精密加入90%乙睛10ml，超聲提取30min，提取完成后， 12000rm離心10min，移取上清液5ml，于45°C氮?dú)獯蹈?，用乙?00yL復(fù)溶后加水稀釋至 25ml，渦旋混勻，待上樣。
[0046] 提取稀釋液緩慢通過(guò)已用3ml甲醇和3ml水活化的HLB柱，流速約lmL/min，加入roS 緩沖液5mL淋洗，靜置30min后，用含0.2 %甲酸的乙腈5ml洗脫，收集洗脫液，于45°C下氮?dú)?吹干，加入30 %乙腈溶液lml，超聲30s，渦旋lmin，通過(guò)0.22mi微孔濾膜即得。
[0047] 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0048] 3.1方法學(xué)考察
[0049] 3.1.1線性關(guān)系
[0050]以同位素內(nèi)標(biāo)工作液（濃度為40ng/ml)50ul分別加入至6個(gè)進(jìn)樣瓶中，氮?dú)獯蹈?后，取混合對(duì)照品工作液，以30%乙腈稀釋成6個(gè)不同濃度的對(duì)照品溶液(濃度分別為1、2、 5、10、20、50即/111〇，超聲10 8，渦旋11^11，進(jìn)入液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)，以色譜峰峰面積以)為縱坐標(biāo)， 進(jìn)樣濃度(X，ng ? mL-1)進(jìn)行線性回歸。線性范圍及回歸方程見(jiàn)表2,3。
[0051 ]表2.線性系列混合對(duì)照品溶液濃度表
[0054]表3. 10種毒素線性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0056] 3.1.2儀器精密度
[0057]取線性3號(hào)樣品，平行進(jìn)樣6次，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表4，表明儀器精密度 良好，達(dá)到檢測(cè)要求。
[0058]表4. 10種毒素的精密度結(jié)果
[0061 ] 3.1.3回收率
[0062]銀杏葉注射液移取相當(dāng)于2g藥材的樣品，一式6份，按低、中、高三種濃度水平分別 精密加入加樣回收率用混合對(duì)照品溶液(黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃 曲霉毒素G2、赭曲霉毒素A、T-2毒素、霉酚酸、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮及嘔吐毒素），按照 擬訂方法制備供試品溶液并測(cè)定含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表5及附圖2,表明回收率試 驗(yàn)結(jié)果良好。
[0063]表5.銀杏葉注射液10種真菌毒素的回收率試驗(yàn)結(jié)果
[0065] 3.1.4定量限
[0066] 取低濃度回收率的供試品溶液測(cè)定信噪比，以信噪比10:1計(jì)算方法定量限。
[0067]表6. 10種真菌毒素在銀杏葉注射液中的定量限
[0070] 3.1.5銀杏葉注射液檢測(cè)結(jié)果
[0071]采用本方法對(duì)30份銀杏葉注射液樣品進(jìn)行了 10種真菌毒素的同時(shí)檢測(cè)。結(jié)果表 明：絕大多數(shù)樣品中毒素檢測(cè)結(jié)果為陰性，結(jié)果見(jiàn)附圖3,僅在10號(hào)樣品中分別檢出2.41iig/ kg的OTA和4?95yg/kg的MPA。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種同時(shí)檢測(cè)中藥注射劑中多種真菌毒素的方法，其特征在于，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)： (1)取中藥注射劑液體或固體樣品，進(jìn)行干燥； ⑵加入提取溶劑，進(jìn)行提取;提取溶劑為80 %~100 %乙臆-水溶液(v/v); (3) 提取后，進(jìn)行離心處理，取上清液進(jìn)行干燥； (4) 將干燥后的樣品用純水或低濃度有機(jī)溶劑的水溶液進(jìn)行復(fù)溶，低濃度有機(jī)溶劑為 0· 1 %~5%乙腈-水溶液(v/v)或0.1%~20%甲醇-水溶液(v/v); (5) 復(fù)溶液緩慢通過(guò)已活化好的固相萃取柱，然后用水或PBS溶液或低濃度有機(jī)溶劑水 溶液進(jìn)行淋洗； (6) 用洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集洗脫液； (7) 將洗脫液進(jìn)行干燥，并用30%乙腈溶液溶解，過(guò)濾，進(jìn)入液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行定性或定 量檢測(cè)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時(shí)檢測(cè)中藥注射劑中多種真菌毒素的方法，其特征在 于，所述的真菌毒素是黃曲霉毒素 Bl、黃曲霉毒素 B2、黃曲霉毒素 Gl、黃曲霉毒素 G2、赭曲霉 毒素 A、霉酸酸、T2毒素、玉米赤霉稀酮、玉米赤霉稀醇、嘔吐毒素。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時(shí)檢測(cè)中藥注射劑中多種真菌毒素的方法，其特征在 于，所述的中藥注射劑為銀杏葉注射液、丹紅注射液、銀杏達(dá)莫注射液、參麥注射液、丹參川 芎嗪注射液、醒腦靜注射液、血栓通注射液、川芎嗪注射液、疏血通注射液、康艾注射液、參 芪扶正注射液、香菇多糖注射液、艾迪注射液、炎琥寧注射液、痰熱清注射液、喜炎平注射 液、血必靜注射液、舒血寧注射液、刺五加注射液、黃芪注射液、雙黃連注射液或血塞通粉 針。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時(shí)檢測(cè)中藥注射劑中多種真菌毒素的方法，其特征在 于，所述步驟(1)中干燥方法為氮?dú)獯蹈?、冷凍干燥、旋蒸中的任意一種。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時(shí)檢測(cè)中藥注射劑中多種真菌毒素的方法，其特征在 于，所述步驟(2)中提取方式為振蕩、渦旋、超聲中的任意一種。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時(shí)檢測(cè)中藥注射劑中多種真菌毒素的方法，其特征在 于，所述步驟(5)中固相萃取柱為Waters HLB多功能柱。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時(shí)檢測(cè)中藥注射劑中多種真菌毒素的方法，其特征在 于，所述步驟(6)中洗脫劑為甲醇、乙腈、酸化甲醇、酸化乙腈中的任意一種。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時(shí)檢測(cè)中藥注射劑中多種真菌毒素的方法，其特征在 于，所述步驟(7)中檢測(cè)方法為同位素內(nèi)標(biāo)稀釋法。
【文檔編號(hào)】G01N30/06GK105891373SQ201610407940
【公開(kāi)日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年6月12日
【發(fā)明人】陳勇, 李勁, 吳永江, 劉雪松, 欒連軍, 王龍虎
【申請(qǐng)人】浙江大學(xué)