一種基于高效液相色譜儀檢測胸腺素β4含量的測定方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物化學技術領域。本發(fā)明提供了一種胸腺素β4含量的高效液相色譜分析方法。該方法使用高效液相色譜儀，采用梯度洗脫的方法進行含量的測定。胸腺素β4常規(guī)蛋白含量測定方法存在操作復雜，易受多種因素影響等缺點。本發(fā)明操作簡單，出峰峰型好，主峰與雜質(zhì)峰分離度好，為胸腺素β4含量的測定提供了簡易可靠的分析方法。
【專利說明】
一種基于高效液相色譜儀檢測胸腺素0 4含量的測定方法 (一）
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學領域，具體涉及一種基于高效液相色譜儀檢測胸腺素e 4含 量的測定方法。 (二）
【背景技術】
[0002] 胸腺素0 4 (以下簡稱T 0 4)是20世紀80年代從胸腺中分離得到，后來發(fā)現(xiàn)在許 多組織中都廣泛存在的一種小肽類物質(zhì)，是一種重要的肌動蛋白結(jié)合蛋白。TP 4具有多種 生物學功能。研究表明，TP 4在心肌、角膜和皮膚的創(chuàng)傷愈合過程中作為一種化學誘導因 子，調(diào)節(jié)多種生長因子的表達以及趨化新生細胞的迀移。由于專利方面因素，目前將胸腺 素0 4作為藥物研發(fā)的公司主要有兩家，分別為美國RegeneRX生物制藥公司，處于臨床研 究階段，以及北京諾思蘭德生物技術股份有限公司，已申請臨床研究，處于待批臨床研究階 段。目前世界上還沒有T 0 4有關藥品被批準上市，因此也沒有明確的質(zhì)量標準。
[0003] 質(zhì)量標準是藥品檢驗的依據(jù)，是保證藥品質(zhì)量的一項重要措施。藥品質(zhì)量直接影 響藥品的安全性和有效性。蛋白含量測定是藥品質(zhì)量標準中的一項重要檢測指標。
[0004] 已報道的TP 4文獻中，多關注其活性和純度的研究，未見其含量測定方法的報 道。目前蛋白含量有多種測定方法，2010版《中國藥典》中收錄的蛋白含量測定方法有凱 氏定氮法、Lowry法和雙縮脲法。凱氏定氮法的優(yōu)點是不易受藥液中其他組分的影響，測 定結(jié)果準確，但比較耗時；雙縮脲法的優(yōu)點是精密度好、干擾物質(zhì)少，但準確性和靈敏度低； Lowry法的優(yōu)點是快速、靈敏度高，但受多肽特異性的影響，即不同多肽類藥物因酪氨酸和 色氨酸含量的不同而使顯色強度稍有不同（竇曉睿等.多肽類藥物含量（效價）測定方法 及其應用.藥效進展，2011，35(12):536-541)。
[0005] TP 4的常規(guī)含量測定不適合采用上述三種方法，原因如下：其一，TP 4屬于多肽 類藥物，基于多肽類藥物結(jié)構(gòu)的特殊性，不適合用Lowry法進行檢測；其二，多肽類藥物給 藥劑量小，需要采用靈敏度高的檢測方法，不適合用雙縮脲法進行檢測；其三，從藥物開發(fā) 角度考慮，凱氏定氮法過于耗時，不利于生產(chǎn)用。因此有必要針對本品建立一種快捷、簡便、 靈敏、重復性好，并能夠準確定量的蛋白含量測定方法。 (三）
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明提供了一種胸腺素0 4的高效液相色譜分析方法，該方法采用反相高效液 相色譜法和紫外檢測器測定胸腺素0 4的含量，能科學便捷的控制胸腺素0 4含量，為該藥 物生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制提供一個簡單有效的含量測定方法。
[0007] 胸腺素0 4的蛋白含量測定方法包括標準品的標定、標準曲線的制備、樣品測定 等，具體步驟如下：
[0008] (1)標準品的標定
[0009] 使用凱氏定氮法測定胸腺素0 4的蛋白含量；
[0010] ⑵儀器的設定
[0011] 色譜柱：C18,4. 6X250mm，5 ym ;
[0012] 流動相：流動相A為水和三氟乙酸，體積比例為999 : 1
[0013] 流動相B為乙腈和三氟乙酸，體積比例為999 : 1 ;
[0014] 梯度洗脫條件：0-5min，95% A液，5% B液；
[0015] 5-30min，A 液從 95 % 到 10 %，B 液從 5 % 至 90 % ;
[0016] 流速：lmL/min;
[0017] 檢測波長：210nm;
[0018] 進樣量：100yl。
[0019] (3)標準曲線的制備
[0020] 將標準品稀釋至不同濃度，測定蛋白含量，并以蛋白濃度為橫著坐標，相對應的峰 面積為縱坐標，繪制標準曲線。
[0021] (4)樣品測定
[0022] 將樣品稀釋至0. lmg/mL，直接進樣，測定峰面積，并帶入標準曲線，計算蛋白含量。
[0023] 本發(fā)明采用C18反相色譜柱，以液相色譜方法對胸腺素0 4含量進行了測定。本 方法的優(yōu)點是不受其他物質(zhì)的干擾、靈敏、簡便、快捷，可以準確測定胸腺素0 4的含量，為 胸腺素0 4含量的質(zhì)量控制提供了可靠的檢測方法。 (四）
【附圖說明】
[0024] 圖1標準品HPLC純度測定結(jié)果
[0025] 圖2標準品電泳純度測定結(jié)果
[0026] 圖3 200 y g/mL標準品HPLC測定結(jié)果
[0027] 圖4 175yg/mL標準品HPLC測定結(jié)果
[0028] 圖5 150yg/mL標準品HPLC測定結(jié)果
[0029] 圖6 125yg/mL標準品HPLC測定結(jié)果
[0030] 圖7 100yg/mL標準品HPLC測定結(jié)果
[0031] 圖8 75 y g/mL標準品HPLC測定結(jié)果
[0032] 圖9 50 y g/mL標準品HPLC測定結(jié)果
[0033] 圖10 25 y g/mL標準品HPLC測定結(jié)果
[0034] 圖11 12. 5 y g/mL標準品HPLC測定結(jié)果
[0035] 圖12標準曲線 (五）
【具體實施方式】
[0036] 下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這個實例僅是規(guī)范性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。
[0037] 1 ?實驗材料
[0038] 乙腈：購自Fisher，級別為色譜純
[0039] TFA :購自Sigma，級別為分析純
[0040] C18 色譜柱：購自 Agilent，型號為 Zorbax 300sb_C18
[0041] 高效液相色譜儀：購自Agilent，型號為1260。
[0042] 2.檢驗設備條件
[0043] 流動相：流動相A為水和三氟乙酸，體積比例為999 : 1
[0044] 流動相B為乙腈和三氟乙酸，體積比例為999 : 1
[0045] 色譜條件：流速為lmL/min，95% A、5% B液平衡，待基線平衡后，上樣100 y 1，使 用連續(xù)梯度洗脫，〇_5min (95 % A液，5 % B液），5-30min (A液從95 %到10 %，B液從5 %至 90% )，30-35min(10% A 液，90% B 液），檢測波長為 210nm
[0046] 3?試驗內(nèi)容
[0047] 3. 1標準品結(jié)構(gòu)確證
[0048] 參照《化學藥物原料藥制備和結(jié)構(gòu)確證研究的技術指導原則》要求，對本品進行了 結(jié)構(gòu)確證。具體檢測方法包括：質(zhì)譜分子量、N末端測序、C末端測序、肽圖、等電點檢測。
[0049] 表1本品結(jié)構(gòu)確證結(jié)果
[0051 ] 檢測結(jié)果見表1，Y-20100902批樣品N-末端15個氨基酸序列為GSDKPDM AEIEKFDK，與理論序列一致；C-末端5個氨基酸序列為QAGES，與理論序列一致；質(zhì)譜分子 量為4. 979kD，與理論大?。?. 979kD)基本一致；肽圖檢測結(jié)果與理論圖形一致；等電點在 4. 5-5. 5之間。因此確定本品為重組人胸腺素0 4。3. 2標準品質(zhì)量分析
[0052] 經(jīng)檢測，標準品純度采用HPLC和電泳兩種方法進行檢測。HPLC法純度測定結(jié)果為 99. 18%，電泳法純度測定結(jié)果為100%，見圖1和圖2
[0053] 3. 3標準品的標定
[0054] 經(jīng)上述結(jié)構(gòu)確證和質(zhì)量分析后，確定本品為胸腺素0 4,且純度大于99%。本品被 定為標準品，具有較好的科學和合理性。由于凱氏定氮法具有可以絕對定量并且準確的優(yōu) 點，因此采用凱氏定氮法來測定標準品的蛋白含量。
[0055] (1)溶液配制
[0056] 消化液：稱取硫酸銅（CuS04 ? 5H20) 10g、硫酸鉀100g、置乳缽內(nèi)，共同研細，混勻 [0057] 混合指示液：0. 2%溴甲酚綠乙醇溶液5份與0. 1%甲基紅乙醇溶液2份混合配 成。
[0058] 2 %硼酸吸收液：稱取硼酸20g，加水溶解并稀釋至1000ml，加混合指示液10ml，混 勻。
[0059] 硫酸滴定液（0. 05mol/L):量取硫酸3ml，緩緩注入適量水中，冷卻至室溫，加水稀 釋至1000ml，搖勾。取在270~300°C干燥至恒重的基準無水碳酸鈉約0. 15g，精密稱定，加 水50ml使溶解，加甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑10滴，用本液滴定至溶液由綠色轉(zhuǎn)變?yōu)樽?紅色時，煮沸2分鐘，冷卻至室溫，繼續(xù)滴定至溶液由綠色變?yōu)榘底仙?。每lml硫酸滴定液 (0. 05mol/L)相當于5. 30mg的無水碳酸鈉。根據(jù)本液的消耗量與無水碳酸鈉的取用量，算 出本液的濃度，即得。
[0060] 硫酸滴定液（0? 005mol/L):精密量取硫酸滴定液（0? 05mol/L) 100ml，置1000ml量 瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。
[0061] 供試品處理：放置室溫后直接用于蛋白含量測定。
[0062] (2)實驗流程：分別精密量取重組人胸腺素0 4 3ml和空白對照（注射水）3ml， 用于蛋白含量測定。取供試品置凱氏定氮瓶中，加消化劑約〇. 3g，硫酸lml消化至澄明，呈 藍綠色，繼續(xù)消化約60分鐘。量取2%硼酸吸收液10ml置100ml錐形瓶內(nèi)，將凱氏整流器 冷凝管末端浸入硼酸吸收液內(nèi)，將消化好的供試品移入凱氏蒸餾器內(nèi)，用水洗定氮瓶3~4 次，將洗液移入蒸餾器內(nèi)，再加入50 %氫氧化鈉溶液5ml，然后進行蒸餾，待接收液總體積 約35~50ml，將冷凝管末端移出液面，使蒸汽繼續(xù)沖洗約lmin，用水淋洗尖端后停止蒸餾。 接收液用硫酸滴定液（〇. 〇〇5mol/L)進行滴定，至溶液由藍綠色變?yōu)榛易仙?，并將滴定的結(jié) 果用空白試驗校正。每個供試品設兩個平行管，取平均值，用于蛋白含量計算。
[0063] 3. 4方法學建立
[0064] (1)線性關系考察
[0065] 精密吸取12. 5-200 y g/mL范圍的對照品溶液，HPLC自動進樣器自動進樣，并以峰 面積積分值（Y)為縱坐標，樣品濃度（X)為橫坐標進行線性回歸，得標準曲線。當各濃度點 準確度在85%~115%之間、相關系數(shù)（R 2)大于0. 995時，判定曲線具有良好的線性關系。
[0066] 經(jīng)分析，相關系數(shù)（R2)為0. 9973,大于0.99 ;當線性范圍在50-200 yg/mL之間時， 準確度為91. 92% -102. 85%，在判斷標準（85% -115% )范圍之間，所以確定標準曲線為 y = 59. 53X+1111. 6〇
[0067] (2)精密度試驗
[0068] 制備5(^/1^、125^/1^、200 ^/1^溶液，三平行，一日內(nèi)重復測定3次，連續(xù)三 日，每日測定1次。精密度RSD值小于2. 5%時，判定該方法精密度良好。
[0069] 表2重復精密度
[0071] 表3中間精密度
[0072]
[0073] (3)樣品的穩(wěn)定性考察
[0074] 將樣品放置于冷藏條件下24h，測定樣品的含量。當樣品的純度大于95%，偏差在 15%以內(nèi)時，判定樣品在該條件下是基本穩(wěn)定的。
[0075] 表4樣品冷減放置24h穩(wěn)走性結(jié)果
[0077] 3. 5 總結(jié)
[0078] 本品經(jīng)HPLC法蛋白含量測定方法學驗證研究，結(jié)果表明樣品濃度在50-200 y g/ mL范圍內(nèi)，樣品具有較好的線性關系。樣品冷藏放置24h后，樣品純度和含量均未見有明顯 變化，證明樣品在冷藏條件下放置24h后是穩(wěn)定的。符合藥品申報關于《生物制品質(zhì)量控制 分析方法驗證技術一般原則》中的要求，證明該方法穩(wěn)定、可靠，適用于原液及成品的蛋白 含量檢測。
【主權(quán)項】
1. 一種基于高效液相色譜儀檢測胸腺素 β 4含量的測定方法，其特征在于，包括以下 步驟： 1) 采用反相高效液相色譜法，其高效液相的色譜條件為： 色譜柱：C18,4. 6X250mm，5 μπι ; 流動相：流動相A為水和三氟乙酸，體積比例為999 : I 流動相B為乙腈和三氟乙酸，體積比例為999 : 1; 梯度洗脫條件：〇-5min，95 % A液，5 % B液 5-30min，A 液從 95 % 到 10 %，B 液從 5 % 至 90 % ; 流速：lmL/min ; 檢測波長：210nm ; 進樣量：1〇〇 μ 1。 2) 制作標準曲線。 3) 樣品含量的測定。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效液相色譜方法，其特征在于，待測樣品濃度應稀釋至標 曲范圍內(nèi)后再進行測定。
【文檔編號】G01N30/88GK105891399SQ201510169099
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2015年4月3日
【發(fā)明人】許松山, 馬素永, 聶李亞, 湯曉闖
【申請人】北京諾思蘭德生物技術股份有限公司