国产精品1024永久观看,大尺度欧美暖暖视频在线观看,亚洲宅男精品一区在线观看,欧美日韩一区二区三区视频,2021中文字幕在线观看

  • <option id="fbvk0"></option>
    1. <rt id="fbvk0"><tr id="fbvk0"></tr></rt>
      <center id="fbvk0"><optgroup id="fbvk0"></optgroup></center>
      <center id="fbvk0"></center>

      <li id="fbvk0"><abbr id="fbvk0"><dl id="fbvk0"></dl></abbr></li>

      一種定量檢測蛋白質(zhì)相互作用強(qiáng)度的方法

      文檔序號:10533052閱讀:2746來源:國知局
      一種定量檢測蛋白質(zhì)相互作用強(qiáng)度的方法
      【專利摘要】本發(fā)明公開了一種定量檢測蛋白質(zhì)相互作用強(qiáng)度的方法,引入相對報(bào)告因子表達(dá)量,結(jié)合流式細(xì)胞檢測技術(shù)與細(xì)菌雙雜交系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)相互作用強(qiáng)度的定量檢測。
      【專利說明】
      一種定量檢測蛋白質(zhì)相互作用強(qiáng)度的方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      [0001] 本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)檢測技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種定量檢測蛋白質(zhì)相互作用強(qiáng)度的 方法。
      【背景技術(shù)】
      [0002] 定性篩選與鑒定和定量分析是蛋白質(zhì)相互作用研究的兩個(gè)主要目的,蛋白質(zhì)相互 作用的體內(nèi)定量檢測有助于增進(jìn)我們對蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)和相互作用結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的理解。 對其他相關(guān)領(lǐng)域的研究,比如設(shè)計(jì)新的相互作用蛋白對,抗體親和力成熟研究等也有促進(jìn) 作用。但目前很少有方法可以在高通量篩選的同時(shí)做到定量分析。以等溫滴定為代表的定 量分析方法多用于已知相互作用蛋白的分析,一般需要對蛋白質(zhì)進(jìn)行純化,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)過程 相對復(fù)雜,無法滿足高通量檢測的要求,而且體外檢測無法反映蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情 況。以酵母雙雜交技術(shù)為代表的體內(nèi)檢測技術(shù)雖然具備高通量、操作簡單等優(yōu)點(diǎn),但是由于 這類方法并不直接檢測相互作用蛋白,而是通過轉(zhuǎn)錄激活等原理間接獲得相互作用信息。 以酵母雙雜交技術(shù)為例,常用的檢測轉(zhuǎn)錄激活的報(bào)告因子包括半乳糖苷酶、熒光素酶、熒 光蛋白以及生長曲線。然而,由于轉(zhuǎn)錄激活的機(jī)制復(fù)雜,目前還無法通過對報(bào)告因子的檢測 對蛋白_蛋白相互作用進(jìn)行定量分析。此外,在細(xì)胞中還有其他因素會影響蛋白相互作用以 及報(bào)告因子的讀出,比如蛋白質(zhì)、mRNA的穩(wěn)定性和翻譯活性以及質(zhì)??截悢?shù)等。因?yàn)闊o法建 立相互作用強(qiáng)度與報(bào)告因子讀出之間的數(shù)量關(guān)系,所以這類方法只能用于定性研究。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0003] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處,提供了一種定量檢測蛋白質(zhì)相互作 用強(qiáng)度的方法,引入相對報(bào)告因子表達(dá)量,結(jié)合流式細(xì)胞檢測技術(shù)與細(xì)菌雙雜交系統(tǒng),實(shí)現(xiàn) 了蛋白質(zhì)相互作用強(qiáng)度的定量檢測。
      [0004] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:
      [0005] -種定量檢測蛋白質(zhì)相互作用強(qiáng)度的方法,基于細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)與流式細(xì)胞檢測 技術(shù),包括:
      [0006] 1)選擇一對待確定相互作用強(qiáng)度的蛋白質(zhì)A與蛋白質(zhì)B;構(gòu)建帶有編碼蛋白質(zhì)A的 基因序列a與第一標(biāo)簽的第一載體,構(gòu)建帶有編碼蛋白質(zhì)B的基因序列b與第二標(biāo)簽的第二 載體;其中第一載體為低拷貝載體,第二載體為高拷貝載體;
      [0007] 2)將所述第一載體與第二載體共轉(zhuǎn)化至報(bào)告細(xì)菌,得到同時(shí)包含基因序列a和基 因序列b的重組細(xì)胞;
      [0008] 3)在適合表達(dá)蛋白質(zhì)A與蛋白質(zhì)B的條件下,培養(yǎng)步驟2)得到的重組細(xì)胞;重組細(xì) 胞表達(dá)蛋白質(zhì)A與蛋白質(zhì)B;蛋白質(zhì)A與蛋白質(zhì)B相互作用后可促進(jìn)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá), 產(chǎn)生報(bào)告因子;
      [0009] 4)在步驟3)得到的體系中對報(bào)告因子和第一標(biāo)簽進(jìn)行直接或間接的免疫熒光雙 染;通過流式細(xì)胞檢測技術(shù)分別檢測報(bào)告因子和第一標(biāo)簽相對應(yīng)的熒光強(qiáng)度,分別得到報(bào) 告因子和蛋白質(zhì)A的表達(dá)量;例如,在步驟3)得到的體系中加入報(bào)告因子對應(yīng)的熒光底物, 報(bào)告因子可水解該熒光底物,產(chǎn)生熒光物質(zhì);通過流式細(xì)胞儀檢測該熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度 可得到報(bào)告因子的表達(dá)量;第一標(biāo)簽的免疫熒光染色和流式檢測采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)即可 完成;報(bào)告因子表達(dá)量與蛋白質(zhì)A表達(dá)量的比值為相對報(bào)告因子表達(dá)量,該相對報(bào)告因子表 達(dá)量的值可定量蛋白質(zhì)A與蛋白質(zhì)B相互作用的強(qiáng)度:該相對報(bào)告因子表達(dá)量的值越大,表 明蛋白質(zhì)A與蛋白質(zhì)B的相互作用越強(qiáng);該相對報(bào)告因子表達(dá)量的值越小,表明蛋白質(zhì)A與蛋 白質(zhì)B的相互作用越弱。
      [0010]免疫熒光染色的過程中,對于非跨膜熒光底物,加入熒光底物染色前需對重組細(xì) 胞進(jìn)行破膜處理,改變細(xì)胞的滲透性;對于可跨膜熒光底物,可直接進(jìn)行熒光染色;所述熒 光底物的終濃度可為10nM~ImM,反應(yīng)時(shí)間可為1~240min,反應(yīng)溫度可為4~80°C。
      [0011] -實(shí)施例中:所述第一標(biāo)簽為His,F(xiàn)lag,TC,HA。
      [0012] -實(shí)施例中:所述第二標(biāo)簽為Flag,His,TC,HA。
      [0013] 一實(shí)施例中:所述第一載體為 pKT25,pKT25N,pKT25-Hi s。
      [0014] 一實(shí)施例中:所述第二載體為 pUT18C,pUT18,pUT18-Flag。
      [0015] -實(shí)施例中::所述報(bào)告細(xì)菌為E.coli BTH101,E.coli DHM1。
      [0016] -實(shí)施例中:所述報(bào)告基因?yàn)閘acZ,gfp,egfp;其對應(yīng)的報(bào)告因子分別為半乳糖 苷酶,GFP,EGFP。
      [0017] 本發(fā)明采用的儀器、設(shè)備、材料、試劑等,除有特別說明外,均可從市面上購買到。 本發(fā)明中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,通常按照常規(guī)條件,例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn) 室手冊中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件進(jìn)行。
      [0018] 本技術(shù)方案與【背景技術(shù)】相比,它具有如下優(yōu)點(diǎn):
      [0019] 本發(fā)明引入相對報(bào)告因子表達(dá)量,結(jié)合流式細(xì)胞檢測技術(shù)與細(xì)菌雙雜交系統(tǒng),實(shí) 現(xiàn)了蛋白質(zhì)相互作用強(qiáng)度的定量檢測,克服了現(xiàn)有技術(shù)中由細(xì)菌異質(zhì)性、培養(yǎng)時(shí)間、誘導(dǎo)濃 度等各種因素導(dǎo)致的無法通過檢測報(bào)告因子或相互作用蛋白來定量蛋白相互作用強(qiáng)度的 缺陷,實(shí)現(xiàn)了在單細(xì)菌水平對體內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用強(qiáng)度的靈敏、快速、高分辨定量檢測。
      【附圖說明】
      [0020] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
      [0021] 圖1為實(shí)施例2中e-gal酶活性檢測結(jié)果。
      [0022] 圖2為實(shí)施例2中TolB蛋白和Pal蛋白的Western blot檢測結(jié)果。
      [0023]圖3為實(shí)施例2中在不同培養(yǎng)時(shí)間下重組細(xì)胞表達(dá)P-gal和TolB蛋白的雙參數(shù)檢測 流式直方圖。
      [0024] 圖4為實(shí)施例2中MFIe-gai值和MFlHis-t〇ib值的線性曲線。
      [0025]圖5為實(shí)施例4中雙參數(shù)流式檢測所得的不同單菌落中P-gal表達(dá)與His-TolB表達(dá) 的相關(guān)曲線。
      [0026]圖6為實(shí)施例4中P-gal酶活與相對報(bào)告因子表達(dá)量RRPE的相關(guān)性。
      [0027]圖 7 為實(shí)施例 5 中質(zhì)粒 pKT25-His-tolBA22-25 和 pKT25-His-tolBA22-33 的構(gòu)建過程的 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。
      [0028]圖8為實(shí)施例5中三種不同相互作用強(qiáng)度蛋白對雙雜交細(xì)菌某一單菌落樣品的雙 熒光散點(diǎn)圖以及它們對應(yīng)熒光通道的信號分布直方圖。
      [0029] 圖9為實(shí)施例5中Pal與TolB、TolBA22-25和TolB A22-33各自構(gòu)成的雙雜交細(xì)菌的相對 報(bào)告因子表達(dá)量。
      【具體實(shí)施方式】
      [0030] 下面通過實(shí)施例具體說明本發(fā)明的內(nèi)容:
      [0031] 實(shí)施例1:利用本發(fā)明的定量檢測方法檢測蛋白對的相互作用強(qiáng)度
      [0032] 1)選擇一對待確定相互作用強(qiáng)度的蛋白質(zhì)A與蛋白質(zhì)B,本實(shí)施例之中以TolB蛋白 和Pal蛋白為例,它們是革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)膜蛋白質(zhì)系統(tǒng)中Tol-Pal系統(tǒng)的兩個(gè)功能蛋白, TolB蛋白和Pal蛋白相互作用組成了細(xì)菌外膜復(fù)合體。
      [0033]以大腸桿菌K12基因組為模板,設(shè)計(jì)tolB和pal基因的引物并于生工合成,通過PCR 分別獲取tolB和pal基因,將它們分別插入細(xì)菌雙雜交載體pKT25(帶有His標(biāo)簽,且為低拷 貝質(zhì)粒)、pUT18C(帶有Flag標(biāo)簽,且為高拷貝質(zhì)粒)的EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn),構(gòu)建得到 pKT25-His-tolB與pUT18C-Flag-pal。
      [0034] 2)將上述pKT25-His-tolB與pUT18C-Flag-pal共轉(zhuǎn)化至報(bào)告細(xì)菌E.coli BTH101 感受態(tài)中,培養(yǎng)得到同時(shí)包含tolB基因序列和pal基因序列的重組細(xì)胞E. col i BTH101pKT25-His-tolB/pUT18C-Flag-pal,完成細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)的構(gòu)建。采用常規(guī)的藍(lán)白 斑篩選及比色定量法確定上述細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)的成功建立,同時(shí)采用Western Blot、免疫 共沉淀、熒光顯微鏡等傳統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手段進(jìn)行驗(yàn)證。
      [0035] 3)用接種環(huán)刮取少量上述重組細(xì)胞E.coli BTH101pKT25-His-tolB/pUT18C-Flag-pal在抗性LB平板上劃線,并于30°C培養(yǎng)48h;用滅菌牙簽隨機(jī)挑取一個(gè)單菌落,接種 于含有l(wèi)〇〇yg/mL氨芐青霉素和50yg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中,IPTG誘導(dǎo)下,30°C,250rpm 搖床培養(yǎng),誘導(dǎo)重組細(xì)胞表達(dá)To 1B蛋白和Pal蛋白,To 1B蛋白和Pal蛋白相互作用后促進(jìn)報(bào) 告基因lacZ的轉(zhuǎn)錄與表達(dá),產(chǎn)生報(bào)告因子半乳糖苷酶⑴-gal)。
      [0036] 4)檢測上述體系中相對報(bào)告因子表達(dá)量(Relative reporter protein expression,RRPE)的值,可得到TolB蛋白和Pal蛋白的相對相互作用強(qiáng)度:該相對報(bào)告因子 表達(dá)量的值越大,表明TolB蛋白和Pal蛋白的相互作用越強(qiáng);該相對報(bào)告因子表達(dá)量的值越 小,表明To 1B蛋白和Pa 1蛋白的相互作用越弱。具體地:
      [0037] 將相對報(bào)告因子表達(dá)量(Relative reporter protein expression,RRPE)定義 為:
      [0038] 相對報(bào)告因子表達(dá)量RRPE =報(bào)告因子f3_ga 1表達(dá)量/To 1B蛋白表達(dá)量
      [0039] 本實(shí)施例之中,采用免疫熒光雙染的方法進(jìn)行,在步驟3)得到的體系中加入對應(yīng) 報(bào)告因子P-gal的熒光底物C12FDG; P-gal可水解C12FDG,產(chǎn)生綠色熒光;通過流式細(xì)胞儀檢 測綠色焚光強(qiáng)度(用綠色焚光的焚光中位值(Median fluorescence intensity,MFI)表征, 記為MFIe-gal)可得到報(bào)告因子P-gal的表達(dá)量;同時(shí),通過流式細(xì)胞儀檢測His標(biāo)簽(采用本 領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)進(jìn)行熒光染色)的紅色熒光強(qiáng)度(用紅色熒光中位值表征,記為MFI Hls-TcilB)可 得到TolB蛋白的表達(dá)量;因而,通過流式細(xì)胞儀檢測兩種熒光強(qiáng)度即可得到相對報(bào)告因子 表達(dá)量RRPE的值,即為:
      [0040] 相對報(bào)告因子表達(dá)量 RRPE=MFIe-gai/MFlHis-T〇iB
      [0041]這樣,通過流式細(xì)胞儀檢測即可得到相對報(bào)告因子表達(dá)量的值,從而直觀地判斷 TolB蛋白和Pal蛋白的相互作用強(qiáng)度。
      [0042]利用上述方法,可以定量檢測任意一對蛋白質(zhì)的相互作用強(qiáng)度。
      [0043]實(shí)施例2:本發(fā)明的定量檢測方法的驗(yàn)證之一:不同培養(yǎng)時(shí)間下的有效性驗(yàn)證 [0044] 1)用接種環(huán)刮取少量實(shí)施例1中步驟2)得到的重組細(xì)胞E.coli BTH101pKT25- His-tolB/pUT18C-Flag-pal在抗性LB平板上劃線,并于30°C培養(yǎng)48h。用滅菌牙簽隨機(jī)挑取 一個(gè)單菌落,接種于裝有15mL含100yg/mL氨芐青霉素和50yg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基的錐 形瓶中,30°C,250rpm搖床培養(yǎng)。從第12h開始,每隔2h從錐形瓶中取出適量菌液直至20h,將 剩余的菌液放回?fù)u床中繼續(xù)培養(yǎng)。取出的菌液先調(diào)節(jié)OD600至1.0,接著取其中的200yL進(jìn)行 固定處理,其余菌液置于4°C保存。固定后的細(xì)菌重懸于GTE緩沖液中,并被保存于4°C,待檢 測用。
      [0045] 2)參照實(shí)施例1中步驟4)的方法,通過流式細(xì)胞儀檢測本實(shí)施例步驟1)中不同培 養(yǎng)時(shí)間的菌液中MFIe- gai值和MFIHis-toib值,計(jì)算得到檢測相對報(bào)告因子表達(dá)量RRPE。理論 上,TolB蛋白和Pal蛋白的相互作用強(qiáng)度是一定的,因而可以反過來驗(yàn)證用相對報(bào)告因子表 達(dá)量RRPE來對蛋白相互作用強(qiáng)度進(jìn)行定量是否有效。
      [0046] 同時(shí),作為對比地,檢測報(bào)告因子P-gal的表達(dá)量、酶活,TolB蛋白和Pal蛋白的表 達(dá)量,驗(yàn)證其是否可用于對蛋白-蛋白相互作用進(jìn)行定量分析。
      [0047]對比實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖1至圖3所示。圖1中可看出,細(xì)菌總體的P-gal酶活性從第12h 的375. lU/mL上升到第16h的702. lU/mL,之后開始逐漸下降。同樣的,TolB蛋白和Pal蛋白的 Western blot實(shí)驗(yàn)也出現(xiàn)了類似現(xiàn)象(圖2)。另一方面,通過流式細(xì)胞儀在單細(xì)菌水平的分 析可知,隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,表達(dá)蛋白的細(xì)菌比例以及單個(gè)細(xì)菌的蛋白表達(dá)量均有明顯 變化。圖3是不同培養(yǎng)時(shí)間下重組細(xì)胞蛋白表達(dá)雙參數(shù)檢測的流式直方圖,其中FL1為綠色 熒光通道,代表P-gal的表達(dá)情況;FL2為紅色熒光通道,代表His-TolB蛋白的表達(dá)情況。可 見,表達(dá)P-gal蛋白和His-TolB蛋白的陽性菌比例隨培養(yǎng)時(shí)間的延長不斷升高(從7.5%到 75.5%),而這部分陽性菌細(xì)菌的熒光強(qiáng)度卻一直下降,其熒光中位值分別從14500(FL1)和 4155(FL2)下降到2508和495,說明單個(gè)細(xì)菌的蛋白含量隨培養(yǎng)時(shí)間的增加反而降低,這一 現(xiàn)象可能是由細(xì)菌分裂導(dǎo)致的蛋白質(zhì)稀釋引起;而陽性菌比例的增加和單個(gè)細(xì)菌蛋白表達(dá) 量的下降,也在單細(xì)菌水平解釋了圖1和圖2中0-gal、TolB蛋白和Pal蛋白的總體表達(dá)量/活 性含量先升高后下降的現(xiàn)象。
      [0048] 正是由于上述原因,導(dǎo)致報(bào)告因子0-gal的表達(dá)量、酶活,或者TolB蛋白和Pal蛋白 的表達(dá)量都無法用于對蛋白相互作用強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。
      [0049] 然而,利用本發(fā)明的方法,如圖4所示,通過流式細(xì)胞儀檢測本實(shí)施例步驟1)中不 同培養(yǎng)時(shí)間的菌液中MFIe-gai值和MFI His-toib值,計(jì)算得到檢測相對報(bào)告因子表達(dá)量RRPE。圖 4中可以看出,MFIe- gai值和MFIHis-toib值具有非常好的線性關(guān)系(R2 = 0.9995),表明隨著培養(yǎng) 時(shí)間的延長,MFIe-gai值和MFIHi s-toib值的比值RRPE仍然保持恒定,不受培養(yǎng)時(shí)間的影響。這 也反過來驗(yàn)證了本發(fā)明的采用相對報(bào)告因子表達(dá)量RRPE來對蛋白相互作用強(qiáng)度進(jìn)行定量 的方法,可以排除培養(yǎng)時(shí)間的影響,是有效的。
      [0050] 實(shí)施例3:本發(fā)明的定量檢測方法的驗(yàn)證之二:不同的誘導(dǎo)劑IPTG濃度下的有效性 驗(yàn)證
      [0051 ] 1)用接種環(huán)刮取少量實(shí)施例1中步驟2)得到的重組細(xì)胞E.coli BTH101pKT25- His-tolB/pUT18C-Flag-pal在抗性LB平板上劃線,并于30°C培養(yǎng)48h。用滅菌牙簽隨機(jī)挑取 一個(gè)單菌落在50yL的LB培養(yǎng)基中攪拌并盡量混勾。從中分別取10yL菌液加入到15mL各含0、 50、500yM IPTG,以及100yg/mL氨芐青霉素和50yg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中,30°C,250rpm 搖床培養(yǎng)。分別在第6、10、14、18h時(shí)取出適量菌液,調(diào)節(jié)0D 6QQ至1.0,于4 °C保存,待檢測。 [0052] 2)參照實(shí)施例1中步驟4)的方法,通過流式細(xì)胞儀檢測本實(shí)施例步驟1)中在不同 IPTG濃度誘導(dǎo)下培養(yǎng)的菌液中MFIe-gai值和MFIHis-toib值,計(jì)算得到檢測相對報(bào)告因子表達(dá) 量RRPE。理論上,TolB蛋白和Pal蛋白的相互作用強(qiáng)度不受IPTG濃度的影響,是一定的,因而 可以反過來驗(yàn)證用相對報(bào)告因子表達(dá)量RRPE來對蛋白相互作用強(qiáng)度進(jìn)行定量是否有效。 [0053] 結(jié)果顯示,在不同的IPTG濃度誘導(dǎo)情況下,MFIe- gai值和MFIHis-toib值的比值RRPE仍 然保持恒定,不受IPTG濃度的影響。這也反過來驗(yàn)證了本發(fā)明的采用相對報(bào)告因子表達(dá)量 RRPE來對蛋白相互作用強(qiáng)度進(jìn)行定量的方法,可以排除IPTG濃度的影響,是有效的。
      [0054]實(shí)施例4:本發(fā)明的定量檢測方法的驗(yàn)證之三:不同單菌落得到的體系中的有效性 驗(yàn)證
      [0055]本領(lǐng)域技術(shù)人員可知,細(xì)菌個(gè)體之間的異質(zhì)性有時(shí)會造成蛋白表達(dá)量的巨大差 異,而這些差異可能隨著細(xì)菌的增殖而不斷傳遞和放大,最終導(dǎo)致菌落之間的異質(zhì)性。由不 同單菌落擴(kuò)增得到的體系中,其P-gal酶活往往有巨大差異,因而對于不同單菌落擴(kuò)增得到 的體系,通過測定0-gal酶活來判斷TolB蛋白和Pal蛋白的相互作用強(qiáng)度是不準(zhǔn)確的。本實(shí) 施例之中,驗(yàn)證了相對報(bào)告因子表達(dá)量RRPE是否適用于不同單菌落培養(yǎng)得到的體系中蛋白 相互作用強(qiáng)度的檢測。
      [0056] 1)用接種環(huán)刮取少量實(shí)施例1中步驟2)得到的重組細(xì)胞E.coli BTH101pKT25- His-tolB/pUT18C-Flag-pal在抗性LB平板上劃線,并于30°C培養(yǎng)48h。用滅菌牙簽隨機(jī)挑取 若干個(gè)單菌落,分別接種于2mL含100yg/mL氨芐青霉素和50yg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中, 30°C,250rpm搖床培養(yǎng)16h。將菌液的0D600值調(diào)節(jié)至1.0待用。
      [0057] 2)參照實(shí)施例1中步驟4)的方法,通過流式細(xì)胞儀檢測本實(shí)施例步驟1)中由不同 單菌落培養(yǎng)得到的體系中MFIe-gai值和MFIHis-toib值,計(jì)算得到檢測相對報(bào)告因子表達(dá)量 RRPE。理論上,即使在不同單菌落中,TolB蛋白和Pal蛋白的相互作用強(qiáng)度也都是一定的,因 而可以反過來驗(yàn)證用相對報(bào)告因子表達(dá)量RRPE來對蛋白相互作用強(qiáng)度進(jìn)行定量是否有效。 [0058]結(jié)果:圖5顯示了雙參數(shù)流式檢測所得的不同單菌落中P-gal表達(dá)與His-TolB表達(dá) 的相關(guān)曲線,可見MFIe- gai值和MFIHis-toib值之間依然存在良好的線性關(guān)系(R2 = 0.9789),即 相對報(bào)告因子表達(dá)量RRPE仍然保持恒定,與理論上"TolB蛋白和Pal蛋白在不同單菌落中的 相互作用強(qiáng)度一定"相符合,表明RRPE不受不同單菌落的影響。因而也反過來驗(yàn)證了本發(fā)明 的采用相對報(bào)告因子表達(dá)量RRPE來對蛋白相互作用強(qiáng)度進(jìn)行定量的方法,可以排除不同單 菌落這個(gè)因素的影響,是有效的。
      [0059]圖6顯示了P-gal酶活與相對報(bào)告因子表達(dá)量RRPE的相關(guān)性。P-gal酶活和RRPE的 平均值分別為255.11 ±112.03和2.04±0.16,各自的變異系數(shù)為44%和8%。結(jié)合圖5中的 線性擬合曲線判斷,表明二者具有良好的相關(guān)性。
      [0060]此外,除了實(shí)施例2-4中提到的培養(yǎng)時(shí)間、誘導(dǎo)劑濃度和不同單菌落對報(bào)告因子表 達(dá)和活性的影響之外,還有一些因素導(dǎo)致無法單獨(dú)用報(bào)告因子的量來定量蛋白間的相互作 用強(qiáng)度。通過實(shí)驗(yàn)雖然可以排除細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)中質(zhì)粒丟失的情況。然而基于單細(xì)菌水平 的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)中細(xì)菌個(gè)體存在明顯的異質(zhì)性。
      [0061]大腸桿菌中存在全或無的現(xiàn)象,即在乳糖操縱子的作用下,隨著培養(yǎng)基中乳糖類 似物(TMG)濃度的增加,不是所有大腸桿菌個(gè)體都線性地增加半乳糖苷酶表達(dá),而是有些 個(gè)體完全高活性地表達(dá)lacZ基因,而另一部分個(gè)體則完全不表達(dá)。細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)中,報(bào)告 基因和相互作用蛋白的表達(dá)受乳糖操縱子調(diào)控,因而蛋白的表達(dá)同樣存在雙穩(wěn)態(tài)現(xiàn)象。并 且,相互作用蛋白的表達(dá)、cAMP的生成、報(bào)告基因的表達(dá)形成更為復(fù)雜的三級正反饋調(diào)節(jié)系 統(tǒng)。此外,兩種質(zhì)粒在轉(zhuǎn)化以及細(xì)菌分裂時(shí)分配的隨機(jī)性,會導(dǎo)致細(xì)菌個(gè)體間質(zhì)??截悢?shù)的 不同,造成蛋白表達(dá)量的差異,最終影響到菌落中蛋白表達(dá)的比例。
      [0062]因而,單純通過檢測報(bào)告因子或相互作用蛋白的量,無法實(shí)現(xiàn)對蛋白相互作用強(qiáng) 度的準(zhǔn)確定量。但通過本發(fā)明的方法,引入相對報(bào)告因子表達(dá)量,結(jié)合流式細(xì)胞檢測技術(shù)與 細(xì)菌雙雜交系統(tǒng),能夠排除各項(xiàng)細(xì)菌異質(zhì)性、培養(yǎng)時(shí)間、誘導(dǎo)濃度等因素的影響,實(shí)現(xiàn)蛋白 質(zhì)相互作用強(qiáng)度的定量檢測。
      [0063]實(shí)施例5:本發(fā)明的定量檢測方法的驗(yàn)證之四:對具有不同相互作用強(qiáng)度的蛋白對 的有效性驗(yàn)證
      [0064]本實(shí)施例之中,驗(yàn)證了本發(fā)明的定量檢測方法是否適用于不同相互作用強(qiáng)度的蛋 白對的檢測。
      [0065] TolB-Pal蛋白對中,TolB由N端的a/f3型結(jié)構(gòu)域以及C端與Pal相互作用的f3-propeller型結(jié)構(gòu)域兩部分組成。TolB是一個(gè)周質(zhì)蛋白,含有一段21個(gè)氨基酸的信號肽,并 能夠在蛋白進(jìn)入周質(zhì)空間時(shí)裂解。有文獻(xiàn)指出,To 1B蛋白N端不同長度的敲除會對與Pal的 相互作用產(chǎn)生影響,使二者的親和力下降(Bonsor D A,Hecht 0,Vankemmelbeke M,et al.Allosteric beta-propeller signalling in TolB and its manipulation by translocating colicins[J] .Embo Journal,2009,28(18): 2846-2857 ?)。因此,本實(shí)施例 之中,對TolB蛋白N端進(jìn)行不同長度的敲除(分別為22-25和22-33號氨基酸殘基缺失),利用 其與Pal親和力的變化,得到具有不同相互作用強(qiáng)度的蛋白對,采用本發(fā)明的方法檢測,可 以反過來驗(yàn)證本發(fā)明的定量檢測方法是否適用于各種蛋白對。
      [0066] 1)質(zhì)粒 pKT25-His-tolBA22-25 和 pKT25-His-tolBA22-33 的構(gòu)建:
      [0067] 以質(zhì)粒pEB362為模板,利用SEQ ID No.5至SEQ ID No.7所示的引物tolBA22-25-F、 tolBA22_ 33-F和tolB-R,通過PCR反應(yīng)分別獲得兩端帶有限制性酶切位點(diǎn)EcoR I和Xho I的 tolBA22-25和tolBA22-33的基因,設(shè)置PCR反應(yīng)體系如下:
      [0069]以上體系混勻后平均分成兩管,按如下程序進(jìn)行PCR反應(yīng):
      [0071] PCR反應(yīng)結(jié)束后,首先對產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證,之后利用DNA片段純化試 劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。
      [0072] 對質(zhì)粒pKT25-His_tolB和以上PCR產(chǎn)物分別按如下反應(yīng)體系進(jìn)行雙酶切:
      [0074] 以上體系混勻后分成4管,于37 °C反應(yīng)3h。質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物采用切膠回收;PCR產(chǎn)物 酶切后用DNA片段純化試劑盒回收。所有純化回收后的產(chǎn)物均用瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證,并用 NAN0-DR0P 測定 DNA 濃度。
      [0075] 利用T4連接酶將以上雙酶切后的質(zhì)粒載體與PCR產(chǎn)物連接,設(shè)置體系如下:
      [0077]連接體系于16°C反應(yīng)過夜,之后轉(zhuǎn)化至E.coli ER2738感受態(tài)細(xì)菌中。在含有卡那 霉素的平板上挑取單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證,將陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后送測序公司測序。
      [0078]如圖7所示,A為目的片段PCR后瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果,tolBA22_25和tolB A22_33基 因的理論長度分別為1218bp和1194bp,對照DNA marker可知兩者的條帶位置正確。B為質(zhì)粒 載體pKT25-His-tolB和PCR產(chǎn)物雙酶切純化后的電泳結(jié)果,其中質(zhì)粒載體的理論長度約為 3400bp,三者的條帶位置均接近理論值。C為菌落PCR驗(yàn)證的電泳結(jié)果,幾個(gè)單菌落均有PCR 產(chǎn)物,且條帶位置正確,說明質(zhì)粒載體中成功插入了目的基因片段。進(jìn)一步的測序結(jié)果證明 插入基因片段的序列完全正確。表明pKT25-His-tolB A22-25和pKT25-His-tolBA22-33質(zhì)粒成 功構(gòu)建。
      [0079] 2)參照實(shí)施例1中的步驟,將構(gòu)建成功的質(zhì)粒pKT25-His-tolBA22- 25和pKT25-His- tolBA22-33 ,以及pKT25-His-tolB,分別和質(zhì)粒pUT18C-Flag-pal共轉(zhuǎn)化至報(bào)告菌株E.coli BTH101中,接著各自挑取3個(gè)單菌落培養(yǎng);之后進(jìn)行免疫熒光雙染,并用流式細(xì)胞儀檢測。 [0080]圖8顯示了三種不同相互作用強(qiáng)度蛋白對雙雜交細(xì)菌某一單菌落樣品的雙熒光散 點(diǎn)圖以及它們對應(yīng)熒光通道的信號分布直方圖。三者的蛋白表達(dá)比例各異。但是通過計(jì)算 各自的相對報(bào)告因子表達(dá)量可以看出該參數(shù)與蛋白的相互作用強(qiáng)度有很好的相關(guān)性。如圖 9所示,Pal與T 〇lB、T〇lBA22-25和T〇lB A22-33各自構(gòu)成的雙雜交細(xì)菌的相對報(bào)告因子表達(dá)量分 別為2.04±0.21、0.88 ±0.07和0.91 ±0.06,而文獻(xiàn)報(bào)道的三者的解離常數(shù)分別為38 土 3碰、313$151^1和337±18碰,而解離常數(shù)越小,相互作用越強(qiáng)。有上述結(jié)果可知,當(dāng)?shù)鞍?對的相互作用越強(qiáng),相對報(bào)告因子表達(dá)量則越大。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,一方面驗(yàn)證了本發(fā)明的定 量方法在不同相互作用強(qiáng)度蛋白對中的有效性,也進(jìn)一步說明了相對報(bào)告因子表達(dá)量能用 于細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)中各種蛋白對相互作用強(qiáng)度的評估。
      [0081 ]附:
      [0082]本發(fā)明實(shí)施例中,涉及的引物如下所示(同時(shí)記載在說明書核苷酸和氨基酸序列 表):
      [0084]本發(fā)明實(shí)施例中,除有特別說明外,其余的PCR反應(yīng)體系如下所示:
      [0086]本發(fā)明實(shí)施例中,除有特別說明外,其余的PCR反應(yīng)進(jìn)程如下所示:
      [0088] 將質(zhì)粒、細(xì)菌基因組或者菌液(重懸于超純水中,95°C加熱處理lOmin)樣品與PCR 反應(yīng)的其他組份按4倍用量混合均勻后,分裝至熒光定量PCR專用的PCR管中,每管20yL,共3 管,作為平行樣進(jìn)行PCR反應(yīng)。
      [0089]以上所述,僅為本發(fā)明較佳實(shí)施例而已,故不能依此限定本發(fā)明實(shí)施的范圍,即依 本發(fā)明專利范圍及說明書內(nèi)容所作的等效變化與修飾,皆應(yīng)仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。
      【主權(quán)項(xiàng)】
      1. 一種定量檢測蛋白質(zhì)相互作用強(qiáng)度的方法,其特征在于:基于細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)與流 式細(xì)胞檢測技術(shù),包括: 1) 選擇一對待確定相互作用強(qiáng)度的蛋白質(zhì)A與蛋白質(zhì)B;構(gòu)建帶有編碼蛋白質(zhì)A的基因 序列a與第一標(biāo)簽的第一載體,構(gòu)建帶有編碼蛋白質(zhì)B的基因序列b與第二標(biāo)簽的第二載體; 其中第一載體為低拷貝載體,第二載體為高拷貝載體; 2) 將所述第一載體與第二載體共轉(zhuǎn)化至報(bào)告細(xì)菌,得到同時(shí)包含基因序列a和基因序 列b的重組細(xì)胞; 3) 在適合表達(dá)蛋白質(zhì)A與蛋白質(zhì)B的條件下,培養(yǎng)步驟2)得到的重組細(xì)胞;重組細(xì)胞表 達(dá)蛋白質(zhì)A與蛋白質(zhì)B;蛋白質(zhì)A與蛋白質(zhì)B相互作用后可促進(jìn)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá),產(chǎn)生 報(bào)告因子; 4) 在步驟3)得到的體系中對報(bào)告因子和第一標(biāo)簽進(jìn)行直接或間接的免疫熒光雙染;通 過流式細(xì)胞檢測技術(shù)分別檢測報(bào)告因子和第一標(biāo)簽相對應(yīng)的熒光強(qiáng)度,分別得到報(bào)告因子 和蛋白質(zhì)A的表達(dá)量;報(bào)告因子表達(dá)量與蛋白質(zhì)A表達(dá)量的比值為相對報(bào)告因子表達(dá)量,該 相對報(bào)告因子表達(dá)量的值可定量蛋白質(zhì)A與蛋白質(zhì)B相互作用的強(qiáng)度:該相對報(bào)告因子表達(dá) 量的值越大,表明蛋白質(zhì)A與蛋白質(zhì)B的相互作用越強(qiáng);該相對報(bào)告因子表達(dá)量的值越小,表 明蛋白質(zhì)A與蛋白質(zhì)B的相互作用越弱。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測蛋白質(zhì)相互作用強(qiáng)度的方法,其特征在于:所述第一 標(biāo)簽為 His,F(xiàn)lag,TC,HA。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測蛋白質(zhì)相互作用強(qiáng)度的方法,其特征在于:所述第二 標(biāo)簽為 Flag,His,TC,HA。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測蛋白質(zhì)相互作用強(qiáng)度的方法,其特征在于:所述第一 載體為 pKT25,pKT25N,pKT25-Hi s。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測蛋白質(zhì)相互作用強(qiáng)度的方法,其特征在于:所述第二 載體為 pUT18C,pUT18,pUT18-Flag。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測蛋白質(zhì)相互作用強(qiáng)度的方法,其特征在于:所述報(bào)告 細(xì)菌為E. coli BTHlOl,E. coli DHMl。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測蛋白質(zhì)相互作用強(qiáng)度的方法,其特征在于:所述報(bào)告 基因?yàn)镮acZ,gf ρ,egf ρ;其對應(yīng)的報(bào)告因子分別為β-半乳糖苷酶,GFP,EGFP。
      【文檔編號】G01N33/533GK105891462SQ201610474048
      【公開日】2016年8月24日
      【申請日】2016年6月24日
      【發(fā)明人】吳麗娜, 汪旭, 顏曉梅
      【申請人】廈門大學(xué)
      網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
      • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點(diǎn)贊!
      1