用于定量檢測抗繆勒氏管激素的試紙條及其制備方法和抗繆勒氏管激素濃度的測定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于定量檢測抗繆勒氏管激素的試紙條及其制備方法和抗繆勒氏管激素濃度的測定方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；所述的試紙條包括底板，所述的底板上附著有依次排列的樣品吸收墊、標(biāo)記抗體墊、包被膜和吸水墊。本發(fā)明的試紙條具有檢測結(jié)果準(zhǔn)確，方便，成本低廉的優(yōu)點。
【專利說明】
用于定量檢測抗繆勒氏管激素的試紙條及其制備方法和抗繆 勒氏管激素濃度的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于定量檢測人抗繆勒氏管激素(AMH) 的免疫層析試紙條及其制備方法和抗繆勒氏管激素(AMH)濃度的即時快速測定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著現(xiàn)代生活方式的改變，普遍的晚婚晚育現(xiàn)象、不良的現(xiàn)代生活方式(如過度節(jié) 食減肥、吸煙飲酒、熬夜）、巨大的工作精神壓力，造成不孕不育率迅速上升。因此，對女性生 育能力的盡早評估是十分必要的。抗繆勒氏管激素就是這樣的創(chuàng)新性卵巢儲備功能的評價 指標(biāo);抗繆勒氏管激素，又稱AMH，是早期卵泡的直接產(chǎn)物，由二硫化物橋連接兩個72KDa單 體組成的糖蛋白二聚體，由女性卵巢組織的粒層細(xì)胞分泌。AMH最初表達于初級卵泡的顆粒 細(xì)胞層，在直徑約〇. 1~〇. 2_的竇前卵泡及直徑約2_左右小竇狀卵泡中表達最強，而在> 4_竇狀卵泡中表達逐漸減弱至完全消失，對于卵泡發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)作用，血清AMH水 平不受垂體促性腺激素的影響，在整個月經(jīng)周期中數(shù)值變化不大。
[0003] 相對于目前常用的預(yù)測卵巢儲備及卵巢反應(yīng)性(年齡及竇卵泡數(shù)目（AFC)，卵泡刺 激素(FSH)和雌二醇(E2)等)傳統(tǒng)方法而言，血清AMH值可即時生成準(zhǔn)確、可靠的標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果 來評估卵巢儲備功能;可更早、靈敏反映卵巢儲備功能的改變。在監(jiān)測卵巢儲備力、診斷卵 巢相關(guān)疾病、預(yù)測IVF成功率及預(yù)防0HSS并發(fā)癥等方面具有其他指標(biāo)不可比擬的優(yōu)勢;AMH 是目前預(yù)測卵巢反應(yīng)、評估卵巢儲備功能的最理想生物標(biāo)志物。
[0004] 對于AMH的檢測，目前臨床的方法包括:酶聯(lián)免疫法(ELISA)、化學(xué)發(fā)光(CLIA)、電 化學(xué)發(fā)光法等方法，但這些方法都有各自的特點及不足。ELISA法由于定量準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用 于醫(yī)院檢驗科，但檢測時間長，不便捷;化學(xué)發(fā)光法和電化學(xué)發(fā)光法由于設(shè)備昂貴，并且不 適合單人份和較小批量檢測用，目前在臨床應(yīng)用還是相對較少。因此，臨床上迫切需求建立 一種快速、便捷、經(jīng)濟的AMH檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明實施例提供一種用于定量檢測AMH的免疫層析試紙條，其具有成 本低廉，測定便捷的優(yōu)點。
[0006] 本發(fā)明還提供了一種用于定量檢測AMH的免疫層析試紙條的制備方法。
[0007] 本發(fā)明還提供了一種用于定量檢測AMH的免疫層析試紙條的應(yīng)用。
[0008] -方面，本發(fā)明提供一種用于定量檢測抗繆勒氏管激素的試紙條，所述的試紙條 包括底板，所述的底板上附著有沿縱向依次排列的樣品吸收墊、標(biāo)記抗體墊、包被膜和吸水 墊。
[0009] 進一步的，所述的樣品吸收墊、標(biāo)記抗體墊、包被膜和吸水墊在所述的底板上從左 到右依次排列，所述的樣品吸收墊、標(biāo)記抗體墊、包被膜和吸水墊的長度比為13-17:10-12: 20-24:24-24。
[0010] 進一步的，所述的標(biāo)記抗體墊包括包被有標(biāo)記物的第一AMH單克隆抗體。
[0011] 進一步的，所述的標(biāo)記物標(biāo)記的第一AMH單克隆抗體是熒光標(biāo)記或膠體金標(biāo)記的 AMH抗體。
[0012]進一步的，所述的包被膜上包被有檢測帶和質(zhì)控帶，所述檢測帶固定有第二AMH單 克隆抗體，所述的質(zhì)控線上固定有兔抗鼠IgG抗體。
[0013] 進一步的，所述的包被膜為硝酸纖維素膜。
[0014] 另一方面，本發(fā)明提供一種用于定量檢測抗繆勒氏管激素的試紙條的制備方法， 包括如下步驟:在試紙條的底板上依次固定樣品吸收墊、標(biāo)記抗體墊、包被膜和吸水墊。
[0015] 進一步的，所述的包被膜通過如下方法制備而得：
[0016] 使用第一磷酸鹽緩沖液分別稀釋兔抗小鼠IgG和AMH抗體得到兔抗小鼠IgG溶液和 AMH抗體溶液，所述的第一磷酸鹽緩沖液濃度為0.01-0.03M，pH值為7.2-7.6，所述的兔抗小 鼠IgG溶液和AMH抗體溶液的濃度均為lmg/ml-1.5mg/ml;使用定量噴膜儀以0.8-1.2yl/cm 的量將二者以0.5cm-l. 0cm的間隔噴于硝酸纖維素膜上，35-38 °C烘干0.5-1.5h，加入干燥 劑封存?zhèn)溆谩?br>[0017] 進一步的，所述的標(biāo)記抗體墊由如下方法制備而得：
[0018] 制備AMH抗體溶液:用第一硼酸鹽緩沖液將AMH抗體透析得到AMH抗體溶液，所述的 第一硼酸鹽緩沖液濃度為0.03-0.07M，pH值為8.0-8.5，透析溫度為3-5°C，透析時間T彡 16h;將所述的AMH抗體溶液濃度調(diào)整為1.5-2mg/ml;
[0019] 熒光微球預(yù)處理:使用pH4.5-5.0的MES活化緩沖液洗滌熒光微球，加入碳二亞胺 和琥珀酰亞胺使二者終濃度均為18-22mmol/L，室溫反應(yīng)10-20min，充分洗滌熒光微球；
[0020] 用濃度為0.03-0.07M的pH值為8.0-8.5的第二硼酸鹽緩沖液將預(yù)處理過的所述的 熒光微球復(fù)溶后加入所述AMH抗體溶液中，使所述的AMH抗體與熒光微球的質(zhì)量比為1 -4: 50，室溫反應(yīng)1.5-2.5h，加入第二磷酸鹽緩沖液室溫封閉20-40min，所述的第二磷酸鹽緩沖 液中BSA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 %，所述的第二磷酸鹽緩沖溶液濃度為0.02M，pH值為7.2-7.6;用 第三磷酸鹽緩沖液保存液復(fù)溶至反應(yīng)前體積，所述的第三磷酸鹽緩沖液中按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計 包括0.3-0.7 %的BSA和0.2-0.3 %的Tween-20，所述的第三磷酸鹽緩沖液pH值為7.2-7.6， 濃度為0.01-0.0311;使用定量噴膜儀以3-5111/〇11噴涂于玻璃纖維墊上，避光35-38°(：烘干 lh，加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?br>[0021] 再一方面，本發(fā)明還提供一種抗繆勒氏管激素濃度的測定方法，包括如下步驟：
[0022] 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:將抗繆勒氏管激素標(biāo)準(zhǔn)品配制成梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液進行熒光強 度測定，以檢測線、質(zhì)控線的熒光強度比值為縱坐標(biāo)，抗繆勒氏管激素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐 標(biāo)，擬合成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0023] 樣品的檢測:將待測樣品滴到試紙條上，然后用熒光檢測裝置檢測，得出所述的樣 品中的AMH的濃度；
[0024] 所述的試紙條為權(quán)利要求1-6任一項所述的試紙條。
[0025] 使用時，在樣品墊上加入樣品液，在毛細(xì)作用下，樣品液向吸水墊一端泳動，當(dāng)待 測標(biāo)本中含有抗繆勒氏管激素(AMH)時，AMH與熒光微球上的抗體結(jié)合形成復(fù)合物，隨著層 析作用，復(fù)合物向前移動到達檢測線T處，復(fù)合物中的AMH和包被膜上的AMH抗體結(jié)合聚集在 T線處，未結(jié)合的熒光微球標(biāo)記物會繼續(xù)前行，到達質(zhì)控線C時，兔抗小鼠IgG抗體與熒光微 球上的鼠源性單抗結(jié)合，在C線處出現(xiàn)熒光微球的聚集。整個反應(yīng)在15分鐘內(nèi)完成，并進行 上機讀卡，T線和C線都會產(chǎn)生相應(yīng)的熒光信號，熒光檢測儀會根據(jù)定標(biāo)卡上的信息將實際 檢測值代入預(yù)設(shè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線中算出定量的結(jié)果。
[0026]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有如下優(yōu)點：
[0027]本發(fā)明將AMH單克隆抗體共價偶聯(lián)在熒光微球上，噴于玻璃纖維墊上后作為檢測 的流動相，將兔抗小鼠IgG和另一種AMH單克隆抗體包被于硝酸纖維素膜上作為捕獲固相， 按照常規(guī)免疫層析法的原理進行標(biāo)本的檢測，結(jié)合簡便易行的熒光檢測儀進行檢測，在實 現(xiàn)高靈敏度檢測的同時又能大大縮短檢測的時間。
[0028]通過對試紙條的改進，將熒光免疫層析技術(shù)引入AMH的檢測中，結(jié)合熒光檢測儀， 實現(xiàn)了 AMH的單人份定量檢測，為臨床使用提供了極大便利。
[0029]本發(fā)明操作簡便、適合大規(guī)模生產(chǎn)，檢測所需的便攜式設(shè)備也已經(jīng)上市，對于AMH 的定量診斷有著積極的意義。
[0030]對于AMH檢測，本發(fā)明申請實現(xiàn)了不同于以上方法的檢測系統(tǒng)上的創(chuàng)新:高靈敏度 檢測AMH的同時又能大大縮短檢測的時間，15分鐘內(nèi)實現(xiàn)單人份定量檢測，為臨床使用提供 了極大便利，更適合專業(yè)科室操作。
【附圖說明】
[0031]圖1為本發(fā)明AMH檢測試紙條的正面結(jié)構(gòu)示意圖；
[0032]圖2為本發(fā)明AMH檢測試紙條的側(cè)面結(jié)構(gòu)示意圖；
[0033]圖3為本發(fā)明實施例3中的檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0034]圖4為應(yīng)用本發(fā)明與羅氏電化學(xué)方法，對40例樣本測定的AMH濃度值的相關(guān)性示意 圖。
【具體實施方式】
[0035] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細(xì)描述，應(yīng)當(dāng)理解，以下實施例是為了 方便本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明方案的理解，但不作為對本發(fā)明的限定。
[0036] -種用于定量檢測AMH的免疫層析試紙條，所述的試紙條包括底板，所述的底板上 附著有依次排列的樣品吸收墊、標(biāo)記抗體墊、包被膜和吸水墊。
[0037] 上述方案中的試紙條已經(jīng)可以完成檢測，下面在此基礎(chǔ)上給出優(yōu)選方案：
[0038] 所述的樣品吸收墊、標(biāo)記抗體墊、包被膜和吸水墊在所述的底板上從左到右依次 排列，所述的樣品吸收墊、標(biāo)記抗體墊、包被膜和吸水墊的長度比為13-17:10-12:20-24: 20-24;所述的標(biāo)記抗體墊包括包被有標(biāo)記物的第一 AMH單克隆抗體;所述的標(biāo)記物標(biāo)記的 第一 AMH單克隆抗體是熒光標(biāo)記或膠體金標(biāo)記的AMH抗體;所述的包被膜上包被有檢測帶和 質(zhì)控帶，所述檢測帶固定有第二AMH單克隆抗體，所述的質(zhì)控線上固定有兔抗鼠IgG抗體;所 述的包被膜為硝酸纖維素膜。
[0039] 上述試紙條的制備方法包括如下步驟:在試紙條的底板上依次固定樣品吸收墊、 標(biāo)記抗體墊、包被膜和吸水墊；
[0040] 所述的包被膜通過如下方法制備而得：
[0041 ] 使用第一磷酸鹽緩沖液分別稀釋兔抗小鼠IgG和AMH抗體得到兔抗小鼠IgG溶液和 AMH抗體溶液，所述的第一磷酸鹽緩沖液濃度為0.01-0.03M，pH值為7.2-7.6，所述的兔抗小 鼠IgG溶液和AMH抗體溶液的濃度均為lmg/ml-1.5mg/ml;使用定量噴膜儀以0.8-1.2yl/cm 的量將二者以0.5cm-l. 0cm的間隔噴于硝酸纖維素膜上，35-38 °C烘干0.5-1.5h，加入干燥 劑封存?zhèn)溆谩?br>[0042] 所述的標(biāo)記抗體墊由如下方法制備而得：
[0043] 制備AMH抗體溶液:用第一硼酸鹽緩沖液將AMH抗體透析得到AMH抗體溶液，所述的 第一硼酸鹽緩沖液濃度為0.03-0.07M，pH值為8.0-8.5，透析溫度為3-5°C，透析時間T彡 16h;將所述的AMH抗體溶液濃度調(diào)整為1.5-2mg/ml;
[0044] 熒光微球預(yù)處理:使用pH4.5-5.0的MES活化緩沖液洗滌熒光微球，加入碳二亞胺 和琥珀酰亞胺使二者終濃度均為18-22mmol/L，室溫反應(yīng)10-20min，充分洗滌熒光微球； [0045]用濃度為0.03-0.07M的pH值為8.0-8.5的第二硼酸鹽緩沖液將預(yù)處理過的所述的 熒光微球復(fù)溶后加入所述AMH抗體溶液中，使所述的AMH抗體與熒光微球的質(zhì)量比為1 -4: 50，室溫反應(yīng)1.5-2.5h，加入第二磷酸鹽緩沖液室溫封閉20-40min，所述的第二磷酸鹽緩沖 液中BSA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 %，所述的第二磷酸鹽緩沖溶液濃度為0.02M，pH值為7.2-7.6;用 第三磷酸鹽緩沖液保存液復(fù)溶至反應(yīng)前體積，所述的第三磷酸鹽緩沖液中按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計 包括0.3-0.7 %的BSA和0.2-0.3 %的Tween-20，所述的第三磷酸鹽緩沖液pH值為7.2-7.6， 濃度為0.01-0.0311;使用定量噴膜儀以3-5111/〇11噴涂于玻璃纖維墊上，避光35-38°(：烘干 lh，加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?br>[0046]下面是具體實施例 [0047] 實施例1
[0048] AMH的熒光免疫層析試紙條的制備：
[0049] A、抗體的制備:選用商品化的AMH單克隆抗體，用0.0 5M pH8.5的硼酸鹽緩沖液4 °C 透析過夜（18h);選用商品化的AMH單克隆抗體，用0.02M pH7.4的PBS 4°C透析過夜（16h);
[0050] B、標(biāo)記A M H單克隆抗體的熒光微球墊的制備：選用直徑為10 0 n m的熒光微球 (Bangslab公司，激發(fā)波長350nm，檢測波長615nm)，用0.05M，pH4.5MES緩沖液調(diào)節(jié)微球濃度 為質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%，然后使用碳二亞胺(EDC)和琥珀酰亞胺(NHS)共價偶聯(lián)的方式將AMH單克隆 抗體標(biāo)記到熒光微球上。將制備好的熒光微球使用定量噴膜儀以3iil/cm的量噴涂于熒光微 球墊上；
[0051] C、硝酸纖維素膜的制備：
[0052] 使用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 %蔗糖的濃度為0.02M的pH7.4PBS分別將AMH單克隆抗體和兔 抗小鼠IgG抗體均稀釋到lmg/ml濃度，使用定量噴膜儀分別將二者以0.5cm的間隔噴涂于硝 酸纖維素膜上，35-38 °C烘干lh，加入干燥劑封存?zhèn)溆茫?br>[0053] D樣品墊的處理：
[0054] 將樣品墊放入樣品墊處理液(含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%BSA和0.1%Triton X-100的0.1M pH7.4磷酸鹽緩沖液或者含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 %BSA的0.1M Tris緩沖液）中浸泡處理1小時后， 35-38 °C 烘干 5h;
[0055] E試紙條的組裝：
[0056]下述操作必須在濕度小于38%，溫度20_25°C的房間內(nèi)進行。
[0057]在PVC底板上依次相互交錯2mm粘貼上硝酸纖維素膜、結(jié)合了 AMH抗體的熒光微球 墊、樣品墊、吸水墊，然后切割成0.6cm寬，即得到試紙條。
[0058]圖1為本發(fā)明中試紙條的正面結(jié)構(gòu)示意圖，圖2為本發(fā)明中試紙條的側(cè)面結(jié)構(gòu)示意 圖；如圖1和圖2所示，本實施例的AMH的熒光免疫層析試紙條包括底板6、底板上的包被有質(zhì) 控帶C和檢測帶T的硝酸纖維素膜4、覆蓋于硝酸纖維素膜一側(cè)的高強度吸水紙4、覆蓋于硝 酸纖維素膜的另一側(cè)的熒光標(biāo)記的AMH單克隆抗體墊、和樣品墊1;所述的檢測帶T包被有 AMH單克隆抗體;所述的質(zhì)控帶包被有兔抗鼠IgG抗體。
[0059] 實施例2
[0060]本實施例的試紙條制備方法包括以下步驟：
[00611 A、抗體的制備:選用商品化的AMH單克隆抗體，用0.05M pH8.5的硼酸鹽緩沖液4 °C 透析過夜;選用商品化的AMH單克隆抗體，用0.02M pH7.4的PBS 4°C透析過夜；
[0062] B、標(biāo)記AMH單克隆抗體的膠體金墊的制備：
[0063] 取膠體金50ml，過濾。
[0064]用水稀釋抗體3倍（約lmg/ml)，30min內(nèi)加完，邊加便混勻，在冰附近，混勻力度要 小，防止破壞抗體與膠體金的連接
[0065] 加入10%BSA，使溶液終濃度為1%，加入10%PEG使終濃度為0.2%，15min內(nèi)加完。
[0066] 1000(^/1^11，60111111離心，仔細(xì)吸出上清，沉淀物用含1%834的？8液（含0.02% NaN3)，將沉淀重懸為原體積的1 /10，4°C保存。
[0067]將制備好的膠體金標(biāo)記物使用定量噴膜儀以3iil/cm的量噴涂于標(biāo)記墊上。
[0068] C、硝酸纖維素膜的制備：
[0069]使用含有1 %蔗糖的0.02M pH7.4PBS分別將AMH單克隆抗體和兔抗小鼠IgG抗體均 稀釋到lmg/ml濃度，使用定量噴膜儀分別將二者以0.5cm的間隔噴涂于硝酸纖維素膜上， 35-38°C烘干lh，加入干燥劑封存?zhèn)溆茫?br>[0070] D樣品墊的處理：
[0071] 將樣品墊放入樣品墊處理液(含有1%BSA和0.1%Triton X-100的0.1M pH7.4磷 酸鹽緩沖液或者含有1 %BSA的0.1M Tris緩沖液）中浸泡處理1小時后，35-38°C烘干5h; [0072] E試紙條的組裝：
[0073]下述操作必須在濕度小于38%，溫度20_25°C的房間內(nèi)進行。
[0074]在PVC底板上依次相互交錯2mm粘貼上硝酸纖維素膜、結(jié)合了 AMH抗體的膠體金墊、 樣品墊、吸水墊，然后切割成0.6cm寬，即得到試紙條。
[0075]如圖1和圖2所示，本實施例的AMH的膠體金免疫層析試紙條包括底板6、底板上的 包被有質(zhì)控帶C和檢測帶T的硝酸纖維素膜4、覆蓋于硝酸纖維素膜一側(cè)的高強度吸水紙5、 覆蓋于硝酸纖維素膜的另一側(cè)的膠體金標(biāo)記的AMH單克隆抗體墊、和樣品墊1;
[0076]所述的檢測帶T包被有AMH單克隆抗體;所述的質(zhì)控帶包被有兔抗鼠IgG抗體。 [0077] 實施例3
[0078]熒光免疫層析定量檢測血液中抗繆勒氏管激素(AMH)濃度
[0079] 1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
[0080] 將AMH標(biāo)準(zhǔn)品配制成 100ng/ml、40ng/ml、20ng/ml、5ng/ml、lng/ml、0ng/ml，用同一 批次的試紙條，每個點測試6次。按照統(tǒng)計學(xué)方法，以檢測線(T帶）、質(zhì)控線(C帶)的熒光強度 比值(T帶檢測值/C帶檢測值)為縱坐標(biāo)，抗繆勒氏管激素(AMH)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，建 立方程并擬合成標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。
[0081 ] 2 ?樣品的檢測：
[0082] 1)從包裝盒中取出實施例1的檢測條，撕開鋁箱袋包裝后，平放檢測條，取100yl樣 本加入加樣孔中，室溫避光反應(yīng)15分鐘。
[0083] 2)開啟熒光檢測設(shè)備，并將檢測條及校準(zhǔn)卡插入熒光檢測設(shè)備的插卡口，運行儀 器，儀器通過相應(yīng)的分析軟件自動計算出待測樣本中的AMH的濃度。
[0084]目前已知AMH測定僅有適合醫(yī)院檢驗科用于批量檢測的酶聯(lián)免疫法(ELISA)、化學(xué) 發(fā)光(CLIA)、電化學(xué)發(fā)光法，還沒有適合單人份、快速檢測、即時出結(jié)果的檢測。
[0085] 對于AMH檢測，本專利實現(xiàn)了不同于以上方法的檢測系統(tǒng)上的創(chuàng)新:高靈敏度檢測 AMH的同時又能大大縮短檢測的時間，實現(xiàn)的單人份定量檢測，為臨床使用提供了極大便 利，更適合專業(yè)科室操作。
[0086] 3)與羅氏抗繆勒管激素檢測試劑盒(電化學(xué)發(fā)光法)檢測的相關(guān)性比較。
[0087]采用本發(fā)明的試條與熒光檢測設(shè)備組成的檢測體系，按照上述檢測方法檢測了 40 例人血清樣本；同時，用羅氏抗繆勒管激素檢測試劑盒（電化學(xué)發(fā)光法)檢測上述的40例樣 本。檢測結(jié)果見表1，相關(guān)性比較見圖4。兩種方法檢測結(jié)果的相關(guān)性r>0.975,具有顯著意 義。
[0088] 以羅氏抗繆勒管激素檢測試劑盒（電化學(xué)發(fā)光法)檢測上述的40例樣本的檢測結(jié) 果為橫坐標(biāo)，以本發(fā)明申請的方法測定的結(jié)果為縱坐標(biāo)，繪制相關(guān)性曲線;結(jié)果表明二者相 關(guān)性很好。
[0089] 表1.本法與羅氏抗繆勒管激素檢測試劑盒(電化學(xué)發(fā)光法)檢測比較

[0092]本發(fā)明方案未盡之處，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)需要選擇現(xiàn)有的技術(shù)來完成，如試 紙條的具體尺寸，檢測所用的具體時間和樣本取量等。
[0093]以上實施例僅為本發(fā)明的示例性實施例，不用于限制本發(fā)明，本發(fā)明的保護范圍 由權(quán)利要求書限定。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在本發(fā)明的實質(zhì)和保護范圍內(nèi)，對本發(fā)明做出各 種修改或等同替換，這種修改或等同替換也應(yīng)視為落在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種用于定量檢測抗繆勒氏管激素的試紙條，其特征在于，所述的試紙條包括底板， 所述的底板上附著有沿縱向依次排列的樣品吸收墊、標(biāo)記抗體墊、包被膜和吸水墊。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于定量檢測抗繆勒氏管激素的試紙條，其特征在于，所述的 樣品吸收墊、標(biāo)記抗體墊、包被膜和吸水墊在所述的底板上從左到右依次排列，所述的樣品 吸收墊、標(biāo)記抗體墊、包被膜和吸水墊的長度比為13-17:10-12:20-24:24-24。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的所述的用于定量檢測抗繆勒氏管激素的試紙條，其特征在于， 所述的標(biāo)記抗體墊包括包被有標(biāo)記物的第一 AMH單克隆抗體。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的所述的用于定量檢測抗繆勒氏管激素的試紙條，其特征在于， 所述的標(biāo)記物標(biāo)記的第一 AMH單克隆抗體是熒光標(biāo)記或膠體金標(biāo)記的AMH抗體。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的所述的用于定量檢測抗繆勒氏管激素的試紙條，其特征在于， 所述的包被膜上包被有檢測帶和質(zhì)控帶，所述檢測帶固定有第二AMH單克隆抗體，所述的質(zhì) 控線上固定有兔抗鼠 IgG抗體。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于定量檢測抗繆勒氏管激素的免疫層析試紙條，其特征在 于，所述的包被膜為硝酸纖維素膜。7. -種權(quán)利要求1-6任意一項所述的用于定量檢測抗繆勒氏管激素的試紙條的制備方 法，其特征在于，在試紙條的底板上依次固定樣品吸收墊、標(biāo)記抗體墊、包被膜和吸水墊。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于定量檢測抗繆勒氏管激素的試紙條的制備方法，其特征 在于，所述的包被膜通過如下方法制備而得： 使用第一磷酸鹽緩沖液分別稀釋兔抗小鼠 I gG和AMH抗體得到兔抗小鼠 I gG溶液和AMH 抗體溶液，所述的第一磷酸鹽緩沖液濃度為〇. 01-0.03M，pH值為7.2-7.6，所述的兔抗小鼠 IgG溶液和AMH抗體溶液的濃度均為lmg/ml-1.5mg/ml;使用定量噴膜儀以0.8-1.2yl/cm的 量將二者以〇 . 5cm-l. Ocm的間隔噴于硝酸纖維素膜上，35-38°C烘干0.5-1.5h，加入干燥劑 封存?zhèn)溆谩?. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的標(biāo)記抗體墊由如下方法制備而得： 制備AMH抗體溶液:用第一硼酸鹽緩沖液將AMH抗體透析得到AMH抗體溶液，所述的第一 硼酸鹽緩沖液濃度為〇. 03-0.07M，pH值為8.0-8.5，透析溫度為3-5°C，透析時間T彡16h;將 所述的AMH抗體溶液濃度調(diào)整為1.5-2mg/ml; 熒光微球預(yù)處理:使用PH4.5-5.0的MES活化緩沖液洗滌熒光微球，加入碳二亞胺和琥 珀酰亞胺使二者終濃度均為18-22mmol/L，室溫反應(yīng)10-20min，充分洗滌熒光微球； 用濃度為〇. 03-0.07M的pH值為8.0-8.5的第二硼酸鹽緩沖液將預(yù)處理過的所述的熒光 微球復(fù)溶后加入所述AMH抗體溶液中，使所述的AMH抗體與熒光微球的質(zhì)量比為1 -4:50，室 溫反應(yīng)1.5-2.5h，加入第二磷酸鹽緩沖液室溫封閉20-40min，所述的第二磷酸鹽緩沖液中 BSA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 %，所述的第二磷酸鹽緩沖溶液濃度為0.02M，pH值為7.2-7.6;用第三 磷酸鹽緩沖液保存液復(fù)溶至反應(yīng)前體積，所述的第三磷酸鹽緩沖液中按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計包括 0.3-0.7 %的BSA和0.2-0.3 %的Tween-20，所述的第三磷酸鹽緩沖液pH值為7.2-7.6，濃度 為0.01-0.03M;使用定量噴膜儀以3-5μ1/αη噴涂于玻璃纖維墊上，避光35-38°C烘干Ih，加 入干燥劑封存?zhèn)溆谩?0. -種抗繆勒氏管激素濃度的測定方法，其特征在于，包括如下步驟： 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:將抗繆勒氏管激素標(biāo)準(zhǔn)品配制成梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液進行熒光強度測 定，以檢測線、質(zhì)控線的熒光強度比值為縱坐標(biāo)，抗繆勒氏管激素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)， 擬合成標(biāo)準(zhǔn)曲線。 樣品的檢測:將待測樣品滴到試紙條上，然后用熒光檢測裝置檢測，得出所述的樣品中 的AMH的濃度； 所述的試紙條為權(quán)利要求1-6任一項所述的試紙條。
【文檔編號】G01N33/558GK105891490SQ201610207375
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月5日
【發(fā)明人】付國亮, 段學(xué)軍
【申請人】付國亮