試劑盒及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用，屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域。所述試劑盒包括有效量的抗犬瘟熱病毒單克隆抗體1、2和有效量的犬副流感病毒單克隆抗體3、4，以及對(duì)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的檢測(cè)試劑；單克隆抗體1、2以及單克隆抗體3、4分別能與犬瘟熱病毒、犬副流感病毒同時(shí)發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。本發(fā)明的試劑盒能有效檢測(cè)上述兩種病毒及其抗原，當(dāng)使用酶反應(yīng)檢測(cè)時(shí)，其敏感性與PCR相當(dāng)，當(dāng)使用膠體金進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，其敏感性優(yōu)于商業(yè)上獲得的同類產(chǎn)品。本發(fā)明還提供了該試劑盒在非診斷目的方面的應(yīng)用。CCTCC No: C201520120151125 CCTCC No: C201520220151125
【專利說(shuō)明】
試劑盒及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，涉及試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 犬痕熱病毒(Canine distemper virus，Q)V)屬于副粘病毒科麻疹病毒屬，是單鏈 負(fù)鏈不分節(jié)段的RNA病毒，可引起犬和其他肉食動(dòng)物如狐、狼、貂、綜熊等發(fā)生犬瘟熱(俗稱 狗瘟或麻疹）。犬瘟熱于1905年首次報(bào)道，是世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生的一種犬的急性、高接觸 性傳染病，易繼發(fā)細(xì)菌和其他病毒的混合感染或繼發(fā)感染，發(fā)病率高達(dá)80%，康復(fù)后易出現(xiàn) 麻痹、抽搐、癲癇發(fā)作等后遺癥。
[0003] 犬副流感病毒（Canine parainfluenza virus，CPIV)又稱副流感病毒5型 (Parainfluenza virus 5)，屬于副粘液病毒亞科副粘病毒屬，是單股負(fù)鏈RNA病毒。該病毒 呈世界性分布，可感染各種年齡、性別的犬科動(dòng)物，特別是幼齡犬，主要通過(guò)病犬的眼分泌 物、唾液、呼吸道分泌物等散播，經(jīng)呼吸道途徑感染，通過(guò)損壞犬的上呼吸道組織，引起干 咳、尖咳、鼻塞等癥狀，嚴(yán)重者會(huì)引起犬的支氣管炎和支氣管肺炎，并給其它病原體的感染 創(chuàng)造條件。
[0004] 犬腺病毒(canine adenovirus，CAV)是腺病毒科哺乳動(dòng)物腺病毒屬中致病性最強(qiáng) 的一種病毒，危害了我國(guó)的養(yǎng)犬業(yè)和皮毛動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)，每年都會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。犬腺 病毒有2個(gè)血清型，其中，犬腺病毒I型(CAV-1)又稱犬傳染性肝炎病毒(infectious canine hepatitis virus，ICHV)，既可引起犬傳染性肝炎（以肝小葉中心壞死，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和皮質(zhì) 細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)包涵體和出血時(shí)間長(zhǎng)為特征的急性敗血性傳染?。?，又可引起狐貍腦炎，臨床 癥狀以嘔吐、腹痛、腹瀉、體溫升高、突然死亡為特征，是重要的傳染病;犬腺病毒n型(CAV-2)引起犬傳染性喉氣管炎及肺炎癥狀，臨床特征表現(xiàn)為持續(xù)性高熱、咳嗽、漿液性至粘液性 鼻漏、扁桃體炎、喉氣管炎和肺炎等呼吸道癥狀，從臨床發(fā)病情況統(tǒng)計(jì)，該病多見于半年以 下的幼犬，可造成全窩或全群幼犬咳嗽。
[0005] 犬瘟熱病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒I型和/或犬腺病毒n型主要引發(fā)犬的呼吸 道感染，所引發(fā)的疾病常?；旌细腥竞屠^發(fā)感染。隨著人們所養(yǎng)的犬越來(lái)越多，這幾種病毒 所造成的經(jīng)濟(jì)損失越嚴(yán)重。因此，亟需研發(fā)能實(shí)現(xiàn)犬瘟熱病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒的 檢測(cè)方法。
[0006] 目前，檢測(cè)這幾種病毒的方法包括病毒分離鑒定和血清檢查，但操作過(guò)程繁瑣、耗 時(shí)過(guò)長(zhǎng);PCR/RT-PCR檢測(cè)，但需要專門的儀器和專業(yè)的操作人員，這些方法均不適合基層或 現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。現(xiàn)有技術(shù)也有各自單一的膠體金檢測(cè)試紙條，但價(jià)格昂貴或檢測(cè)靈敏度低。 因而，亟需研制一種能簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、同時(shí)檢測(cè)這幾種病毒的裝置及檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)試劑盒，該試劑盒可簡(jiǎn)單、快 速、靈敏度高并同時(shí)檢測(cè)出至少犬瘟熱病毒、犬副流感病毒這兩種病毒。
[0008] 本發(fā)明涉及一種試劑盒，所述試劑盒包括有效量的抗犬瘟熱病毒單克隆抗體1、2， 有效量的抗犬副流感病毒單克隆抗體3、4,還包括對(duì)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的檢測(cè)試劑，其 中，所述單克隆抗體1為抗犬瘟熱病毒單克隆抗體6E11，所述單克隆抗體2為抗犬瘟熱病毒 單克隆抗體1G5;所述抗犬副流感病毒單克隆抗體3、4分別選自4F3B6、4C9D6、5B4C9、4G7F4 中的兩種，且所述抗犬副流感病毒單克隆抗體3、4能與犬副流感病毒同時(shí)發(fā)生抗原抗體反 應(yīng)。
[0009] 本發(fā)明還涉及所述試劑盒檢測(cè)樣品中病毒的方法，所述檢測(cè)方法包括：（1)將檢測(cè) 樣品與所述單克隆抗體1、2,所述單克隆抗體3和4進(jìn)行接觸，（2)檢測(cè)所述單克隆抗體1、2， 所述單克隆抗體3和4與樣品中病毒的反應(yīng);其中，所述檢測(cè)方法步驟(1)中的所述單克隆抗 體1、所述單克隆抗體3固定在固相上，所述固相優(yōu)選為微滴定板、磁顆粒、乳膠顆粒、硝酸纖 維素膜中的任一種;其中，所述方法步驟(2)中所述反應(yīng)可通過(guò)酶顯色、膠體金、熒光、化學(xué) 發(fā)光中的任一種方法進(jìn)行測(cè)定。
[0010] 本發(fā)明還涉及所述試劑盒在用于非診斷目的的犬瘟熱病毒、犬副流感病毒檢測(cè)中 的應(yīng)用，其應(yīng)用過(guò)程簡(jiǎn)單、快速并且靈敏度高。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1為單克隆抗體6E11、1G5的聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定圖，其中泳道M為蛋白 Marker;泳道1為單克隆抗體1G5,包括上端的重鏈和下端的輕鏈;泳道2為單克隆抗體6E11， 包括上端的重鏈和下端的輕鏈。
[0012] 圖2為酶免疫層析檢測(cè)試紙條的側(cè)向示意圖，圖2(1)為固定了兩種單克隆抗體酶 免疫層析檢測(cè)試紙條側(cè)向示意圖，圖2(2)為固定了三種單克隆抗體酶免疫層析檢測(cè)試紙條 側(cè)向示意圖，圖2(3)為固定了四種單克隆抗體酶免疫層析檢測(cè)試紙條側(cè)向示意圖，圖中：硝 酸纖維素膜1、酶標(biāo)墊2、底物墊3、吸水墊4、展開液墊5、檢測(cè)線6、質(zhì)控線7、底物緩沖液槽8、 底物緩沖液9、支撐物10、檢測(cè)樣品11。
【具體實(shí)施方式】
[0013]以下，對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行說(shuō)明。
[0014] 本發(fā)明涉及一種試劑盒，所述試劑盒包括有效量的抗犬瘟熱病毒單克隆抗體1、2 和有效量的抗犬副流感病毒單克隆抗體3、4，以及對(duì)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的檢測(cè)試劑;其 中，所述單克隆抗體1為抗犬瘟熱病毒單克隆抗體6E11，所述單克隆抗體2為抗犬瘟熱病毒 單克隆抗體1G5;以及所述抗犬副流感病毒單克隆抗體3、4分別選自4F3B6、4C9D6、5B4C9、 4G7F4中的兩種，且所述抗犬副流感病毒單克隆抗體3、4能與犬副流感病毒同時(shí)發(fā)生抗原抗 體反應(yīng)。
[0015] 術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"是指獲自基本上同源的抗體群的抗體，即組成該群體的抗體個(gè) 體都相同，除了可能存在少量可能的自發(fā)突變。因此，修飾語(yǔ)"單克隆"是指該抗體的性質(zhì)不 是離散抗體的混合物。優(yōu)選地，所述單克隆抗體包括單價(jià)的或是單鏈抗體、雙鏈抗體、嵌合 抗體、犬源化抗體以及上述抗體的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗體片段和含有抗 原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽。抗體為涵蓋具有所需特異性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任意特異性結(jié)合因 子，因而，這個(gè)術(shù)語(yǔ)涵蓋了與之同源的抗體片段、衍生物、犬源化抗體以及抗體的功能等同 物和同源物，也包括含有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽，無(wú)論是天然的還是合成產(chǎn)生的。抗體 的實(shí)例是免疫球蛋白亞型（如186，18￡，1811，18〇和184)及其亞型亞類;也可以是包含抗原結(jié) 合結(jié)構(gòu)域的片段如?813、8〇?￥、？￥、(^13、？(1 ;和雙鏈抗體((113130(1168)。融合至另一多肽的、包 含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合體分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗體的克隆與表達(dá)在 EP. A. 0120694和EP. A. 0125023中描述?？贵w可以通過(guò)許多方式修飾，可用DNA重組技術(shù)來(lái)產(chǎn) 生保留原來(lái)抗體特異性的其它抗體或嵌合分子。這種技術(shù)可以包括將編碼抗體的免疫球蛋 白可變區(qū)或互補(bǔ)性決定區(qū)（CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定區(qū)或恒定區(qū)加框架區(qū)， 參見EP.A. 184187，GB2188638A或EP.A. 239400。還可以對(duì)雜交瘤細(xì)胞或產(chǎn)生抗體的其它細(xì) 胞進(jìn)行遺傳突變或其它改變，這可以改變或者不改變所產(chǎn)生抗體的結(jié)合特異性。用于本發(fā) 明的"單克隆抗體"也可用雜交瘤方法制得，因?yàn)榫幋a本發(fā)明鼠源化抗體的DNA序列可用本 領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)手段，如根據(jù)本發(fā)明公開的氨基酸序列人工合成或用PCR法擴(kuò)增 得到，因而也可用重組DNA方法，可用本領(lǐng)域熟知的各種方法將該序列連入合適的表達(dá)載體 中。最后，在適合本發(fā)明抗體表達(dá)的條件下，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化所得的宿主細(xì)胞，然后本領(lǐng)域技術(shù)人 員應(yīng)用熟知的常規(guī)分離純化手段純化得到本發(fā)明的單克隆抗體?？贵w包含通過(guò)二硫橋連接 在一起的多肽鏈幾何體，稱為輕鏈和重鏈的兩條多肽主鏈構(gòu)成抗體的所有主要結(jié)構(gòu)類別 (同型物）。重鏈和輕鏈都進(jìn)一步可分為稱作可變區(qū)和恒定區(qū)的一些亞區(qū)。重鏈包括單個(gè)的 可變區(qū)和三個(gè)不同的恒定區(qū)，輕鏈則包括單個(gè)可變區(qū)（不同于重鏈的可變區(qū)）和單個(gè)恒定區(qū) (不同于重鏈的恒定區(qū)）。重鏈和輕鏈的可變區(qū)負(fù)責(zé)抗體的結(jié)合特異性。
[0016]術(shù)語(yǔ)"重鏈可變區(qū)"是指一種多肽，其長(zhǎng)度為110至125個(gè)氨基酸，其氨基酸順序相 應(yīng)于本發(fā)明單克隆抗體從重鏈N末端氨基酸開始的重鏈氨基酸順序。同樣，術(shù)語(yǔ)"輕鏈可變 區(qū)"是指一種多肽，其長(zhǎng)度為95至115個(gè)氨基酸，其氨基酸順序相應(yīng)于本發(fā)明單克隆抗體從 輕鏈N末端氨基酸開始的輕鏈氨基酸順序。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯然知曉，在本發(fā)明所具體 公開的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列基礎(chǔ)上，可以通過(guò)常規(guī)基因工程 和蛋白質(zhì)工程方法進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸的添加、刪除、替換等修飾，獲得其活性片段或保 守性變異體，而仍能夠保持與相應(yīng)病毒特異性結(jié)合。本發(fā)明中的單克隆抗體還包括其活性 片段或保守性變異體。
[0017]術(shù)語(yǔ)"有效量"當(dāng)理解為"診斷有效量"時(shí)是指能夠利用本發(fā)明所述單克隆抗體有 效檢測(cè)樣品中是否存在犬瘟熱病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒I型或犬腺病毒n型的量。根 據(jù)已知的免疫化學(xué)檢測(cè)方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠知曉，所用單克隆抗體的量隨采用的具 體免疫檢測(cè)方法的不同而不同，根據(jù)公知文獻(xiàn)的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉如何選擇適當(dāng) 的本發(fā)明所述單克隆抗體用量，以用于診斷樣品中是否存在犬瘟熱病毒、犬副流感病毒、犬 腺病毒I型或犬腺病毒n型。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，適當(dāng)?shù)卦撛噭┖兄羞€應(yīng)當(dāng)包括適當(dāng)?shù)妮d 體，緩沖液/劑，和用于檢測(cè)所產(chǎn)生信號(hào)的試劑及使用說(shuō)明書。本發(fā)明所述試劑盒有效檢測(cè) 樣品中是否存在犬痕熱病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒I型或犬腺病毒n型的量時(shí)所米用的 檢測(cè)方法可以使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、酶免疫檢測(cè)、化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)、放射免疫 檢測(cè)、熒光免疫檢測(cè)、免疫色譜法及類似檢測(cè)方法。
[0018]本發(fā)明的抗犬瘟熱病毒單克隆抗體6E11是由小鼠骨髓雜交瘤細(xì)胞6E11株分泌產(chǎn) 生，小鼠骨髓雜交瘤細(xì)胞6E11株由犬瘟熱病毒CVCC AV299株抗原免疫小鼠后，取其脾細(xì)胞， 與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)篩選制得；小鼠骨髓雜交瘤細(xì)胞6E11株(Hybridoma-Balb/c mouse spleen cells and Sp2/0,strain 6E11)保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào) 為CCTCC No:C2015202,保藏地址為中國(guó)武漢?武漢大學(xué)，保藏時(shí)間為2015年11月25日。
[0019] 本發(fā)明的抗犬瘟熱病毒單克隆抗體1G5是由小鼠骨髓雜交瘤細(xì)胞1G5株分泌產(chǎn)生， 小鼠骨髓雜交瘤細(xì)胞1G5株由犬瘟熱病毒CVCC AV299株抗原免疫小鼠后，取其脾細(xì)胞，與 Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)篩選制得;小鼠骨髓雜交瘤細(xì)胞1G5株(Hybridoma-Balb/c mouse spleen cells and Sp2/0, strain 1G5)保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC No :C2015201，保藏地址為中國(guó)武漢?武漢大學(xué)，保藏時(shí)間為2015年11月25日。
[0020] 單克隆抗體4?386、扣906、58扣9、467?4公開于犬副流感病毒的分離及單克隆抗體 的制備.岑皓.揚(yáng)州大學(xué)碩士學(xué)位論文，2007。
[0021] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述單克隆抗體3為抗犬副流感病毒單克隆抗體 4F3B6、所述單克隆抗體4為抗犬副流感病毒單克隆抗體4C9D8。
[0022] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述試劑盒進(jìn)一步含有有效量的抗犬腺病毒I型單 克隆抗體5、6,和/或有效量的抗犬腺病毒II型單克隆抗體7、8,其中，所述抗犬腺病毒I型單 克隆抗體5、6分別選自0849、63、02、112、2￡10-112中的兩種，且所述抗犬腺病毒1型單克隆抗 體5、6能與犬腺病毒I型同時(shí)發(fā)生抗原抗體反應(yīng);所述抗犬腺病毒II型單克隆抗體7為Santa 公司的anti-CAV-2-Santa、單克隆抗體8為4H1-A7。
[0023] 單克隆抗體C8、E9公開于抗犬I型腺病毒單克隆抗體的制備及生物學(xué)特性鑒定.李 曉葉，劉穎，藍(lán)田豐等.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，27(11): 31-34;單克隆抗體G3、C2、H2公開于抗 犬I型腺病毒單克隆抗體的制備及ELISA檢測(cè)方法的建立.李曉葉.吉林大學(xué)碩士學(xué)位論文， 2011;單克隆抗體2E10-H2購(gòu)自Veterinary Medical Research&Development Inc.。
[0024] 單克隆抗體4H1-A7購(gòu)自Veterinary Medical Research&Development Inc.，單克 隆抗體 anti-CAV-2-Santa 購(gòu)自 Santa公司。
[0025] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述單克隆抗體5為抗犬腺病毒I型單克隆抗體G3， 所述單克隆抗體6為抗犬腺病毒I型單克隆抗體E9。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述單克 隆抗體1、3、5、7的含量各自分別為25-1000μg/ml，所述單克隆抗體2、4、6、8的含量各自分別 為 50-2000iig/ml。
[0026] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述試劑盒進(jìn)一步包括洗滌液、稀釋液、底物顯色 液、終止液、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照。
[0027] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述單克隆抗體1、單克隆抗體3固定于固相上，所述 固相包括微滴定板、磁顆粒、乳膠顆粒、硝酸纖維素膜。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述單 克隆抗體1、單克隆抗體3、單克隆抗體5和/或單克隆抗體7固定于固相上，所述固相包括微 滴定板、磁顆粒、乳膠顆粒、硝酸纖維素膜。
[0028] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述對(duì)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的檢測(cè)試劑包括酶顯 色檢測(cè)試劑、膠體金檢測(cè)試劑、熒光檢測(cè)試劑、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑或同位素檢測(cè)試劑。
[0029] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述試劑盒包括膠體金檢測(cè)試紙條，所述膠體金檢 測(cè)試紙條包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所 述底板上依次有濾紙、樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述金標(biāo)墊上含有膠體金 標(biāo)記的所述單克隆抗體2、膠體金標(biāo)記的所述單克隆抗體4,所述硝酸纖維素膜上有兩條檢 測(cè)線和一條質(zhì)控線，所述檢測(cè)線依次固定有單克隆抗體1、單克隆抗體3,所述質(zhì)控線上有羊 抗鼠二抗或羊抗鼠多抗。
[0030]作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述試劑盒還包括有效量的抗犬腺病毒I型單 克隆抗體5、6和/或有效量的抗犬腺病毒II型單克隆抗體7、8,所述膠體金檢測(cè)試紙條包括 底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所述底板上依次 有濾紙、樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述金標(biāo)墊上是含有膠體金標(biāo)記的所述 單克隆抗體2、膠體金標(biāo)記的所述單克隆抗體4、膠體金標(biāo)記的所述單克隆抗體6和/或膠體 金標(biāo)記的單克隆抗體8,所述硝酸纖維素膜上有三條或四條檢測(cè)線和一條質(zhì)控線，所述檢測(cè) 線依次固定有單克隆抗體1、單克隆抗體3、單克隆抗體5和/或單克隆抗體7,所述質(zhì)控線上 有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗。
[0031]作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述試劑盒包括緩沖液供應(yīng)單元和酶免疫層析檢測(cè) 試紙條;所述緩沖液供應(yīng)單元用于將緩沖液供給所述酶免疫層析檢測(cè)試紙條;所述酶免疫 層析檢測(cè)試紙條包括硝酸纖維素膜（1)，所述酶免疫層析檢測(cè)試紙條在縱向上依次包括底 物供應(yīng)區(qū)、樣品供應(yīng)區(qū)、檢測(cè)區(qū)；所述底物供應(yīng)區(qū)包括底物墊（3)，其上吸附有干燥的酶底 物，所述底物墊(3)與硝酸纖維素膜（1)接觸，當(dāng)所述緩沖液供應(yīng)單元向所述酶免疫層析檢 測(cè)試紙條供給緩沖液，所述酶底物溶于緩沖液中并在硝酸纖維素膜（1)上向距所述緩沖液 供應(yīng)單元的遠(yuǎn)端迀移;所述樣品供應(yīng)區(qū)包括酶標(biāo)墊(2)，其上吸附有酶標(biāo)記的所述單克隆抗 體2、所述單克隆抗體4,所述酶底物能與所述單克隆抗體2、所述單克隆抗體4上標(biāo)記的酶產(chǎn) 生顯色反應(yīng)，所述酶標(biāo)墊(2)與硝酸纖維素膜(1)接觸，所述單克隆抗體2、所述單克隆抗體4 溶于緩沖液中并在硝酸纖維素膜（1)上向距所述緩沖液供應(yīng)單元的遠(yuǎn)端迀移；以及所述檢 測(cè)區(qū)依次固定化有所述單克隆抗體1、所述單克隆抗體3;其中，所述緩沖液供應(yīng)單元包括展 開液墊(5)、底物緩沖液槽(8)、底物緩沖液(9)和緩沖液按鈕，所述底物緩沖液(9)放置于底 物緩沖液槽(8)中，所述緩沖液按鈕位于底物緩沖液槽(8)的上方，按下所述按鈕可將所述 展開液墊(5)浸入緩沖液(9)中；所述檢測(cè)區(qū)包括檢測(cè)線(6)、質(zhì)控線(7)，其中，所述質(zhì)控線 (7)較檢測(cè)線(6)更遠(yuǎn)離所述樣品供應(yīng)區(qū)，在所述檢測(cè)線(6)分別固定化有所述單克隆抗體 1、所述單克隆抗體3,在所述質(zhì)控線（7)固定化有羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗，且吸附在酶標(biāo) 墊(2)上的所述酶標(biāo)記的單克隆抗體2、單克隆抗體4分別對(duì)于固定在檢測(cè)線(6)的所述單克 隆抗體1、所述單克隆抗體3而言是過(guò)量的；所述硝酸纖維素膜（1)全段粘附在所述支撐物 (10)上，支撐物（10)連接所述緩沖液供應(yīng)單元，底物供應(yīng)區(qū)，樣品供應(yīng)區(qū)，檢測(cè)區(qū)以及吸水 墊(4)，所述吸水墊(4)在距所述緩沖液供應(yīng)單元的最遠(yuǎn)端；以及檢測(cè)樣品（11)加入的位置 為所述酶標(biāo)墊(2)的位置。
[0032]作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述試劑盒還包括有效量的抗犬腺病毒I型單 克隆抗體5、6和/或有效量的抗犬腺病毒II型單克隆抗體7、8;所述試劑盒包括緩沖液供應(yīng) 單元和酶免疫層析檢測(cè)試紙條;所述緩沖液供應(yīng)單元用于將緩沖液供給所述酶免疫層析檢 測(cè)試紙條;所述酶免疫層析檢測(cè)試紙條包括硝酸纖維素膜(1 )，所述酶免疫層析檢測(cè)試紙條 在縱向上依次包括底物供應(yīng)區(qū)、樣品供應(yīng)區(qū)、檢測(cè)區(qū)；所述底物供應(yīng)區(qū)包括底物墊(3)，其上 吸附有干燥的酶底物，所述底物墊(3)與硝酸纖維素膜（1)接觸，當(dāng)所述緩沖液供應(yīng)單元向 所述酶免疫層析檢測(cè)試紙條供給緩沖液，所述酶底物溶于緩沖液中并在硝酸纖維素膜（1) 上向距所述緩沖液供應(yīng)單元的遠(yuǎn)端迀移;所述樣品供應(yīng)區(qū)包括酶標(biāo)墊(2)，其上吸附有酶標(biāo) 記的所述單克隆抗體2、所述單克隆抗體4、所述單克隆抗體6和/或所述單克隆抗體8,所述 酶底物能與所述單克隆抗體2、所述單克隆抗體4、所述單克隆抗體6和/或所述單克隆抗體8 上標(biāo)記的酶產(chǎn)生顯色反應(yīng)，所述酶標(biāo)墊(2)與硝酸纖維素膜（1)接觸，所述單克隆抗體2、所 述單克隆抗體4、所述單克隆抗體6和/或所述單克隆抗體8溶于緩沖液中并在硝酸纖維素膜 (1)上向距所述緩沖液供應(yīng)單元的遠(yuǎn)端迀移；以及所述檢測(cè)區(qū)依次固定化有所述單克隆抗 體1、所述單克隆抗體3、所述單克隆抗體5和/或所述單克隆抗體7;其中，所述緩沖液供應(yīng)單 元包括展開液墊(5)、底物緩沖液槽(8)、底物緩沖液(9)和緩沖液按鈕，所述底物緩沖液(9) 放置于底物緩沖液槽(8)中，所述緩沖液按鈕位于底物緩沖液槽(8)的上方，按下所述按鈕 可將所述展開液墊(5)浸入緩沖液(9)中；所述檢測(cè)區(qū)包括檢測(cè)線(6)、質(zhì)控線（7)，其中，所 述質(zhì)控線(7)較檢測(cè)線(6)更遠(yuǎn)離所述樣品供應(yīng)區(qū)，在所述檢測(cè)線(6)分別固定化有所述單 克隆抗體1、所述單克隆抗體3、所述單克隆抗體5和/或所述單克隆抗體7,在所述質(zhì)控線(7) 固定化有羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗，且吸附在酶標(biāo)墊(2)上的所述酶標(biāo)記的單克隆抗體2、 單克隆抗體4、所述單克隆抗體6和/或所述單克隆抗體8分別對(duì)于固定在檢測(cè)線(6)的所述 單克隆抗體1、所述單克隆抗體3、所述單克隆抗體5和/或所述單克隆抗體7而言是過(guò)量的； 所述硝酸纖維素膜（1)全段粘附在所述支撐物（10)上，支撐物（10)連接所述緩沖液供應(yīng)單 元，底物供應(yīng)區(qū)，樣品供應(yīng)區(qū)，檢測(cè)區(qū)以及吸水墊(4)，所述吸水墊(4)在距所述緩沖液供應(yīng) 單元的最遠(yuǎn)端；以及檢測(cè)樣品（11)加入的位置為所述酶標(biāo)墊(2)的位置。
[0033] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述試劑盒中的所述酶免疫層析檢測(cè)試紙條包括固 相的硝酸纖維素膜1、含有標(biāo)記試劑的酶標(biāo)墊2、底物墊3、吸水墊4、展開液墊5、檢測(cè)線6、質(zhì) 控線7、底物緩沖液槽8、底物緩沖液9、支撐物10,其中2屬于樣品供應(yīng)區(qū)，3屬于底物供應(yīng)區(qū)， 5、8屬于緩沖液供應(yīng)單元，6、7屬于檢測(cè)區(qū)。檢測(cè)樣品11加入的位置為酶標(biāo)墊2的位置。所述 檢測(cè)試紙條固定在塑料外殼中，其上從左到右依次固定展開液墊5、底物墊3、酶標(biāo)墊2、吸水 墊4。硝酸纖維素膜1粘附在支撐物10的全段;吸水墊4卡在硝酸纖維素膜1的頂端，且與硝酸 纖維素膜1有重疊;酶標(biāo)墊2位于硝酸纖維素膜1的中段，上面干燥有酶標(biāo)記的所述單克隆抗 體2、所述單克隆抗體4和/或所述單克隆抗體6;底物墊3卡在硝酸纖維素膜1的底端，其上有 干燥的酶底物。展開液墊5的上端覆蓋了底物墊3,且其下端位于底物緩沖液槽8的底端。底 物緩沖液槽8的上面覆蓋了一層鋁箱紙，以防止底物緩沖液9滲漏，其上有緩沖液按鈕，按下 緩沖液按鈕可刺破鋁箱紙，并將展開液墊5的下端浸入到底物緩沖液9中。檢測(cè)線6位于硝酸 纖維素膜1的中上端，其上固定化有所述單克隆抗體1。質(zhì)控線7位于硝酸纖維素膜1的中上 端、檢測(cè)線6的上游，其上固定化有羊抗鼠二抗。
[0034] 術(shù)語(yǔ)"檢測(cè)樣品"包括但不限于動(dòng)物或患者的眼鼻腔分泌物、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的完整 病毒或裂解病毒液等。
[0035] 本發(fā)明還涉及使用所述試劑盒檢測(cè)樣品中病毒的方法，所述方法包括：（1)將檢測(cè) 樣品與所述單克隆抗體1、2,所述單克隆抗體3和4,所述單克隆抗體5、6和/或所述單克隆抗 體7、8進(jìn)行接觸，（2)檢測(cè)所述單克隆抗體1、2,所述單克隆抗體3和4,所述單克隆抗體5、6 和/或所述單克隆抗體7、8與樣品中病毒的反應(yīng);其中，所述方法步驟(1)中的所述單克隆抗 體1、所述單克隆抗體3、所述單克隆抗體5和/或所述單克隆抗體7附著在固相上，所述固相 優(yōu)選為微滴定板、磁顆粒、乳膠顆粒、硝酸纖維素膜中的任一種;其中，所述方法步驟(2)中 所述反應(yīng)可通過(guò)酶顯色、膠體金、熒光、化學(xué)發(fā)光中的任一種方法進(jìn)行測(cè)定。
[0036] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述檢測(cè)方法進(jìn)一步包括:在所述步驟（1)前，將采 集的微生物拭子插入到樣品處理管中，使所述檢測(cè)樣品盡可能溶解在溶液中，將處理后的 檢測(cè)樣品滴加至檢測(cè)試紙條加樣孔中心。
[0037] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述檢測(cè)方法進(jìn)一步包括:在所述步驟(2)后，10或 30分鐘后判定結(jié)果:若質(zhì)控線顯色即試驗(yàn)成立，檢測(cè)線顯色即可判為陽(yáng)性，檢測(cè)線不顯色即 可判為陰性;若質(zhì)控線未顯色即試驗(yàn)不成立，無(wú)論檢測(cè)線是否顯色，均判定為無(wú)效結(jié)果，需 重測(cè)。
[0038] 本發(fā)明還涉及所述試劑盒在用于非診斷目的的犬瘟熱病毒、犬副流感病毒檢測(cè)中 的應(yīng)用。
[0039] 本發(fā)明還涉及所述試劑盒在用于非診斷目的的犬瘟熱病毒、犬副流感病毒、犬腺 病毒I型和/或犬腺病毒n型檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0040] 所述非診斷目的包括流行病學(xué)分析、對(duì)離體組織進(jìn)行定性和定量檢測(cè)、表位鑒定 研究以及定性和定量鑒別檢驗(yàn)含所述犬瘟熱病毒、犬副流感病毒的全病毒抗原的疫苗組合 物中的全病毒抗原，或定性和定量鑒別檢驗(yàn)含犬瘟熱病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒I型和/ 或犬腺病毒n型的全病毒抗原的疫苗組合物中的全病毒抗原。
[0041] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明提供了包括有效量的所述單克隆抗體1、2和 有效量的所述單克隆抗體3、4的試劑盒在用于非診斷目的的犬瘟熱病毒和犬副流感病毒檢 測(cè)中的應(yīng)用。
[0042] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明提供了包括有效量的所述單克隆抗體1、2,有 效量的所述單克隆抗體3、4和有效量的所述單克隆抗體5、6的試劑盒在用于非診斷目的的 犬瘟熱病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒I型檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0043] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明提供了包括有效量的所述單克隆抗體1、2,有 效量的所述單克隆抗體3、4和有效量的所述單克隆抗體7、8的試劑盒在用于非診斷目的的 犬瘟熱病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒n型檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0044] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明提供了包括有效量的所述單克隆抗體1、2,有 效量的所述單克隆抗體5、6和有效量的所述單克隆抗體7、8的試劑盒在用于非診斷目的的 犬痕熱病毒、犬腺病毒I型和/或犬腺病毒n型檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0045] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明提供了包括有效量的所述單克隆抗體1、2,有 效量的所述單克隆抗體3、4,有效量的所述單克隆抗體5、6,和有效量的所述單克隆抗體7、8 的試劑盒在用于非診斷目的的犬瘟熱病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒I型和犬腺病毒n型檢 測(cè)中的應(yīng)用。
[0046] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述更 為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員 應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行 修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0047]本實(shí)施例中所用的磷酸鹽緩沖液為pH值7.4的roS，其1L體積配方為:NaCl 8.0g、 KC1 0.2g、Na2HP〇4. 12H20 2.9g、KH2P〇4 0.24g，但該實(shí)施方式無(wú)論在任何情況下均不構(gòu)成 對(duì)本發(fā)明的限定。
[0048]本實(shí)施例中以膠體金檢測(cè)試紙條中的檢測(cè)線從左到右依次固定單克隆抗體1、3為 膠體金檢測(cè)試紙條1，固定單克隆抗體1、3、5為膠體金檢測(cè)試紙條2,單克隆抗體1、3、5、7時(shí) 作為膠體金檢測(cè)試紙條3;以酶免疫層析檢測(cè)試紙條中的檢測(cè)線從左到右依次固定單克隆 抗體1、3為酶免疫層析檢測(cè)試紙條1，固定單克隆抗體1、3、5為酶免疫層析檢測(cè)試紙條2，固 定單克隆抗體1、3、5、7為酶免疫層析檢測(cè)試紙條3為例進(jìn)行闡述，但該實(shí)施方式無(wú)論在任何 情況下均不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限定。
[0049] 本發(fā)明以下所述的實(shí)驗(yàn)方法，若無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法;所述的生物材料，若 無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0050] 實(shí)施例1抗犬瘟熱病毒單克隆抗體的制備、純化、鑒定及檢驗(yàn)
[0051 ] 1.1抗犬瘟熱病毒單克隆抗體的制備和純化
[0052]將犬痕熱病毒CVCC AV299株按照Harlow E等(Harlow E,Lane D.Antibodies:a laboratory manual.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1998,139-312) 文獻(xiàn)的操作方法制備小鼠骨髓雜交瘤細(xì)胞6E11株、小鼠骨髓雜交瘤細(xì)胞1G5株，并提交保 藏;使用這兩種小鼠骨髓雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)一步分別制得抗犬瘟熱病毒單克隆抗體6E11、抗 犬瘟熱病毒單克隆抗體1G5。并分別對(duì)單克隆抗體6E1U1G5按照陳丹等(陳丹，孫廣瑞，柳增 善.辛酸-硫酸銨聯(lián)合沉淀法在單克隆抗體純化中的應(yīng)用.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35(26): 8105，8108)的辛酸-硫酸銨聯(lián)合沉淀法純化。
[0053] 1.2抗犬瘟熱病毒單克隆抗體的鑒定
[0054] 1.2.1單克隆抗體類型和亞類的鑒定
[0055]運(yùn)用Pierce Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit并參照說(shuō)明書對(duì)抗體的亞 型進(jìn)行鑒定。鑒定結(jié)果見表1:
[0056]表1各單克隆抗體類型的鑒定
[0058] 注:+表示陽(yáng)性反應(yīng)，-表示陰性反應(yīng)。
[0059]由表1可知，單克隆抗體1G5、6E11重鏈亞型都為IgGl，輕鏈類型都為kappa。
[0060] 1.2.2單克隆抗體特異性的鑒定
[0061]按照蘇建青(蘇建青等，犬瘟熱病毒單克隆抗體的制備及特性鑒定，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 學(xué)報(bào)，2009，31 (1): 88~92)所提供的方法進(jìn)行單克隆抗體的特異性鑒定。
[0062]測(cè)定結(jié)果顯示：?jiǎn)慰寺】贵w1G5、6E11與其他病毒均不發(fā)生反應(yīng)，均是抗犬瘟熱病 毒的特異性單克隆抗體。
[0063] 1.3純化單克隆抗體的檢驗(yàn)
[0064] 1.3.1純化單克隆抗體的外觀
[0065] 室溫下，肉眼觀察可見純化抗體呈無(wú)色澄清狀態(tài)，未見絮狀物沉淀。
[0066] 1.3.2無(wú)菌試驗(yàn)
[0067] 采用無(wú)菌檢驗(yàn)法，取純化后的單克隆抗體原料接種10mL/管的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng) 基、改良馬丁培養(yǎng)基和硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基各2管(接種量為0.5mL/管）。接種后的硫乙醇酸鹽 培養(yǎng)基及營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基各一管置于30_35°C培養(yǎng)，另一管于2〇-25°C培養(yǎng)。改良馬丁 培養(yǎng)基置于20_25°C培養(yǎng)。同時(shí)以無(wú)菌生理鹽水同法操作做陰性對(duì)照。培養(yǎng)14天后均未觀察 到培養(yǎng)基中有微生物生長(zhǎng)，表明單克隆抗體1G5、6E11原料符合無(wú)菌要求。
[0068] 1.3.3單克隆抗體純度
[0069] 采用SDS-PAGE電泳鑒定，上樣量為10yg，檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明：?jiǎn)慰寺】?體1G5、6E11的純度均不低于80%。
[0070] 1.3.4單克隆抗體相對(duì)親和力的測(cè)定
[0071]對(duì)純化的單克隆抗體進(jìn)行其相對(duì)親和力的測(cè)定:將純化開始作倍比稀釋，分別加 入包被有⑶V抗原（1: 200倍V/V稀釋）的96孔酶標(biāo)板，同時(shí)設(shè)陰性血清和空白對(duì)照37 °C反應(yīng) 30分鐘，用TOST洗板3次，拍干;每孔加入羊抗鼠IgG-HRP(l: 1 X 104稀釋）100此/孔，反應(yīng)過(guò) 后洗滌同上，每孔加入1〇〇此/孔TMB(四甲基聯(lián)苯胺)底物溶液顯色，用2m 〇L/L H2S〇4(50yL/ 孔)終止反應(yīng)，讀取〇D45Qr?值。結(jié)果以與包被抗原出現(xiàn)50 %結(jié)合時(shí)的單克隆抗體的蛋白含量， 即為該株單克隆抗體的相對(duì)親和力。
[0072]以純化單克隆抗體的稀釋度與其相對(duì)應(yīng)的OD45〇M值作圖，曲線趨于平坦時(shí)的 0D45Q?作為100%，即抗原與單克隆抗體的結(jié)合已達(dá)到飽和狀態(tài)。取曲線上50%飽和度所對(duì) 應(yīng)的單克隆抗體濃度，即為該株單克隆抗體的相對(duì)親和力，親和力越大，所需單克隆抗體的 量越低。計(jì)算結(jié)果表明：?jiǎn)慰寺】贵w1G5、6E11的相對(duì)親和力均為1:5120。
[0073] 1.3.5單克隆抗體IPMA效價(jià)的測(cè)定
[0074]參照劉杉杉(劉杉杉等，豬細(xì)小病毒抗體IPMA檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用，中國(guó)獸醫(yī)科 學(xué)，2011，41 (04): 387-391)所述IPMA檢測(cè)方法，用此方法對(duì)兩株單克隆抗體進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。 測(cè)定結(jié)果表明：?jiǎn)慰寺】贵w1G5、6E11的IPMA效價(jià)均為1:12800。
[0075] 1.4單克隆抗體1G5、6E11可變區(qū)序列的測(cè)定
[0076] 根據(jù)鼠源單克隆抗體的序列特征，設(shè)計(jì)1G5重鏈可變區(qū)引物序列：
[0077] P1:ACTAGTCGACATGGGATGGAGCTRT
[0078] P2：CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGA [0079] 設(shè)計(jì)1G5輕鏈可變區(qū)引物序列：
[0080] P3：ACTAGTCGACATGAGTGTGCYCACTCA [0081 ] P4：CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGAT
[0082]根據(jù)鼠源單克隆抗體的序列特征，設(shè)計(jì)6E11重鏈可變區(qū)引物序列：
[0083] PI：ACTAGTCGACATGGGATGGAGCTRT
[0084] P2：CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGA [0085] 設(shè)計(jì)6E11輕鏈可變區(qū)引物序列：
[0086] P3:ACTAGTCGACATGAGTGTGCYCACTCA
[0087] P4：CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGAT
[0088]按照張愛華等(張愛華，閉蘭，王志友等.系列鼠抗⑶分子單克隆抗體輕、重鏈可變 區(qū)基因的克隆和序列分析.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2001，15(2): 65-68)建立的可變區(qū)序列測(cè) 定方法，通過(guò)分子克隆技術(shù)分別獲得單克隆抗體6E1U1G5的可變區(qū)序列，選取對(duì)應(yīng)的克隆 質(zhì)粒送至蘇州金維智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。
[0089]結(jié)果：?jiǎn)慰寺】贵w6E11的重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)的基因序列分別如SEQ ID 如.1、36〇10如.3所示，由其推導(dǎo)的氨基酸序列分別為3￡〇10如.2、3￡〇10如.4;單克隆 抗體1G5的重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)的基因序列分別如SEQ ID No.5、SEQ ID No. 7所示，由 其推導(dǎo)的氨基酸序列分別為SEQ ID No.6、SEQ ID No.8。
[0090] 1.5單克隆抗體的配對(duì)
[0091] 選擇犬瘟熱病毒CVCC AV299株病毒液，稀釋到102'5TCID5Q/ml，對(duì)于不同搭配模式 進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表2:
[0092]表2單克隆抗體搭配檢測(cè)
[0094] 注:+表示陽(yáng)性反應(yīng)，-表示陰性反應(yīng)。
[0095] 結(jié)果顯示：除了固相的單克隆抗體6E11與酶標(biāo)的單克隆抗體1G5檢測(cè)102 ? 5TCID50/ ml的犬瘟熱病毒CVCC AV299株病毒稀釋液為陽(yáng)性，其它搭配檢測(cè)均為陰性。因而，以單克隆 抗體6E11作為固定抗體、單克隆抗體1G5作為標(biāo)記抗體進(jìn)行試驗(yàn)。
[0096]實(shí)施例2試劑盒的制備及方法、質(zhì)量研究及應(yīng)用
[0097] 2.1試劑盒之膠體金檢測(cè)試紙條
[0098] 2.1.1試劑盒之膠體金檢測(cè)試紙條的制備及應(yīng)用
[0099] 試劑盒包括膠體金檢測(cè)試紙條、樣品處理液（即含2%CHAPS的pH7.4的磷酸鹽緩沖 液）、樣品處理管、樣品保存液，樣品保存液（即PH7.4的磷酸鹽緩沖液)在樣品保存瓶中，其 中膠體金檢測(cè)試紙條的制備如下：
[0100] 按照中國(guó)CN101614737A建立的膠體金制備方法制備膠體金溶液，并分別標(biāo)記單克 隆抗體2(實(shí)施例1制備的抗犬瘟熱病毒單克隆抗體1G5,用pH7.4磷酸鹽緩沖液稀釋至標(biāo)記 濃度為350iig/ml)、單克隆抗體4(抗犬副流感病毒單克隆抗體4C9D8,標(biāo)記濃度為400yg/ ml)、單克隆抗體6(抗犬腺病毒I型單克隆抗體E9,標(biāo)記濃度為450iig/ml)、單克隆抗體8(抗 犬腺病毒II型單克隆抗體4H1-A7，標(biāo)記濃度為450μg/ml)，單克隆抗體1 (實(shí)施例1制備的抗 犬瘟熱病毒單克隆抗體6E11，固定包被濃度為180iig/ml)、單克隆抗體3(抗犬副流感病毒單 克隆抗體4F3B6，用pH7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋至固定濃度為200iig/ml)、單克隆抗體5(抗犬 腺病毒I型單克隆抗體G3,用pH7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋至固定濃度為220iig/ml)和/或 Santa公司的單克隆抗體7(抗犬腺病毒II型單克隆抗體anti-CAV-2-Santa，用pH7.4的磷酸 鹽緩沖液稀釋至固定濃度為210μg/ml)，以及羊抗鼠二抗（即羊抗鼠IgG，購(gòu)自Sigma公司）噴 涂固定在硝酸纖維素膜上分別作為檢測(cè)線和質(zhì)控線，將該硝酸纖維素膜和浸潤(rùn)有膠體金標(biāo) 記的單克隆抗體2、單克隆抗體4、單克隆抗體6和/或單克隆抗體8的金標(biāo)墊用塑料外殼包裝 起來(lái)，做成膠體金檢測(cè)試紙條。
[0101] 其中，當(dāng)檢測(cè)線固定的單克隆抗體從左到右依次為單克隆抗體1、3時(shí)作為膠體金 檢測(cè)試紙條1;當(dāng)檢測(cè)線固定的單克隆抗體從左到右依次為單克隆抗體1、3、5時(shí)作為膠體金 檢測(cè)試紙條2;當(dāng)檢測(cè)線固定的單克隆抗體從左到右依次為單克隆抗體1、3、5、7時(shí)作為膠體 金檢測(cè)試紙條3。
[0102] 檢測(cè)時(shí)，將樣品與樣品處理液混合，將2-3滴(約80yl)混合液滴加于膠體金檢測(cè)試 紙條的加樣孔處，同時(shí)迅速按下緩沖液按鈕，靜置30分鐘后在檢測(cè)試紙條的檢測(cè)區(qū)觀察記 錄結(jié)果。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):若質(zhì)控線顯色即試驗(yàn)成立，檢測(cè)線顯色即可判為陽(yáng)性，檢測(cè)線不顯 色即可判為陰性;若質(zhì)控線未顯色即試驗(yàn)不成立，無(wú)論檢測(cè)線是否顯色，均則判定為無(wú)效結(jié) 果，需重測(cè)。
[0103] 2.1.2膠體金檢測(cè)試紙條的質(zhì)量研究
[0104] 靈敏度檢驗(yàn):將犬瘟熱病毒CVCC AV299株(購(gòu)自北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司） 病毒液105'5TCID 5Q做梯度稀釋，稀釋后的濃度依次為他氣他^他允他^如^將犬副流 感病毒Cornell株(源自Nobivaf)病毒液 1〇6'5tcid5〇作梯度稀釋，稀釋濃度依次為1〇4'5、 10 4'Q、103'5、103' Q、102'5;將犬腺病毒 I 型 H株(參見中國(guó)專利 CN101914502A)病毒液 106'qTCID50 作梯度稀釋，稀釋濃度依次為1〇3'5、1〇3'1〇2' 5、1〇2'1〇1'5;將犬腺病毒11型426株（即 Toronto A26/61 株或ATCC VR-800株，參見文獻(xiàn)Darai G,Rosen A，DepI-Hs H，F(xiàn)lugel RM.Characterization of the DNA of canine adenovirus byrestriction enzyme analysis. Intervirology，1985,23(1) :23_28)病毒液 105'QTCID5〇做濃度稀釋，稀釋度依次 為104' ()、103'5、103'()、10 2'5、102'()。然后分別用膠體金檢測(cè)試紙條1、2、3對(duì)各病毒進(jìn)行檢測(cè)，以 確定膠體金檢測(cè)試紙條1、2、3對(duì)各種病毒的檢測(cè)下限。結(jié)果表明：膠體金檢測(cè)試紙條1、2、3 對(duì)⑶V的檢測(cè)下限均為10 2'5TCID5Q/ml，膠體金檢測(cè)試紙條1、2、3對(duì)CPIV的檢測(cè)下限均為 10 3'5TCID5Q/ml，膠體金檢測(cè)試紙條2、3對(duì)CAV-1的檢測(cè)下限均為10 3'5TCID5Q/ml (針對(duì)CAV-1 的檢測(cè)在l〇2'6TCID5Q/ml檢測(cè)結(jié)果為陰性，因此盡管其在10 3'2TCID5Q/ml含量時(shí)檢測(cè)結(jié)果為 陽(yáng)性，仍將檢測(cè)下限定為l〇 3'5TCID5Q/ml)，膠體金檢測(cè)試紙條3對(duì)CAV-2的檢測(cè)下限為 10 3-0TCID5〇/ml〇
[0105] 特異性測(cè)定：用膠體金檢測(cè)試紙條1、2、3分別檢測(cè)犬源其它病毒，包括犬細(xì)小病 毒、狂犬病毒、犬支氣管敗血波氏桿菌，結(jié)果均為陰性，說(shuō)明試紙條1、2、3特異性均良好。
[0106] 重復(fù)性試驗(yàn):分別取膠體金檢測(cè)試紙條1、2、3,每批各抽15條，分別檢測(cè)試紙條上 檢測(cè)線固定單克隆抗體對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)病毒溶液各5次，如膠體金檢測(cè)試紙條1檢測(cè)CDV、CPIV， 結(jié)果:各相應(yīng)樣品檢測(cè)均為陽(yáng)性，且試紙條間顯色強(qiáng)度一致，表明重復(fù)性良好。
[0107] 保存期研究:分別將膠體金檢測(cè)試紙條1、2、3按照以下要求進(jìn)行檢測(cè)，將三個(gè)連續(xù) 批號(hào)試紙條分別于37°C放置6天后進(jìn)行熱穩(wěn)定性試驗(yàn);將試紙條在2-8°C分別存放6個(gè)月、9 個(gè)月、12個(gè)月和15個(gè)月，進(jìn)行試紙條的實(shí)時(shí)穩(wěn)定性試驗(yàn)。對(duì)不同保存條件的試紙條進(jìn)行質(zhì)控 品檢驗(yàn)。質(zhì)控品為病毒含量為10 3'102'101、(：105()/1111的〇^(^〇^￥299株病毒液，病毒含 量含10 4'5、103'5、102' 51'(：105()/1111的〇?1￥(：〇^1611株病毒液，病毒含量為103' 5、102'5、 IOUtCIDm的CAV-1H株病毒液，病毒含量為104'Q、103' Q、102'QTCID5QCAV-2A26株病毒液，重復(fù) 檢測(cè)3次。試紙條1、2、3分別各檢測(cè)3次的結(jié)果均為陽(yáng)性且同一試紙條間顯色強(qiáng)度一致，表明 試紙條1、2、3在37°C條件下保存可貯存6天，在2-8°C規(guī)定條件下保存可貯存15月，表明試紙 條的保存期至少均可達(dá)12個(gè)月。
[0108] 2.1.3樣品檢測(cè)及比對(duì)試驗(yàn)
[0109] 將CDV CVCC AV299株、CPIV Cornell株、CAV-1H株、CAV-2A26株用pH7.4磷酸鹽緩 沖液配制成10份已知病毒的混合溶液（即樣品1-10)，分別經(jīng)實(shí)施例2.1.1制備的膠體金檢 測(cè)試紙條1、2、3進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見表3-5。
[0110] 將采集的1〇份臨床樣品（即樣品11-20)即微生物拭子(約含樣品100mg)插入到樣 品處理管中，使樣品盡可能溶解在樣品處理液(即pH7.4的磷酸鹽緩沖液）中，最后使微生物 拭子頭這段留于管中；然后將含有臨床樣品的樣品處理管蓋子頭部折斷，滴加2-3滴混勻后 的樣品（約80yl)至膠體金檢測(cè)試紙條加樣孔中心；10分鐘后在膠體金檢測(cè)試紙條的檢測(cè)區(qū) 觀察，根據(jù)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)記錄結(jié)果(見表3-5)。
[0111] 同時(shí)，將20份樣品按照中國(guó)專利CN102618666A對(duì)CDV、CPIV、CAV-l、CAV-2進(jìn)行RT-pCR檢測(cè)，同時(shí)分別用Bi 0n0te犬瘟熱病毒抗原快速檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自韓國(guó)安捷公司，參照試 劑盒參考說(shuō)明書進(jìn)行操作）、犬副流感病毒檢測(cè)卡(購(gòu)自上?？祆`生物科技有限公司）、犬腺 病毒I型檢測(cè)卡(購(gòu)自上海快靈生物科技有限公司）、犬腺病毒n型檢測(cè)卡(購(gòu)自上?？祆`生 物科技有限公司)進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)，結(jié)果見表3-5。
[0112] 表3膠體金檢測(cè)試紙條1、酶免疫層析檢測(cè)試紙條1檢測(cè)及與現(xiàn)有技術(shù)比對(duì)結(jié)果
[0114]表4膠體金檢測(cè)試紙條2、酶免疫層析檢測(cè)試紙條2檢測(cè)及與現(xiàn)有技術(shù)比對(duì)結(jié)果
[0116]表5膠體金檢測(cè)試紙條3、酶免疫層析檢測(cè)試紙條3檢測(cè)及與現(xiàn)有技術(shù)比對(duì)結(jié)果
[0118]
[0119] 注:樣品1-10為病毒液，樣品11-20為臨床樣品；"+"表示檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，表示 檢測(cè)結(jié)果為陰性，7"表示臨床糞便樣品；金標(biāo)1、2、3依次表示膠體金檢測(cè)試紙條1、2、3,酶 免1、2、3依次表示酶免疫層析檢測(cè)試紙條1、2、3。
[0120] 由表3可知:膠體金檢測(cè)試紙條1可同時(shí)檢測(cè)⑶V、CPIV兩種病毒，并且膠體金檢測(cè) 試紙條1檢測(cè)CDV的結(jié)果略低于RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果比，優(yōu)于韓國(guó)安捷CDV試劑盒的檢測(cè)結(jié)果； 檢測(cè)CPIV的結(jié)果也略低于RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果，優(yōu)于上海快靈CPIV檢測(cè)卡的檢測(cè)結(jié)果。
[0121] 由表4可知：膠體金檢測(cè)試紙條2可同時(shí)檢測(cè)⑶V、CPIV、CAV-1三種病毒，并且膠體 金檢測(cè)試紙條2檢測(cè)CDV的結(jié)果與膠體金檢測(cè)試紙條1的結(jié)果相當(dāng)，略低于RT-PCR的檢測(cè)結(jié) 果，優(yōu)于韓國(guó)安捷試劑盒的檢測(cè)結(jié)果;檢測(cè)CPIV的結(jié)果與膠體金檢測(cè)試紙條1的結(jié)果相當(dāng)， 略低于RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果，優(yōu)于上海快靈CPIV的檢測(cè)結(jié)果;檢測(cè)CAV-1的結(jié)果略低于RT-PCR 的檢測(cè)結(jié)果，優(yōu)于上?？祆`CAV-1的檢測(cè)結(jié)果。
[0122] 由表5可知:膠體金檢測(cè)試紙條3可同時(shí)檢測(cè)⑶￥、0?1￥、04￥-1、0六￥-2四種病毒，并 且膠體金檢測(cè)試紙條3檢測(cè)CDV的結(jié)果與膠體金檢測(cè)試紙條1、2的結(jié)果相當(dāng)，略低于RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果相當(dāng)，優(yōu)于韓國(guó)安捷試劑盒的檢測(cè)結(jié)果;檢測(cè)CPIV的結(jié)果與膠體金檢測(cè)試紙條1、2 的結(jié)果相當(dāng)，略低于RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果，優(yōu)于上?？祆`CPIV檢測(cè)卡的檢測(cè)結(jié)果;檢測(cè)CAV-1 的結(jié)果與膠體金檢測(cè)試紙條2的結(jié)果相當(dāng)，略低于RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果，優(yōu)于上海快靈CVA-1 檢測(cè)卡的檢測(cè)結(jié)果;檢測(cè)CAV-2的結(jié)果略低于RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果，優(yōu)于上?？祆`CVA-2檢測(cè) 卡的檢測(cè)結(jié)果。
[0123] 2.2試劑盒之酶免疫層析檢測(cè)試紙條的制備及應(yīng)用
[0124] 2.2.1試劑盒之酶免疫層析檢測(cè)試紙條的制備
[0125] 試劑盒包括酶免疫層析檢測(cè)試紙條、樣品處理液（即含2%CHAPS的pH7.4的磷酸鹽 緩沖液）、樣品處理管、樣品保存液，樣品保存液（即PH7.4的磷酸鹽緩沖液)在樣品保存瓶 中，其中酶免疫層析檢測(cè)試紙條的制備如下：
[0126] 按照中國(guó)CN104062430A制備酶免疫層析檢測(cè)試紙條，先將單克隆抗體2(實(shí)施例1 制備的抗犬瘟熱病毒單克隆抗體1G5，用pH7.4磷酸鹽緩沖液稀釋至標(biāo)記濃度為350iig/ml)、 單克隆抗體4(抗犬副流感病毒單克隆抗體4C9D8,標(biāo)記濃度為400iig/ml)、單克隆抗體6(抗 犬腺病毒I型單克隆抗體E9,標(biāo)記濃度為450iig/ml)、單克隆抗體8(抗犬腺病毒II型單克隆 抗體4H1-A7，標(biāo)記濃度為450iig/ml)分別用辣根過(guò)氧化物酶HRP進(jìn)行標(biāo)記，將單克隆抗體1 (實(shí)施例1制備的抗犬瘟熱病毒單克隆抗體6E11，固定包被濃度為180μg/ml)、單克隆抗體3 (抗犬副流感病毒單克隆抗體4F3B6,用pH7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋至固定濃度為200yg/ ml)、單克隆抗體5(抗犬腺病毒I型單克隆抗體G3,用pH7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋至固定濃度 為220邱/1111)和/或單克隆抗體7(抗犬腺病毒11型單克隆抗體 &1^1-04￥-2-3&1^&，用口117.4 的磷酸鹽緩沖液稀釋至固定濃度為210iig/ml)，以及羊抗鼠二抗（即羊抗鼠IgG，購(gòu)自Sigma 公司）噴涂固定在硝酸纖維素膜上分別作為檢測(cè)線和質(zhì)控線，將該硝酸纖維素膜和浸潤(rùn)有 酶標(biāo)記的單克隆抗體2、單克隆抗體4、單克隆抗體6和/或單克隆抗體8的酶標(biāo)墊用塑料外殼 包裝起來(lái)，做成酶免疫層析檢測(cè)試紙條。
[0127] 其中，當(dāng)檢測(cè)線固定的單克隆抗體從左到右依次為單克隆抗體1、3時(shí)作為酶免疫 層析檢測(cè)試紙條1，如圖2(1)所示；當(dāng)檢測(cè)線固定的單克隆抗體從左到右依次為單克隆抗體 1、3、5時(shí)作為酶免疫層析檢測(cè)試紙條2,如圖2(2)所示；當(dāng)檢測(cè)線固定的單克隆抗體從左到 右依次為單克隆抗體1、3、5、7時(shí)作為酶免疫層析檢測(cè)試紙條3,如圖2(3)所示。
[0128] 檢測(cè)時(shí)，將樣品與樣品處理液混合，將2-3滴(約80yl)混合液滴加于酶免疫層析檢 測(cè)試紙條的加樣孔處，同時(shí)迅速按下緩沖液按鈕，靜置30分鐘后在檢測(cè)試紙條的檢測(cè)區(qū)觀 察記錄結(jié)果。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):若質(zhì)控線顯色即試驗(yàn)成立，檢測(cè)線顯色即可判為陽(yáng)性，檢測(cè)線 不顯色即可判為陰性;若質(zhì)控線未顯色即試驗(yàn)不成立，無(wú)論檢測(cè)線是否顯色，均則判定為無(wú) 效結(jié)果，需重測(cè)。
[0129] 2.2.2酶免疫層析檢測(cè)試紙條的質(zhì)量研究
[0130] 靈敏度檢驗(yàn):將實(shí)施例2.1制備的含CVCC AV299株的不同濃度病毒溶液、含CPIV Cornell株的不同濃度病毒溶液、含CAV-1H株的不同濃度病毒溶液和/或含CAV-2A26株的不 同病毒液的混合溶液，然后分別用酶免疫層析檢測(cè)試紙條進(jìn)行檢測(cè)，分別確定酶免疫層析 檢測(cè)試紙條1、2、3對(duì)各種病毒的檢測(cè)下限。結(jié)果，酶免疫層析檢測(cè)試紙條1、2、3對(duì)CDV的檢測(cè) 下限均為H^TCIDM/ml;酶免疫層析檢測(cè)試紙條1、2、3對(duì)CPIV的檢測(cè)下限均為H^TCIDm/ ml;酶免疫層析檢測(cè)試紙條2、3對(duì)CAV-1的檢測(cè)下限均為lO^TCIDso/ml;酶免疫層析檢測(cè)試 紙條3對(duì)CAV-2的檢測(cè)下限均為10 2 ? 5TCID5Q/ml。
[0131] 特異性測(cè)定：用酶免疫層析檢測(cè)試紙條1、2、3分別檢測(cè)犬源其它病毒，包括犬細(xì)小 病毒、狂犬病毒、犬支氣管敗血波氏桿菌，結(jié)果均為陰性，說(shuō)明試紙條1、2、3特異性均良好。
[0132] 重復(fù)性試驗(yàn):取酶免疫層析檢測(cè)試紙條1、2、3,各抽15條，分別檢測(cè)試紙條上檢測(cè) 線固定單克隆抗體對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)病毒溶液各5次，如酶免疫層析檢測(cè)試紙條1檢測(cè)CDV、CPIV， 結(jié)果，各相應(yīng)樣品檢測(cè)均為陽(yáng)性，且試紙條間顯色強(qiáng)度一致，表明重復(fù)性良好。結(jié)果，試紙條 1、2、3的檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，且顯色強(qiáng)度一致，表明重復(fù)性良好。
[0133] 保存期研究:分別將酶免疫層析檢測(cè)試紙條1、2、3按照以下要求進(jìn)行檢測(cè)，將三個(gè) 連續(xù)批號(hào)試紙條分別于37°C放置6天后進(jìn)行熱穩(wěn)定性試驗(yàn);將試紙條在2-8°C分別存放6個(gè) 月、9個(gè)月、12個(gè)月和15個(gè)月，進(jìn)行試紙條的實(shí)時(shí)穩(wěn)定性試驗(yàn)。對(duì)不同保存條件的試紙條進(jìn)行 質(zhì)控品檢驗(yàn)，質(zhì)控品為病毒含量為10 3'102'5、101、(：105()/1111的〇^(^〇^￥299株病毒液，病 毒含量含1〇 4'5、1〇3'5、1〇2' 51'(：105()/1111的0?1￥0^11611株病毒液，病毒含量為103' 5、102'5、 IOUtCIDm的CAV-1H株病毒液，病毒含量為104'Q、103' Q、102'QTCID5QCAV-2A26株病毒液，重復(fù) 檢測(cè)3次。試紙條1、2、3分別各檢測(cè)3次的結(jié)果均為陽(yáng)性且同一試紙條間顯色強(qiáng)度一致，表明 試紙條1、2、3在37°C條件下保存可貯存6天，在2-8°C規(guī)定條件下保存可貯存15月，表明試紙 條的保存期至少均可達(dá)12個(gè)月。
[0134] 2.2.3樣品檢測(cè)及比對(duì)試驗(yàn)
[0135] 將2~3滴(約80yl)實(shí)施例2.1制備的20份樣品滴加于酶免疫層析檢測(cè)試紙條的加 樣孔處，同時(shí)迅速按下緩沖液按鈕，靜置30分鐘后在酶免試紙條的檢測(cè)區(qū)觀察，根據(jù)結(jié)果判 定標(biāo)準(zhǔn)記錄各檢測(cè)結(jié)果。
[0136] 由表3可知:酶免疫層析檢測(cè)試紙條1可同時(shí)檢測(cè)CDV、CPIV兩種病毒，并且酶免疫 層析檢測(cè)試紙條1檢測(cè)CDV的結(jié)果與RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果相當(dāng)，優(yōu)于膠體金檢測(cè)試紙條1、2、3 以及韓國(guó)安捷試劑盒的檢測(cè)結(jié)果;檢測(cè)CPIV的結(jié)果與RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果相當(dāng)，優(yōu)于膠體金 檢測(cè)試紙條1、2、3以及上海快靈CPIV檢測(cè)卡的檢測(cè)結(jié)果。
[0137] 由表4可知：酶免疫層析檢測(cè)試紙條2可同時(shí)檢測(cè)⑶V、CPIV、CAV_1三種病毒，并且 酶免疫層析檢測(cè)試紙條2檢測(cè)CDV的結(jié)果與酶免疫層析檢測(cè)試紙條1的結(jié)果相當(dāng)，與RT-PCR 的檢測(cè)結(jié)果相當(dāng)，優(yōu)于膠體金檢測(cè)試紙條1、2、3及韓國(guó)安捷試劑盒的檢測(cè)結(jié)果;檢測(cè)CPIV的 結(jié)果與RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果相當(dāng)，優(yōu)于膠體金檢測(cè)試紙條1、2、3以及上?？祆`CPIV檢測(cè)卡的 檢測(cè)結(jié)果;檢測(cè)CAV-1的結(jié)果與RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果相當(dāng)，優(yōu)于膠體金檢測(cè)試紙條2、3以及上 ?？祆`CPIV檢測(cè)卡的檢測(cè)結(jié)果。
[0138] 由表5可知：酶免疫層析檢測(cè)試紙條3可同時(shí)檢測(cè)0^、0?1￥、04￥-1、04￥-2四種病 毒，并且酶免疫層析檢測(cè)試紙條3檢測(cè)CDV的結(jié)果與酶免疫層析檢測(cè)試紙條1、2的結(jié)果相當(dāng)， 與RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果相當(dāng)，優(yōu)于膠體金檢測(cè)試紙條1、2、3以及韓國(guó)安捷試劑盒的檢測(cè)結(jié)果； 檢測(cè)CPIV的結(jié)果與酶免疫層析檢測(cè)試紙條1、2的結(jié)果相當(dāng)，與RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果相當(dāng)，優(yōu)于 膠體金檢測(cè)試紙條1、2、3以及上?？祆`CPIV檢測(cè)卡的檢測(cè)結(jié)果;檢測(cè)CAV-1的結(jié)果與酶免疫 層析檢測(cè)試紙條2的結(jié)果相當(dāng)，與RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果相當(dāng)，優(yōu)于膠體金檢測(cè)試紙條2、3以及 上?？祆`CAV-1的檢測(cè)結(jié)果;檢測(cè)CAV-2的結(jié)果與RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果相當(dāng)，優(yōu)于膠體金檢測(cè) 試紙條3以及上?？祆`CVA-2檢測(cè)卡的檢測(cè)結(jié)果。
[0139] 綜上所述，本發(fā)明制備的膠體金檢測(cè)試紙條、酶免疫層析檢測(cè)試紙條可同時(shí)檢測(cè) 兩種、三種或四種病毒膠體金檢測(cè)試紙條優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)中的其他膠體金檢測(cè)試紙，酶免疫 層析檢測(cè)試紙條與PCR檢測(cè)靈敏度相當(dāng)。
[0140]以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉 本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)，當(dāng)可利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容作 出些許更動(dòng)或修飾為等同變化的等效實(shí)施例，但凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù) 本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明 技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種試劑盒，所述試劑盒包括有效量的抗犬瘟熱病毒單克隆抗體I、2和有效量的抗 犬副流感病毒單克隆抗體3、4,以及對(duì)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的檢測(cè)試劑； 其中，所述單克隆抗體1為抗犬瘟熱病毒單克隆抗體6E11，所述單克隆抗體2為抗犬瘟 熱病毒單克隆抗體1G5;以及 所述抗犬副流感病毒單克隆抗體3、4分別選自4F3B6、4C9D6、5B4C9、4G7F4中的兩種，且 所述抗犬副流感病毒單克隆抗體3、4能與犬副流感病毒同時(shí)發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其中，所述單克隆抗體3為抗犬副流感病毒單克隆抗體 4F3B6、所述單克隆抗體4為抗犬副流感病毒單克隆抗體4C9D8。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述試劑盒，其中，所述試劑盒進(jìn)一步含有有效量的抗犬腺病毒I 型單克隆抗體5、6,和/或有效量的抗犬腺病毒Π 型單克隆抗體7、8， 其中，所述抗犬腺病毒I型單克隆抗體5、6分別選自C8、E9、G3、C2、H2、2E10-H2中的兩 種，且所述抗犬腺病毒I型單克隆抗體5、6能與犬腺病毒I型同時(shí)發(fā)生抗原抗體反應(yīng);以及 所述抗犬腺病毒Π 型單克隆抗體7為Santa公司的anti-CAV-2-Santa、單克隆抗體8為 4H1-A7； 優(yōu)選地，所述單克隆抗體5為抗犬腺病毒I型單克隆抗體G3,所述單克隆抗體6為抗犬腺 病毒I型單克隆抗體E9。4. 根據(jù)權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述試劑盒，其中，所述單克隆抗體1、3、5、7的含量各自分 別為25-1 OOOμg/ml，所述單克隆抗體2、4、6、8的含量各自分別為50-2000μg/ml。5. 根據(jù)權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述試劑盒，其中，所述試劑盒進(jìn)一步包括洗滌液、稀釋 液、底物顯色液、終止液、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照。6. 根據(jù)權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述試劑盒，其中，所述單克隆抗體1、單克隆抗體3固定于 固相上，所述固相包括微滴定板、磁顆粒、乳膠顆粒、硝酸纖維素膜;優(yōu)選地，所述單克隆抗 體1、單克隆抗體3、單克隆抗體5和/或單克隆抗體7固定于固相上，所述固相包括微滴定板、 磁顆粒、乳膠顆粒、硝酸纖維素膜。7. 根據(jù)權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述試劑盒，其中，所述對(duì)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的檢測(cè) 試劑包括酶顯色檢測(cè)試劑、膠體金檢測(cè)試劑、熒光檢測(cè)試劑、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑或同位素檢 測(cè)試劑。8. 根據(jù)權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述試劑盒，其中，所述試劑盒包括膠體金檢測(cè)試紙條，所 述膠體金檢測(cè)試紙條包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二 端的方向，所述底板上依次有濾紙、樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述金標(biāo)墊上 含有膠體金標(biāo)記的所述單克隆抗體2、膠體金標(biāo)記的所述單克隆抗體4,所述硝酸纖維素膜 上有兩條檢測(cè)線和一條質(zhì)控線，所述檢測(cè)線依次固定有單克隆抗體1、單克隆抗體3所述質(zhì) 控線上有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗； 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括有效量的抗犬腺病毒I型單克隆抗體5、6和/或有效量的抗 犬腺病毒II型單克隆抗體7、8,所述試劑盒的所述金標(biāo)墊上進(jìn)一步包括含有膠體金標(biāo)記的 所述單克隆抗體6和/或膠體金標(biāo)記的單克隆抗體8,所述硝酸纖維素膜上有三條或四條檢 測(cè)線，所述檢測(cè)線依次固定有單克隆抗體1、單克隆抗體3、單克隆抗體5和/或單克隆抗體7。9. 根據(jù)權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中，所述試劑盒包括緩沖液供應(yīng)單元和 酶免疫層析檢測(cè)試紙條;所述緩沖液供應(yīng)單元用于將緩沖液供給所述酶免疫層析檢測(cè)試紙 條;所述酶免疫層析檢測(cè)試紙條包括硝酸纖維素膜(I)，所述酶免疫層析檢測(cè)試紙條在縱向 上依次包括底物供應(yīng)區(qū)、樣品供應(yīng)區(qū)、檢測(cè)區(qū);所述底物供應(yīng)區(qū)包括底物墊(3)，其上吸附有 干燥的酶底物，所述底物墊(3)與硝酸纖維素膜（1)接觸，當(dāng)所述緩沖液供應(yīng)單元向所述酶 免疫層析檢測(cè)試紙條供給緩沖液，所述酶底物溶于緩沖液中并在硝酸纖維素膜（1)上向距 所述緩沖液供應(yīng)單元的遠(yuǎn)端迀移;所述樣品供應(yīng)區(qū)包括酶標(biāo)墊(2)，其上吸附有酶標(biāo)記的所 述單克隆抗體2、所述單克隆抗體4,所述酶底物能與所述單克隆抗體2、所述單克隆抗體4上 標(biāo)記的酶產(chǎn)生顯色反應(yīng)，所述酶標(biāo)墊(2)與硝酸纖維素膜（1)接觸，所述單克隆抗體2、所述 單克隆抗體4溶于緩沖液中并在硝酸纖維素膜(1)上向距所述緩沖液供應(yīng)單元的遠(yuǎn)端迀移； 以及所述檢測(cè)區(qū)依次固定化有所述單克隆抗體1、所述單克隆抗體3;其中，所述緩沖液供應(yīng) 單元包括展開液墊(5)、底物緩沖液槽(8)、底物緩沖液(9)和緩沖液按鈕，所述底物緩沖液 (9)放置于底物緩沖液槽(8)中，所述緩沖液按鈕位于底物緩沖液槽(8)的上方，按下所述按 鈕可將所述展開液墊(5)浸入緩沖液(9)中；所述檢測(cè)區(qū)包括檢測(cè)線(6)、質(zhì)控線(7)，其中， 所述質(zhì)控線(7)較檢測(cè)線(6)更遠(yuǎn)離所述樣品供應(yīng)區(qū)，在所述檢測(cè)線(6)分別固定化有所述 單克隆抗體1、所述單克隆抗體3,在所述質(zhì)控線(7)固定化有羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗，且 吸附在酶標(biāo)墊(2)上的所述酶標(biāo)記的單克隆抗體2、單克隆抗體4分別對(duì)于固定在檢測(cè)線(6) 的所述單克隆抗體1、所述單克隆抗體3而言是過(guò)量的;所述硝酸纖維素膜(1)全段粘附在所 述支撐物（10)上，支撐物（10)連接所述緩沖液供應(yīng)單元，底物供應(yīng)區(qū)，樣品供應(yīng)區(qū)，檢測(cè)區(qū) 以及吸水墊(4)，所述吸水墊(4)在距所述緩沖液供應(yīng)單元的最遠(yuǎn)端；以及檢測(cè)樣品（11)加 入的位置為所述酶標(biāo)墊(2)的位置； 優(yōu)選地，所述試劑盒的酶標(biāo)墊(2)，其上吸附有酶標(biāo)記的所述單克隆抗體2、所述單克隆 抗體4、所述單克隆抗體6和/或所述單克隆抗體8,所述酶底物能與所述單克隆抗體2、所述 單克隆抗體4、所述單克隆抗體6和/或所述單克隆抗體8上標(biāo)記的酶產(chǎn)生顯色反應(yīng)，所述酶 標(biāo)墊(2)與硝酸纖維素膜（1)接觸，所述單克隆抗體2、所述單克隆抗體4、所述單克隆抗體6 和/或所述單克隆抗體8溶于緩沖液中并在硝酸纖維素膜(1)上向距所述緩沖液供應(yīng)單元的 遠(yuǎn)端迀移；以及所述檢測(cè)區(qū)依次固定化有所述單克隆抗體1、所述單克隆抗體3、所述單克隆 抗體5和/或所述單克隆抗體7;且吸附在酶標(biāo)墊(2)上的所述酶標(biāo)記的單克隆抗體2、單克隆 抗體4、所述單克隆抗體6和/或所述單克隆抗體8分別對(duì)于固定在檢測(cè)線(6)的所述單克隆 抗體1、所述單克隆抗體3、所述單克隆抗體。10.-種根據(jù)權(quán)利要求1~9任一項(xiàng)所述試劑盒在用于非診斷目的的犬瘟熱病毒、犬副 流感病毒檢測(cè)中的應(yīng)用;優(yōu)選地，所述試劑盒在用于非診斷目的的犬瘟熱病毒、犬副流感病 毒、犬腺病毒I型和/或犬腺病毒Π 型檢測(cè)中的應(yīng)用； 所述非診斷目的包括流行病學(xué)分析、對(duì)離體組織進(jìn)行定性和定量檢測(cè)、表位鑒定研究 以及定性和定量鑒別檢驗(yàn)含所述犬瘟熱病毒、犬副流感病毒的全病毒抗原的疫苗組合物中 的全病毒抗原，或定性和定量鑒別檢驗(yàn)含犬瘟熱病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒I型和/或犬 腺病毒Π 型的全病毒抗原的疫苗組合物中的全病毒抗原。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK105891491SQ201610221785
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年4月11日
【發(fā)明人】田克恭, 王瑩
【申請(qǐng)人】洛陽(yáng)普萊柯萬(wàn)泰生物技術(shù)有限公司