酪氨酸激酶抑制劑類靶向用藥指導(dǎo)抗體芯片和檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了兩種用于酪氨酸激酶抑制劑類抗腫瘤藥物相關(guān)靶點蛋白活性檢測的抗體芯片，包括基于基片的固相抗體芯片以及基于微珠的液態(tài)懸浮芯片，該抗體芯片所包含的檢測指標(biāo)涵蓋了目前已上市的酪氨酸激酶抑制劑類抗腫瘤藥物的相關(guān)靶點。本發(fā)明還公開了四種運用該抗體芯片的檢測方法，包括基于樣本標(biāo)記的單色熒光檢測法、基于樣本標(biāo)記的雙色熒光檢測法、雙抗夾心檢測法以及利用液相懸浮芯片檢測的方法。運用本發(fā)明對腫瘤患者手術(shù)切除樣本進行檢測，實現(xiàn)個性化有效治療的用藥指導(dǎo)。
【專利說明】
酪氨酸激酶抑制劑類靶向用藥指導(dǎo)抗體芯片和檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生化醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及酪氨酸激酶抑制劑類抗腫瘤藥物個性化 治療指導(dǎo)的藥物靶點蛋白活性檢測的抗體芯片和檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白釀氨酸激酶（PTKs，protein tyrosine kinases)或釀氨酸激酶（TKs, tyrosine kinases)，特異地將蛋白質(zhì)底物上的某些釀氨酸殘基磷酸化，從而調(diào)節(jié)其功能的 酶?？煞譃槿悾孩偈荏w酪氨酸激酶，為單次跨膜蛋白；②胞質(zhì)酪氨酸激酶，如Src家族、Tec 家族、ZAP70家族、JAK家族等；③核內(nèi)酪氨酸激酶，如Abl和Wee。根據(jù)PTK是否是細(xì)胞膜 受體，分成受體型和非受體型。
[0003] 受體釀氨酸激酶（receptor tyrosine kinases,RTKs)是最大的一類酶聯(lián)受體，它 既是受體，又是激酶，能夠與配體結(jié)合，并將靶蛋白的酪氨酸殘基磷酸化。所有的RTKs都是 由三個部分組成的：含有配體結(jié)合位點的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、單次跨膜的疏水ct螺旋區(qū)、含有 酪氨酸蛋白激酶活性的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。主要有表皮生長因子（EGF)受體，包括EGFR、HER2、 ErbB4等成員；血小板生長因子（PDGF)受體和集落刺激因子l(CSF-l)受體，包括TOGFRA、 ^)6?1?、05?11?、1(11'等成員 ；胰島素和胰島素樣生長因子-1(16?-1)受體，包括16?11?等成 員；神經(jīng)生長因子（NGF)受體、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF)受體、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF) 受體和肝細(xì)胞生長因子（HGF)受體，包括VEGFRl(FLT-l)、VEGFR2(KDR)、VEGFR3(FLT-4)等 成員。
[0004] 迄今發(fā)現(xiàn)的蛋白酪氨酸激酶中多數(shù)是屬于致癌RNA病毒的癌基因產(chǎn)物，也可由脊 椎動物的原癌基因產(chǎn)生。超過50%的原癌基因和癌基因產(chǎn)物都具有蛋白酪氨酸激酶活性， 調(diào)節(jié)正常細(xì)胞的信號傳遞和發(fā)育，也與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、遷移和凋亡密切相關(guān)。PTK功 能的失調(diào)會導(dǎo)致其下游信號通路的激活，進而引起細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)紊亂，導(dǎo)致腫瘤的形成。因 此，以PTK為靶點的藥物研發(fā)已經(jīng)成為當(dāng)前抗腫瘤藥物研究的熱點之一。
[0005] 目前主要有兩種途徑可以終止酪氨酸激酶所介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，一類是單克 隆抗體，如曲妥珠單抗（Trastuzumab)、西妥昔單抗（cetuximab);另一類是釀氨酸激酶抑 制劑類（Tyrosine Kinase Inhibitors, TKIs)小分子藥物。已經(jīng)批準(zhǔn)上市的TKI類抗腫 瘤藥物包括伊馬替尼（Imatinib)、吉非替尼（Gefitinib)、厄洛替尼（Erlotinib)、索拉非 尼（Sorafenib)、達沙替尼（Dasatinib)、舒尼替尼（Sunitinib)、尼洛替尼（Nilotinib)、 拉帕替尼（Lapatinib)、帕唑帕尼（Pazopanib)、魯索利替尼（Ruxolitinib)、克唑替尼 (Crizotinib)、維羅非尼（Vemurafenib)、凡德他尼（Vandetanib)、?？颂婺幔↖cotinib)、 普納替尼（Ponatinib)、卡波替尼（Cabozantinib)、瑞格非尼（Regorafenib)、伯舒替尼 (Bosutinib)、阿西替尼（Axitinib)、拉多替尼（Radotinib)、阿法替尼（Afatinib)、曲美替 尼（Trametinib)、達拉菲尼（Dabrafenib)、依魯替尼（Ibrutinib)共24種，見表1，包括各 自藥物作用的靶點。恒瑞醫(yī)藥的重磅新藥阿帕替尼（Apatinib)可抑制VEGFR酪氨酸激酶 活性，阻斷VEGF結(jié)合后的信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致腫瘤血管生成抑制。這是由中國腫瘤專家團隊與 民族制藥企業(yè)歷經(jīng)10年，共同創(chuàng)新研發(fā)的全球第一個小分子抗血管生成靶向藥物，該藥物 第一次在晚期胃癌被證實有確切療效和安全性。目前進入三合一綜合審評，獲批進入倒計 時。
[0006] 表1目前上市的TKIs抗腫瘤藥物[1]


[0010] [1]，作用革巴點查詢自 DrugBank (http ://www. drugbank. ca/)與 Therapeutic target database(http ://bidd. nus. edu. sg/group/TTD/ttd. asp) 〇
[0011] TKI類靶向藥物的療效雖得到廣泛認(rèn)可，但患者用藥后的藥效個體差異很大。大 量的臨床研究已經(jīng)證實，TKIs的療效/毒副作用與患者體內(nèi)某些酪氨酸激酶的活性直接相 關(guān)，見表1。因此，在患者接受抗腫瘤藥物之前，對這些酪氨酸激酶的活性進行鑒定將有助于 臨床醫(yī)生判別患者是否適合使用此類藥物，減少藥物毒副作用的發(fā)生，同時避免醫(yī)療資源 的浪費。
[0012] 同時，腫瘤作為一種復(fù)雜的疾病，其生長和存活不僅僅依賴于一種受體或信號通 路，這使得作用于單一靶點的藥物不能完全殺滅腫瘤細(xì)胞。研究表明不同靶點藥物的聯(lián)合 使用能夠抑制多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，阻斷新生血管的生成，抑制腫瘤細(xì) 胞的增殖。因此，在患者接受抗腫瘤藥物之前，對這些酪氨酸激酶的活性進行鑒定也有助于 醫(yī)生判別是否需要聯(lián)合用藥。
[0013] 目前，影響酪氨酸激酶的活性包括其表達水平以及修飾水平的檢測主要基于免疫 印跡法（Western blot，WB)。然而WB法耗時、費力，難以同時進行批量蛋白的檢測，不適合 用于臨床應(yīng)用。盡管有些藥物是針對靶點的突變而設(shè)計，然而這些突變歸根結(jié)底也是模擬 活性位點的修飾，或者促進活性位點的修飾。因此，迫切需要一種能同時檢測酪氨酸激酶表 達與修飾水平的高通量技術(shù)。
[0014] 抗體芯片技術(shù)與基因芯片類似，利用抗原抗體結(jié)合的原理，在基片上將相應(yīng)的抗 體按照一定的規(guī)則固定排列，具備高通量的特點。盡管Full M〇〇n、RayBi〇、R&D、CST、MerCk 公司擁有用于科研的類似產(chǎn)品，但所包含的檢測指標(biāo)只包括少量的TKI類抗腫瘤藥物的作 用靶點，產(chǎn)品并不聚焦于TKI類作用靶點，且基本不包括修飾位點的檢測，難以應(yīng)用于臨床 (表 2)。
[0015] 表2目前市場上類似的產(chǎn)品
[0016]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0017] 本發(fā)明提供了用于個性化治療指導(dǎo)的酪氨酸激酶抑制劑類抗腫瘤藥物的相關(guān)靶 點蛋白活性檢測的抗體芯片以及檢測方法。該抗體芯片利用抗原抗體結(jié)合的原理，可用于 檢測目前已上市的抗腫瘤藥物相關(guān)靶點的蛋白活性，即以下46種藥物相關(guān)靶點蛋白的表 達水平和（或）修飾水平：Bcr-Abl、ABLl、ABL2、ALK、BTK、CSFlR、DDRl、DDR2、EGFR、EPHAl、 EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、ERBB2、ERBB3、ERBB4、FGFR1、FGFR2、 FGFR3、FGFR4、FLT1、FLT3、FLT4、FRK、FYN、HCK、ITK、JAK1、JAK2、JAK3、KDR、KIT、LCK、LYN、 MET、NTRK1、PDGFRA、PDGFRB、PTK6、RET、SRC、TEK、YES1、BRAF、RAF1、MAPK11、MAP2K1、MAP2K2、 MAP3K2 (包含6種絲氨酸/蘇氨酸激酶，見表3)。
[0018] 表3本發(fā)明所包含的檢測指標(biāo)
[0019]


[0022] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的一種技術(shù)方案是：
[0023] 采用固相抗體芯片，即通過芯片點樣儀將上述檢測指標(biāo)對應(yīng)的各自抗體點制在基 片上，每種抗體設(shè)置重復(fù)。點制的內(nèi)參抗體為P-actin、（1-加13111111以及64?011等。選擇 熒光基團作為陽性對照，點樣緩沖液作為陰性對照（表4)。
[0024] 優(yōu)先地，所述抗體包括：針對上述指標(biāo)的單克隆抗體和（或）多克隆抗體。
[0025] 所述抗體也包括：檢測上述指標(biāo)的蛋白表達水平的抗體，和（或）檢測上述指標(biāo)的 各位點磷酸化修飾水平的抗體。
[0026] 所述基片包括：醛基、環(huán)氧樹脂、聚糖或其他高分子修飾的玻片式或膜式基片。
[0027] 表4本發(fā)明抗體芯片的設(shè)計方案（包含各修飾位點抗體）






[0033] 本發(fā)明所采用的另一種技術(shù)方案是：
[0034] 采用液相懸浮芯片實現(xiàn)上述多重指標(biāo)的檢測，液相懸浮芯片的基質(zhì)包括直徑1-10 微米的以不同突光標(biāo)記的微珠，由于微珠攜帶突光不同，可用于制備芯片的微珠多達1000 種。每一種顏色的微珠上偶聯(lián)一種特異性的上述檢測指標(biāo)對應(yīng)的各自抗體。將偶聯(lián)了特異 性抗體的微珠與樣本中的蛋白反應(yīng)，加入檢測抗體進行檢測。
[0035] 本發(fā)明的另一方面，還提供了利用上述抗體芯片檢測的方法。
[0036] 包括基于樣本標(biāo)記法的單色熒光進行檢測，即各自樣本分別進行生物素標(biāo)記，分 別與各自芯片雜交，最后通過加入熒光標(biāo)記的（鏈霉）親和素（(str印t)avidin)進行檢 測，步驟如下：
[0037] 包含脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉芯片，洗滌；
[0038] 接著用生物素標(biāo)記的樣本與芯片室溫孵育，洗滌；
[0039] 再用熒光標(biāo)記的（鏈霉）親和素與芯片室溫孵育，洗滌，甩干；
[0040] 最后用芯片掃描儀掃描芯片，檢測各自的熒光強度，并利用軟件讀取數(shù)據(jù)，獲得抗 腫瘤藥物相關(guān)靶點蛋白的表達水平和（或）修飾水平。通過腫瘤病人手術(shù)樣本中癌與癌旁 芯片數(shù)據(jù)的比較，對篩選出來的差異表達水平以及修飾水平的靶點蛋白進行專家解讀，幫 助臨床醫(yī)生根據(jù)患者的個體差異制定個體化用藥方案，以提高藥物療效，減少藥物毒副作 用的發(fā)生。
[0041] 優(yōu)先地，所述生物素標(biāo)記的樣本，標(biāo)記基團不限于生物素，還可以是熒光基團或辣 根過氧化物酶等。
[0042] 所述熒光標(biāo)記的（鏈霉）親和素，熒光不限于Cy3、Cy5,還可以是AlexaFluor熒 光等。
[0043] 或者，采用基于樣本標(biāo)記法的雙色熒光進行檢測（圖1)，即各自樣本分別進行生 物素標(biāo)記，各自加入不同熒光標(biāo)記的（鏈霉）親和素，取等份與同一芯片進行雜交，步驟如 下：
[0044] 生物素標(biāo)記樣本；
[0045] 不同熒光標(biāo)記的（鏈霉）親和素與各自生物素標(biāo)記樣本孵育；
[0046] 包含脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉芯片，洗滌；
[0047] 取等份樣本與同一芯片進行孵育，洗滌，甩干；
[0048] 最后用芯片掃描儀掃描芯片，檢測熒光強度，并利用軟件讀取數(shù)據(jù)，獲得抗腫瘤藥 物相關(guān)靶點蛋白的表達水平和（或）修飾水平的調(diào)變情況。
[0049] 優(yōu)先地，所述生物素標(biāo)記樣本，標(biāo)記基團不限于生物素，還可以是熒光基團等。
[0050] 或者，采用雙抗夾心法進行檢測，即樣本與芯片孵育，加入生物素標(biāo)記的檢測抗體 混合物，最后通過加入熒光標(biāo)記的（鏈霉）親和素進行檢測，步驟如下：
[0051] 包含脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉芯片，洗滌；
[0052] 接著樣本與芯片室溫孵育，洗滌；
[0053] 加入生物素標(biāo)記的檢測抗體混合物，與芯片室溫孵育，洗滌；
[0054] 再用熒光標(biāo)記的（鏈霉）親和素與芯片室溫孵育，洗滌，甩干；
[0055] 最后用芯片掃描儀掃描芯片，檢測各自的熒光強度，利用軟件讀取數(shù)據(jù)，獲得抗腫 瘤藥物相關(guān)靶點蛋白的表達水平和（或）修飾水平的調(diào)變情況。
[0056] 其中，檢測抗體是與芯片上的捕獲抗體相對應(yīng)的識別另一表位的抗體混合物。
[0057] 本發(fā)明還提供了利用上述液相懸浮芯片檢測的方法，包括以下步驟：
[0058] 反應(yīng)孔中加入微珠，磁力洗板器洗滌；
[0059] 加入樣品，貼上封口膜，放置在平板搖床上振蕩，避光室溫孵育，洗滌；
[0060] 加入生物素標(biāo)記的檢測抗體，貼上封口膜，放置在平板搖床上振蕩，避光室溫孵 育，洗滌；
[0061] 加入藻紅蛋白（phycoerythrin)標(biāo)記的（鏈霉）親和素，貼上封口膜，放置在平板 搖床上振蕩，避光室溫孵育，洗滌；
[0062] 用反應(yīng)緩沖液重懸，貼上封口膜，避光室溫振蕩；
[0063] 送入已校正的液相芯片分析儀中讀值，獲得抗腫瘤藥物相關(guān)靶點蛋白的表達水平 和（或）修飾水平的調(diào)變情況。
[0064] 本發(fā)明的主要優(yōu)點在于：
[0065] (1)本發(fā)明可在一次反應(yīng)中實現(xiàn)批量藥物靶點的同步并行檢測，實現(xiàn)真正的高通 量高內(nèi)涵檢測。
[0066] (2)本發(fā)明不僅能檢測各藥物靶點的蛋白表達水平，而且能檢測各藥物靶點蛋白 位點的修飾水平。
[0067] (3)本發(fā)明對腫瘤樣本的檢測能給藥物研發(fā)提供新靶點、新思路。
[0068] (4)本發(fā)明操作簡單、檢測快速，易于臨床應(yīng)用。
[0069] (5)本發(fā)明專門針對檢測目前已上市的酪氨酸激酶抑制劑類抗腫瘤藥物相關(guān)靶點 的蛋白活性，可用于腫瘤患者用藥的個性化治療指導(dǎo)。
[0070] (6)本發(fā)明對腫瘤樣本的檢測能為聯(lián)合用藥提供指導(dǎo)。
【附圖說明】
[0071] 下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細(xì)的說明。
[0072] 圖1是本發(fā)明基于樣本標(biāo)記法的雙色熒光檢測原理圖；
[0073] 圖2是本發(fā)明實施例2的抗體芯片結(jié)果掃描圖像；
[0074] 圖3是本發(fā)明實施例2的抗體芯片結(jié)果運用免疫印跡法驗證的灰度圖。
【具體實施方式】
[0075] 下列實施例中，未注明具體條件的實驗方法，通常按常規(guī)條件，如《精編分子生物 學(xué)實驗指南》（F.M.奧斯伯，R.E.金斯頓，J.G.塞德曼等主編，馬學(xué)軍，舒躍龍等譯校。北 京：科學(xué)出版社，2004)中所述的方法進行。
[0076] 實施例1抗體芯片的制備
[0077] 1.免疫印跡實驗：對藥物靶點各自對應(yīng)的候選抗體進行特異性和效價鑒定，篩選 高質(zhì)量的抗體；
[0078] 2?純化抗體：通過proteinA/G柱子以及透析純化抗體，超濾調(diào)整抗體濃度為2mg/ mL，5iiL 分裝，-20°C保存；
[0079] 3.準(zhǔn)備點樣板：5 ii L抗體中加入5 ii L 2 X點樣緩沖液，吸入點樣板，避免產(chǎn)生氣 泡；同樣，10 U L陽性對照（包括0. 25mg熒光基團標(biāo)記蛋白、0. 75mg BSA以及1 X點樣緩沖 液）以及10 U L陰性對照（包括5 ii L2X點樣緩沖液與5 ii L PBS)也吸入點樣板；漩渦器 混勻，1，〇〇〇Xg2min離心，4°C保存；
[0080] 4.點樣：按照芯片點樣儀操作要求，做好點樣前準(zhǔn)備，包括洗液、濕度、溫度、點樣 針、基片以及點樣板等，點樣后基片在50%的濕度下暫放至少2個小時后轉(zhuǎn)入4°C過夜保 存。
[0081] 實施例2應(yīng)用抗體芯片對臨床樣本的檢測
[0082] -、蛋白質(zhì)提取
[0083] 腫瘤患者手術(shù)切除樣本，進行石蠟切片制作，蘇木精-伊紅染色 (hematoxylin-eosin staining, HE染色），通過病理專家的判讀，分離癌旁組織部分與腫瘤 組織部分，利用組織裂解液與勻漿器分別提取其總蛋白。
[0084] 二、生物素標(biāo)記
[0085] 1?每 lmg 生物素加入 100 u L DMF (N，N-Dimethylformamide)，終濃度為 10 u g/ U L，標(biāo)記為 Biotin/DMF ;
[0086] 2.每個樣本各取100 ii g蛋白樣品進行標(biāo)記，分兩管，每管50 ii g蛋白樣品中加入 3 ii LBiotin/DMF進行標(biāo)記，終體積為70 ii L ;
[0087] 3?混合均勻，室溫下震蕩反應(yīng)2h ;
[0088] 4.加入30 ii L終止液，室溫下震蕩反應(yīng)30min ;
[0089] 進入下一步的芯片檢測或?qū)悠穬Υ嬖赺80°C。
[0090] 三、芯片檢測
[0091] A?封閉
[0092] 1.將上述點制的抗體芯片從冰箱取出，室溫平衡45min ;
[0093] 2.在100 X 15mm培養(yǎng)皿中加入30mL封閉溶液，將芯片完全浸沒。確保芯片表面向 上，將培養(yǎng)皿放到搖床上，室溫55rpm封閉lh ;
[0094] 3?使用Milli-Q水按照下面步驟洗滌：
[0095] a)將芯片放入50mL圓形離心管，加入45mL Milli-Q水，旋緊蓋子；
[0096] b)用手上下顛倒震搖管子10s，倒掉Milli-Q水；
[0097] c)離心管中換入新的Milli-Q水，震搖管子10s，倒掉Milli-Q水；
[0098] d)重復(fù) 10 次；
[0099] 4.甩掉芯片表面多余的Milli-Q水，馬上進入下一步反應(yīng)。
[0100] B.雜交
[0101] 1.在一個試管中，加入6mL雜交緩沖液，再加入生物素標(biāo)記的蛋白（50 i! g)，混合 均勻。標(biāo)記為 Protein Coupling Mix ;
[0102] 2.將芯片放入干凈的培養(yǎng)皿，芯片表面向上，緩慢的將6mL Protein Coupling Mix加到芯片表面，將芯片完全浸沒，蓋上Coupling Chamber,室溫35rpm孵育2h ;
[0103] 3.將芯片移到一個盛有30mL lXWash Solution的100X15mm培養(yǎng)皿中，室溫 55rpm洗10min，倒掉洗液，重復(fù)此步驟三次；
[0104] 4.使用Milli-Q水按照下面步驟洗滌：
[0105] a)將芯片放入50mL圓形離心管，加入45mL Milli-Q水，旋緊蓋子；
[0106] b)用手上下顛倒震搖管子10s，倒掉Milli-Q水；
[0107] c)離心管中換入新的Milli-Q水，震搖管子10s，倒掉Milli-Q水；
[0108] d)重復(fù) 10 次；
[0109] 5.甩掉芯片表面多余的Milli-Q水，馬上進入下一步反應(yīng)。
[0110] C?檢測
[0111] 1?向 60mL Detection Buffer 中加入 60 u L Cy3_Streptavidin (0? 5mg/mL);
[0112] 2?在一個 100 X 15mm 培養(yǎng)皿中加入 30mL 上述 Cy3_Streptavidn Solution ;
[0113] 將芯片浸沒入Cy3_Streptavidin solution。室溫避光，搖床上55rpm反應(yīng)20min ;
[0114] 3.將芯片移入一個新的盛有30mL IX Wash Solution的100 X 15mm培養(yǎng)皿中；室 溫?fù)u床上55rpm洗10min。重復(fù)此步驟三次；
[0115] 4?使用Milli-Q水按照下面步驟洗滌：
[0116] a)將芯片放入50mL圓形離心管，加入45mL Milli-Q水，旋緊蓋子；
[0117] b)用手上下顛倒震搖管子10s，倒掉Milli-Q水；
[0118] c)離心管中換入新的Milli-Q水，震搖管子10s，倒掉Milli-Q水；
[0119] d)重復(fù) 10 次；
[0120] 5.將芯片置于芯片小型離心機中，離心2min甩干；
[0121] 6.避光，GenePix 4000B掃描儀于532nm處掃描芯片（圖2)。
[0122] 四、數(shù)據(jù)分析
[0123] 使用GenePix Pro軟件讀取原始數(shù)據(jù)，通過掃描獲得的圖像發(fā)現(xiàn)芯片上有多種 抗體檢測到熒光信號，代表該樣品中含有這些抗體對應(yīng)的蛋白質(zhì)，熒光信號的強弱反應(yīng)了 蛋白質(zhì)的含量。本次實驗通過對腫瘤病人手術(shù)切除樣本中癌與癌旁芯片數(shù)據(jù)的比較，發(fā)現(xiàn) EGFR、ALK等蛋白磷酸化水平增強，提示不僅需要使用針對EGFR的抗腫瘤藥物，還需要使用 針對ALK的抗腫瘤藥物，達到有針對性的聯(lián)合治療的目的。
[0124] 五、免疫印跡法結(jié)果驗證
[0125] 利用提取的癌旁組織部分與腫瘤組織部分蛋白樣本進行免疫印跡實驗（圖3)。結(jié) 果證實了不僅EGFR(Y869)的磷酸化水平增強，而且ALK(Y1604)的磷酸化水平也增強。同 時，下游信號通路蛋白JAK1 (Y1022)、Aktl (S473)以及MEK2 (T394)的磷酸化水平同樣增強。
[0126] 以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能 因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說， 在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范 圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【主權(quán)項】
1. 兩種用于酪氨酸激酶抑制劑類抗腫瘤藥物相關(guān)靶點蛋白活性檢測的抗體芯片，其特 征在于，所述抗體芯片包括基于基片的固相抗體芯片以及基于微珠的液態(tài)懸浮芯片。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體芯片，其特征在于，所述基片包括：醛基、環(huán)氧樹脂、聚糖 或其他高分子修飾的玻片式或膜式基片。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體芯片，其特征在于，所述抗體芯片包括的檢測指標(biāo)涵蓋 了目前已上市的酪氨酸激酶抑制劑類抗腫瘤藥物的相關(guān)靶點，即46種藥物相關(guān)靶點蛋白 的表達水平和（或）修飾水平。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗體芯片，其特征在于，所述46種藥物相關(guān)靶點蛋白包含： Bcr-AbI、ABLI、ABL2、ALK、BTK、CSFIR、DDRI、DDR2、EGFR、EPHA2、ERBB2、ERBB3、ERBB4、FGFR1、 FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLTI、FLT3、FLT4、FRK、FYN、HCK、ITK、JAKI、JAK2、JAK3、KDR、KIT、LCK、 LYN、MET、NTRKl、PDGFRA、PDGFRB、PTK6、RET、SRC、TEK、YESl、BRAF、RAFl、MAPKl I、MAP2K1、 MAP2K2、MAP3K2〇5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗體芯片，其特征在于，所述抗體芯片上固著的抗體包含：檢 測藥物相關(guān)靶點蛋白表達水平和（或）各位點磷酸化修飾水平的單克隆抗體和（或）多克 隆抗體。6. -種基于樣本標(biāo)記法的單色熒光進行檢測的方法，其特征在于，包括以下步驟： 將樣本進行生物素標(biāo)記； 用權(quán)利要求1所述的抗體芯片，對標(biāo)記的樣本進行檢測； 再用熒光標(biāo)記的（鏈霉）親和素進行檢測； 根據(jù)檢測到熒光信號的抗體，確定待測樣品中的藥物相關(guān)靶點蛋白的表達水平和 (或）修飾水平。7. -種基于樣本標(biāo)記法的雙色熒光進行檢測的方法，其特征在于，包括以下步驟： 將樣本分別進行生物素標(biāo)記； 不同熒光標(biāo)記的（鏈霉）親和素與各自生物素標(biāo)記樣本孵育； 用權(quán)利要求1所述的抗體芯片，對等份標(biāo)記樣本的混合物進行檢測； 根據(jù)檢測到熒光信號的抗體，確定待測樣品中的藥物相關(guān)靶點蛋白的表達水平和 (或）修飾水平的調(diào)變情況。8. -種采用雙抗夾心法進行檢測的方法，其特征在于，包括以下步驟： 用權(quán)利要求1所述的抗體芯片，對樣本進行檢測； 加入生物素標(biāo)記的檢測抗體混合物； 再用熒光標(biāo)記的（鏈霉）親和素進行檢測； 根據(jù)檢測到熒光信號的抗體，確定待測樣品中的藥物相關(guān)靶點蛋白的表達水平和 (或）修飾水平。9. 權(quán)利要求1所述抗體芯片的應(yīng)用，其特征在于，用于對腫瘤患者手術(shù)切除樣本進行 檢測，實現(xiàn)個性化有效治療的用藥指導(dǎo)。
【文檔編號】G01N33/50GK105891496SQ201410745581
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年12月9日
【發(fā)明人】宋凱, 程磊, 張慶華
【申請人】上海華盈生物醫(yī)藥科技有限公司