一種乙醛-dna加合物的測定方法
【專利摘要】一種乙醛?DNA加合物的測定方法，即DNA中Ethylidene?dG和Propano?dG的測定方法，包括采用乙醛溶液暴露小牛胸腺DNA并加入精氨酸作為反應(yīng)的催化劑，DNA溶液進(jìn)行酶水解并依次加入穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)、還原劑NaBH3CN和DNA水解酶。水解液經(jīng)Strata?X小柱固相萃取，收集洗脫液并引入LC?MS/MS系統(tǒng)分析，可準(zhǔn)確檢測出Et?dG和Propano?dG的含量水平。本發(fā)明為全新的DNA中乙醛?DNA加合物的測定方法，采用穩(wěn)定同位素作為內(nèi)標(biāo)定量分析物可以減少樣品前處理過程中引起的誤差，串聯(lián)質(zhì)譜法更好的提高了方法的選擇性、準(zhǔn)確性和靈敏度。通過色譜柱以及洗脫條件的選擇與優(yōu)化，較好的提高了色譜分離過程，縮短了色譜分析的時間，減少了有機(jī)溶劑的消耗量。
【專利說明】
一種乙醛-DNA加合物的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域
[00011 本發(fā)明屬于DNA樣本的理化檢驗技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及DNA中N2-亞乙基-鳥嘌呤 (Ethylidene-dG)和1，N2-丙醇-鳥噪呤(Propano-dG)加合物的測定技術(shù)領(lǐng)域，具體說是一 種采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(LC- MS/MS)測定DNA中乙醛-DNA加合物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙醛是一種廣泛存在于環(huán)境基質(zhì)中的污染物。主要產(chǎn)生于有機(jī)物的不完全燃燒， 如工業(yè)生產(chǎn)、卷煙煙氣、機(jī)動車尾氣等?；顫姷娜┗恍枰?jīng)過機(jī)體代謝就能夠直接攻擊生 物體內(nèi)親核基團(tuán)，如核酸中的鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶及胸腺嘧啶形成DNA加合物。乙醛形成 的主要DNA加合物包括N 2-亞乙基-鳥嘌呤（Ethylidene-dG)和1，N2-丙醇-鳥嘌呤(Propano-dG) ， 其中 1 ，N2-丙醇-鳥噪呤(Propano-dG)是由 Ethylidene-dG 與 乙醛進(jìn) 一步反應(yīng)所得，該 過程需要氨基酸的催化。N2-亞乙基-鳥噪呤(Ethylidene-dG)在單核苷酸狀態(tài)下不穩(wěn)定，需 要將其在DNA酶水解階段還原為N 2-乙基-鳥嘌呤(Et-dG)才能被檢出。
[0003] 目前，關(guān)于DNA加合物的分析檢測方法報道的較多，主要有32P-后標(biāo)記技術(shù)、酶聯(lián)免 疫技術(shù)(ELISA)、高效液相色譜法(HPLC-UV)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS/MS)。其中 LC-MS/MS由于其較高的靈敏度和選擇性被廣泛應(yīng)用于DNA加合物的檢測分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的正是基于上述現(xiàn)有技術(shù)狀況而采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS) 技術(shù)建立的乙醛-DNA加合物(Ethylidene-dG和Propano-dG)的測定方法。該方法具有快速、 準(zhǔn)確、靈敏度高等特點，可用于DNA中乙醛-DNA加合物的同時定性定量分析。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的： 一種乙醛-DNA加合物的測定方法，即DNA中E thy 1 i dene-dG和Pr opano-dG的測定方法， 具體步驟如下： a、乙醛暴露小牛胸腺DNA:取400 yg小牛胸腺DNA，加入配制好的乙醛溶液（乙醛溶液用 0.1 M的PBS溶液配制，濃度0.001-1 mM)，對照組加入同等體積的PBS溶液。上述溶液中各加 入8.0 mg的精氨酸，放入37°C恒溫培養(yǎng)箱中24 h;使用2倍體積的冰乙醇沉淀DNA并終止反 應(yīng)，離心去掉上清液，用70%的乙醇水清洗DNA樣品，得到的DNA團(tuán)塊晾干并加入200 yL超純 水復(fù)溶，用NanoDrop 2000超微量分光光度計在260nm處檢測DNA的含量，對于雙鏈DNA-個 吸收單位(0D)相當(dāng)于50 yg/mL。
[0006] b、DNA的酶水解及固相萃取(SPE):將上述DNA溶于500 yL的10 mM Tris-HCl/5 mM MgCl2緩沖液(pH=7)中，加入30 mg的還原劑NaBH3CN，將Ethylidene-dG還原為Et-dG;加入 20 yL混合內(nèi)標(biāo)，加入60U脫氧核糖核酸酶I，在37 °C中孵育2h，隨后加入0.008U磷酸二酯酶I 和3 0 U堿性磷酸酶在3 7 °C中繼續(xù)孵育2 h。水解液經(jīng)1 m L甲醇活化和1 m L超純水平衡的 Strata-X固相萃取小柱，用1 mL超純水和1 mL 10%的甲醇水淋洗，最后用1 mL 50%的甲醇 水洗脫，收集洗脫液即為樣品待測液。此過程的目的是為了使雙鏈DNA酶解成單核苷酸狀 態(tài)，通過固相萃取和氮吹濃縮純化分離并富集所需的DNA加合物。所述混合內(nèi)標(biāo)為100 ng/ mL 的[15N5 ] Et_dG 和[15N5 ] Propano-dG。
[0007] c、標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：用甲醇分別配制不同濃度的Et-dG和Propano-dG標(biāo)準(zhǔn)工作 溶液。
[0008] d、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測定，吸取配制好的不同濃度混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶 液，注入LC-MS/MS系統(tǒng)，得到線性回歸方程，對樣品待測液進(jìn)行測定，測得分析物與內(nèi)標(biāo)峰 面積的比值，代入一元線性回歸方程，求得樣品待測液中分析物的含量。
[0009] 色譜條件：選取Thermo Acclaim? Polar Advantage II C18 色譜柱（4 ? 6 X 150 mm，3 wii)，流動相體系選取甲醇(A)和純水(B)，洗脫條件為等度洗脫:0-15 min:35% A;流 速為0.40 mL/min，進(jìn)樣量為5 yL。
[0010] 質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，多反應(yīng)監(jiān)測正離子掃描方式；噴霧電壓：5500 V， 離子源溫度：550°C，氣簾氣的量為20 psi，霧化氣為70 psi，干燥氣為75 psi，碰撞氣為9 psi，射入電壓：10 V，碰撞能：9 eV，駐留時間：200 ms。監(jiān)測離子對為Et-dG:296.2-180.2 定量離子對，296 ? 2-117 ? 2定性離子對；內(nèi)標(biāo)[15N5]Et-dG為271 ? 2-155 ? 2 ;Propan〇-dG: 338 ? 3-222 ? 1定量離子對，338 ? 3-117 ? 2定性離子對；內(nèi)標(biāo)[15N5]Propan〇-dG為343 ? 2- 227.2。
[0011 ] 分析物及內(nèi)標(biāo)的MRM參數(shù)見表1。整個分析過程由Applied Biosystems Analyst version 1.5.1軟件來控制。
[0012] 表1多反應(yīng)監(jiān)測模式下分析物及其內(nèi)標(biāo)的MRM參數(shù)
*為定量離子 本發(fā)明方法的線性范圍和檢出限： 將系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液注入LC-MS/MS，得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、線性回歸方程以及相關(guān)系數(shù)。 Et-dG和Propano-dG標(biāo)準(zhǔn)曲線的點為0? 02，0 ? 05，0 ? 1，0 ? 2，1 ? 0，1 ? 5和2 ? 0 ng/mL。目標(biāo)物的 線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.9999。利用加標(biāo)稀釋得到方法的定量限和檢出限，目標(biāo)峰十倍 信噪比對應(yīng)的濃度為定量限，三倍信噪比對應(yīng)的濃度為檢出限。分析物的標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量 限和檢出限見表2。
[0013] 表2目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及L0D和L0Q
本發(fā)明方法加標(biāo)回收率和重復(fù)性： 采取小牛胸腺DNA樣本中加標(biāo)的方法獲得方法的加標(biāo)回收率，總共選取了三個添加水 平，每個添加水平重復(fù)測定3次，得到的方法的回收率和重復(fù)性，結(jié)果見表3。目標(biāo)物的回收 率在97.2%-101.6%之間，RSD小于10%，證明方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性結(jié)果較好。
[0014] 表3分析物的加標(biāo)回收率和重復(fù)性
本發(fā)明的方法克服了現(xiàn)有技術(shù)樣品處理方法的不足，針對DNA中乙醛-DNA加合物的色 譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，并對LC-MS/MS的相關(guān)檢測條件進(jìn)行了優(yōu)化。與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明方 法具有如下優(yōu)良效果： ①與傳統(tǒng)的液相色譜方法比較，由于選取了串聯(lián)質(zhì)譜，使得方法的選擇性和靈敏度提 高，更有利于DNA中低含量的乙醛-DNA加合物的測定。
[0015] ②本方法具有操作簡便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高及重復(fù)性好的優(yōu)點。
[0016] ③本發(fā)明方法采用穩(wěn)定同位素作為內(nèi)標(biāo)定量分析物可以減少樣品前處理過程中 引起的誤差，串聯(lián)質(zhì)譜法更好的提高了方法的選擇性與準(zhǔn)確性和靈敏度。通過色譜柱以及 洗脫條件的選擇與優(yōu)化，較好的提高了色譜分離過程，縮短了色譜分析的時間，減少了有機(jī) 溶劑的消耗量。
【附圖說明】
[0017] 圖1乙醛-DNA加合物的總離子流圖。
[0018] 圖2不同乙醛暴露劑量下，小牛胸腺DNA中Et-dG和Propano-dG含量。
【具體實施方式】
[0019] 本發(fā)明以下結(jié)合實例做進(jìn)一步描述，但并不是限制本發(fā)明。
[0020] 一種DNA中乙醛-DNA加合物的測定方法，其測試過程是用乙醛溶液對小牛胸腺DNA 進(jìn)行暴露（精氨酸作為催化劑），對DNA溶液進(jìn)行酶水解并加入還原劑NaBH 3CN、穩(wěn)定同位素 內(nèi)標(biāo)和DNA水解酶。水解液經(jīng)Strata-X小柱固相萃取，收集洗脫液引入LC-MS/MS系統(tǒng)分析。
[0021] 實例 1: 1.儀器與試劑： AB SCIEX三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國加州應(yīng)用生物系統(tǒng)公司），Agilent 1200高效 液相色譜(美國安捷倫公司），NanoDrop 2000超微量分光光度計(美國賽默飛科技公司），恒 溫培養(yǎng)箱(美國賽默飛科技公司），氮氣濃縮干燥儀(瑞典拜泰齊公司），Milli-Q水純化系統(tǒng) (德國默克集團(tuán)），Analyst 1.5.1數(shù)據(jù)采集與處理軟件。
[0022] 脫氧核糖核酸酶I、堿性磷酸酶(美國紐英倫生物技術(shù)公司），磷酸二酯酶I和小牛 胸腺DNA(美國西格瑪公司），甲醇（韓國德山試劑公司），NaBH 3CN(上海阿拉丁試劑公司），甲 醇（韓國德山試劑公司），Strata-X聚合物小柱(33 Mi，30 mg/lmL，廣東菲羅門科學(xué)儀器有 限公司），標(biāo)準(zhǔn)品Et_dG和Propano-dG及其內(nèi)標(biāo)物[15N5 ] Et_dG和[15地]Propano-dG。試劑均為 色譜純。
[0023] 2 ?樣品處理： 乙醛暴露小牛胸腺DNA:取400 yg小牛胸腺DNA，加入1 mL不同濃度的乙醛溶液(0.001， 0.01，0.05，0.1，0.5和1.0 mM)，對照組加入同等體積的PBS溶液，上述溶液中各加入8.0 mg 的精氨酸，放入37°C恒溫培養(yǎng)箱中24 h;使用2倍體積的冰乙醇沉淀DNA并終止反應(yīng)，離心去 掉上清液，用70%的乙醇水清洗DNA樣品，得到的DNA團(tuán)塊晾干并加入200 yL超純水復(fù)溶，用 NanoDrop 2000超微量分光光度計在260 nm處檢測DNA的含量，對于雙鏈DNA-個吸收單位 (0D)相當(dāng)于50 yg/mL。
[0024] DNA的酶水解及固相萃?。⊿PE):將上述DNA溶于500 yL的10 mM Tris-HCl/5 mM MgCl2緩沖液(pH=7)中，依次加入30 mg NaBH3CN、20 yL混合內(nèi)標(biāo)和60U脫氧核糖核酸酶I，在 37°C中孵育2h，隨后加入0.008U磷酸二酯酶I和30U堿性磷酸酶在37°C中繼續(xù)孵育2h。水解 液經(jīng)Strata-X固相萃取，收集洗脫液作為待測液。所述混合內(nèi)標(biāo)為100 ng/mL的[15N5]Et-dG 和[15N5 ] Propano-dG 〇
[0025] 3.測定方法： 吸取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液和前處理之后的小牛胸腺DNA樣品各5 yL，注入LC-MS/MS系 統(tǒng)進(jìn)行分離分析，測得樣本中乙醛-DNA加合物的含量。
[0026]實例2 :如實施例1所述，利用本研究建立的方法對不同濃度乙醛（0.001，0.01， 0.05，0.1，0.5和1.0 mM)暴露的小牛胸腺DNA中乙醛-DNA加合物進(jìn)行了檢測(每個樣本平行 檢測三次）。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和峰面積得出各個樣品中DNA加合物的濃度，根據(jù)公式
計算獲得各個樣品中DNA加合物相對于核苷酸的含量，結(jié)果乘以108換算成DNA加合物 個數(shù)/1〇8個核苷酸。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示Et-dG和Propano-dG的量與乙醛暴露劑量成效應(yīng)關(guān)系 (SPSS，P<0.003,圖 2)。
【主權(quán)項】
1. 一種乙醛-DNA加合物的測定方法，即N2-亞乙基-鳥嘌呤（Ethylidene-dG)、l，N2-丙 醇-鳥噪呤(Propano-dG)的測定方法，其特征在于:包括以下具體步驟： a、 乙醛暴露小牛胸腺DNA:取400 yg小牛胸腺DNA，加入配制好的乙醛溶液，對照組加入 同等體積的PBS溶液，上述溶液中各加入8.0 mg的精氨酸，放入37 °C恒溫培養(yǎng)箱中24 h;使 用2倍體積的冰乙醇沉淀DNA并終止反應(yīng)，離心去掉上清液，用70%的乙醇水溶液清洗DNA樣 品，得到的DNA團(tuán)塊晾干并加入200 yL超純水復(fù)溶，用NanoDrop 2000超微量分光光度計在 260nm處檢測DNA的含量，對于雙鏈DNA-個吸收單位(OD)相當(dāng)于50 yg/mL; b、 DNA的酶水解及固相萃?。⊿PE):將上述DNA溶于500 yL的10 mM Tris-HCl/5 mM MgCh緩沖液中，加入30 mg的還原劑NaBIfeCN，將N2-亞乙基-鳥噪呤(Ethylidene-dG)還原 成N2-乙基-鳥嘌呤(Et-dG)來檢測，加入20 yL混合內(nèi)標(biāo)，加入60U脫氧核糖核酸酶I，在37°C 中孵育2h，隨后加入0.008U磷酸二酯酶I和30U堿性磷酸酶在37 °C中繼續(xù)孵育2h，水解液經(jīng)1 mL甲醇活化和I mL超純水平衡的Strata-X固相萃取小柱，用I mL超純水和I mL 10%的甲醇 水淋洗，最后用I mL 50%的甲醇水洗脫，收集洗脫液即為樣品待測液； c、 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：用甲醇配制不同濃度的N2-乙基-鳥嘌呤(Et-dG)、l，N2-丙醇-鳥 噪呤(Propano-dG)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液； d、 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測定，吸取配制好的不同濃度混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，注 入LC-MS/MS系統(tǒng)，得到線性回歸方程，對樣品待測液進(jìn)行測定，測得分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積的 比值，代入一元線性回歸方程，求得樣品待測液中分析物的含量。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙醛-DNA加合物的測定方法，其特征在于：步驟a中的乙醛溶 液用0.1 M的PBS溶液配制，濃度0.00-1 mM。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙醛-DNA加合物的測定方法，其特征在于：步驟b中所述混合 內(nèi)標(biāo)為 100 ng/mL的[15Νδ ] Et-dG和[15Νδ ] Propano-dG。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙醛-DNA加合物的測定方法，其特征在于：步驟d中選取了 Thermo Acclaim? Polar Advantage II C18 色譜柱，規(guī)格4.6X150 mm，3 μπι，流動相體系 選取甲醇A和純水溶液B，等度洗脫，分析時間為15 min，進(jìn)樣量為5 yL。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的乙醛-DNA加合物的測定方法，其特征在于：等度洗脫條件為： 0-15 min:35% A;流速為0.40 mL/min。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙醛-DNA加合物的測定方法，其特征在于：步驟d中串聯(lián)質(zhì)譜 檢測器的條件：電噴霧離子源(ESI)，多反應(yīng)監(jiān)測正離子掃描方式;噴霧電壓:5500 V，離子 源溫度：550°C，氣簾氣的量為20 psi，霧化氣為70 psi，干燥氣為75 psi，碰撞氣為9 psi， 射入電壓：1〇 V，碰撞能:9 eV，駐留時間：200 ms;監(jiān)測離子對為Et-dG:296.2-180.2定量 離子對，296 · 2- 117 · 2定性離子對；內(nèi)標(biāo)[15N5 ]Et-dG為271 · 2- 155 · 2; Propano-dG: 338 · 3- 222 · 1定量離子對，338 · 3-117 · 2定性離子對；內(nèi)標(biāo)[15N5]Propan〇-dG為343 · 2-227 · 2〇
【文檔編號】G01N30/02GK105911163SQ201610226317
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月13日
【發(fā)明人】陳歡, 侯宏衛(wèi), 胡清源, 劉魯娟, 朱貝貝, 陳建, 王紅娟
【申請人】國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心