一種固相萃取-液質串聯(lián)檢測國公酒中的桔霉素的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種固相萃取?液質串聯(lián)檢測國公酒中的桔霉素的方法，旨在提供一種靈敏度高，定性定量準確的固相萃取?液質串聯(lián)檢測國公酒中的桔霉素的方法；該方法依次包括下述步驟：1)標準溶液的制備2)樣品前處理；3)樣品凈化；將上述樣品前處理液，以1ml/min流速通過HLB固相萃取柱，用5ml水淋洗，棄去，再用5ml甲醇洗脫收集洗脫液，洗脫液于40℃下氮吹至近干，精密加入1ml甲醇溶解，用0.22μm有機濾膜過濾，即得待測樣品上色譜柱檢測；屬于化學檢測技術領域。
【專利說明】
一種固相萃取-液質串聯(lián)檢測國公酒中的桔霉素的方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明提供一種桔霉素的檢測方法，具體的說是一種固相萃取-液質串聯(lián)檢測國 公酒中的桔霉素的方法;屬于化學檢測技術領域。
【背景技術】
[0002] 桔霉素(citrinin)是1931年首次從青霉菌Penicillium citrinum中分離得到。其 分子式為C13H14O5，分子量為250.25。桔霉素有一定的腎毒性和肝毒性，能致畸、引發(fā)腫瘤及 誘發(fā)突變。而紅曲是中國傳統(tǒng)藥材，是用特有的紅曲霉菌在大米中培養(yǎng)發(fā)酵而成。因某些紅 曲霉菌株能產(chǎn)生具有抑制膽固醇生物合成的他汀類物質，因而中藥紅曲被開發(fā)為降血脂的 藥品和保健食品。在1995年法國學者Blanc等首次發(fā)現(xiàn)了紅曲產(chǎn)品中含有桔霉素后，國外已 將桔霉素作為食品污染的嚴格控制指標。而在中國，中國藥典尚未將桔霉素作為含紅曲中 成藥的控制指標。
[0003] 對于藥品一一血脂康膠囊有文獻記載用RP-HPLC法測定其桔霉素含量，而在食品、 保健食品中也有桔霉素的檢測方法:薄層層析法、熒光分光光度法、高效液相色譜法等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對上述不足，本發(fā)明的目的是提供一種靈敏度高，定性定量準確的固相萃取-液 質串聯(lián)檢測國公酒中的桔霉素的方法。
[0005] 為解決上述技術問題，本發(fā)明提供的技術方案如下：
[0006] -種固相萃取-液質串聯(lián)檢測國公酒中的桔霉素的方法，依次包括下述步驟：
[0007] 1)標準溶液的制備
[0008] 標準儲備液:精密稱取標準物質10mg，置10ml容量瓶中，加甲醇溶解并至刻度，使 成濃度為lmg/ml;
[0009] 標準稀釋液:精密吸取標準溶液0.2ml，置100ml的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度， 使成濃度為2μg/mll;
[0010] 標準工作曲線：取標準稀釋液液適量加甲醇，分別配制成濃度為0.01、2、5、10、 20ng/ml標準工作液；
[0011] 2)樣品前處理
[0012]精密量取樣品0.5ml，置25ml容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻后過濾，待用；
[0013] 3)樣品凈化
[0014] 將上述樣品前處理液，以lml/min流速通過HLB固相萃取柱，用5ml水淋洗，棄去，再 用5ml甲醇洗脫收集洗脫液，洗脫液于40°C下氮吹至近干，精密加入lml甲醇溶解，用0.22mi 有機濾膜過濾，即得待測樣品；
[0015] 4)液相色譜與質譜條件
[0016]色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus柱2? 1 X50mm，1 ? 8_;流動相A為0? 1 % 甲 酸，流動相B為乙腈，采用梯度洗脫程序如下：0-4.0min，A、70-10 %，B、30-90 % ; 4.0- 5.5min，A、10%，B、90% ;5.5.-5.6min，A、70%，B、30% ;流速0.3ml/min;柱溫40°C;進樣量2 yl;電噴霧源ESI，正離子方式，選擇多反應監(jiān)測MRM，載氣溫度：150°C，載氣流量：15L/min， 霧化器壓力40psi，鞘氣溫度350 °C，鞘氣流量：12L/min，毛細管電壓3500V，定性定量離子： 母離子m/z = 251.2，子離子m/z233.2和m/z205.2，碰撞能量分別為5V和20V，F(xiàn)rag均為380V。
[0017] 進一步的，上述的一種固相萃取-液質串聯(lián)檢測國公酒中的桔霉素的方法，所述的 色譜儀采用Agilentl290-6490三重四級桿液相質譜聯(lián)用儀。
[0018] 進一步的，上述的一種固相萃取-液質串聯(lián)檢測國公酒中的桔霉素的方法，所述的 HLB固相萃取柱使用前分別以3ml甲醇和3ml水活化。
[0019] 本文采用固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測中成藥中的桔霉素，為中成藥檢測 桔霉素提供一種具凈化效率高、分辨率高、噪聲低、靈敏度高，定性定量準確、可靠等特點的 參考方法。
【附圖說明】
[0020]圖1是2lig/ml桔霉素標準溶液多反應監(jiān)測圖。
[0021]圖2是空白樣品的多反應監(jiān)測圖。
【具體實施方式】
[0022]下面結合【具體實施方式】，對本發(fā)明的權利要求做進一步的詳細說明，但不構成對 本發(fā)明的任何限制，任何在本發(fā)明權利要求保護范圍所做的有限次的修改，仍在本發(fā)明的 權利要求保護范圍之內(nèi)。
[0023] 實施例1
[0024] 1 材料
[0025] 1.1儀器
[0026] Agilentl290-6490三重四級桿液相質譜聯(lián)用儀（美國Agilent)、HLB-SPE柱（60mg/ 3ml，上海安譜科學儀器有限公司）、Agilent ZORBAX Eclipse Plus(2.1X50mm，1.8wn;美 國Agi 1 ent)、XA20OTU電子天平(德國梅特勒托利多公司）、超聲波清洗器。
[0027] 1.2藥品與試劑
[0028]國公酒4批，均來源于市場銷售樣品。桔霉素(批號：518-75-2-150403,標準品購于 Pribolab，純度>98%)，甲醇和乙腈均為色譜純，其它試劑均為分析純;本發(fā)明所涉及到的 百分濃度，沒有特別說明的，液體均為體積濃度，溶質為固體的指質量濃度實驗用水為經(jīng) ELGA PURELAB ClassicUVF凈化系統(tǒng)過濾的去離子水。
[0029] 2方法與結果
[0030] 2.1標準溶液的制備
[0031] 2.1.1標準儲備液:精密稱取標準物質10mg，置10ml容量瓶中，加甲醇溶解并至刻 度，使成濃度為lmg/ml。
[0032] 2.1.2標準稀釋液:精密吸取標準溶液0.2ml，置100ml的容量瓶中，加甲醇稀釋至 刻度，使成濃度為2μg/ml，檢測結果見見圖1。
[0033] 2.1.3標準工作曲線：取標準稀釋液液適量加甲醇，分別配制成濃度為0.01、2、5、 10、20ng/ml標準工作液。
[0034] 2.2樣品前處理
[0035] 精密量取樣品0.5ml，置25ml容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻后過濾，待用。
[0036] 2.3樣品凈化
[0037]將上述樣品前處理液，以約lml/min流速通過HLB固相萃取柱(使用前分別以3ml甲 醇和3ml水活化），用5ml水淋洗，棄去，再用5ml甲醇洗脫收集洗脫液，洗脫液于40°C下氮吹 至近干，精密加入lml甲醇溶解，用0.22mi有機濾膜過濾，即得待測樣品。
[0038] 2.4液相色譜與質譜條件
[0039] 色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus柱（2 ? 1 X 50mm，1 ? 8_);流動相A為0 ? 1 % 甲酸，流動相B為乙腈，采用梯度洗脫程序，見表1。流速0.3ml/min;柱溫40°C ;進樣量2yl;電 噴霧源(ESI)，正離子方式，選擇多反應監(jiān)測(MRM)，載氣溫度：150°C，載氣流量：15L/min，霧 化器壓力40psi，鞘氣溫度350°C，鞘氣流量：12L/min，毛細管電壓3500V，定性定量離子:母 離子m/z = 251.2(M+1)，子離子m/z233.2和m/z 205.2，碰撞能量分別為5V和20V，F(xiàn)rag均為 380V〇
[0040] 表1梯度洗脫程序
[0041] Tab 1Gradient elution program
[0043] 2.5實際樣品的測定
[0044] 在本試驗中，以定量離子峰面積代入標準系列的回歸方程計算，結果國公酒4批， 均未檢出桔霉素。
[0045] 2.4方法的準確度
[0046] 在經(jīng)測定不含有桔霉素的二種基質的空白樣品中進行加標回收率試驗，加標濃度 為5ng/ml。平行測定6次，得到的平均加標回收率液體制劑范圍為90%~100%，參見圖2。 [0047]本發(fā)明提供的技術方案用水(含0.1%甲酸)+乙腈= 70+30作流動相，流速0.3ml/ min，桔霉素的色譜峰對稱，采用串聯(lián)質譜檢測器進行檢測，由于串聯(lián)質譜具有在分離、高分 辨能力和靈敏度高的特性，配合多反應監(jiān)測模式(MRM)及母離子和兩個相應的子離子進行 監(jiān)測，達到了準確的定性和定量的目的，簡化了對流動相選擇的步驟，所以本方法選用了上 述流動相及其比例。
[0048]為了解本方法采用HLB固相萃取柱對樣品中的桔霉素進行凈化后，在測定時對質 譜檢測的基質干擾情況，選擇一個未檢出桔霉素的樣品按方法進行萃取作基質液，并加入 標準系列，同時對外標標準系列進行質譜測定，根據(jù)保留時間對應的定量離子峰面積與其 濃度進行回歸分析，得基質液加標準系列的回歸方程為Y = 3 298.522531X+4 528.423 351，r = 0.999 4,與外標回歸方程Y = 3 329.186799X+4 586.551 631(r = 0.999 4)進行比 較，兩者無實質性差異，表明HLB固相萃取柱對樣品基質有明顯凈化作用。
[0049]本文建立了含紅曲藥品的桔霉素液相色譜-串聯(lián)質譜測定，本方法在6min內(nèi)完成 了對該物質的分析測定，在保證定性定量準確的情況下，實現(xiàn)了高靈敏的分析，并在提取過 程中減少了甲苯等有毒試劑的使用，具有高效、環(huán)保等特點，可為藥品中的桔霉素監(jiān)測提供 技術支撐。
【主權項】
1. 一種固相萃取-液質串聯(lián)檢測國公酒中的桔霉素的方法，其特征在于，依次包括下述 步驟： 1) 標準溶液的制備 標準儲備液:精密稱取標準物質IOmg，置IOml容量瓶中，加甲醇溶解并至刻度，使成濃 度為lmg/ml; 標準稀釋液:精密吸取標準溶液〇.2ml，置100mL的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，使成 濃度為2μg/mll; 標準工作曲線：取標準稀釋液液適量加甲醇，分別配制成濃度為0.01、2、5、10、20ng/ml 標準工作液； 2) 樣品前處理 精密量取樣品〇. 5ml，置25ml容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻后過濾，待用； 3) 樣品凈化 將上述樣品前處理液，以lml/min流速通過HLB固相萃取柱，用5ml水淋洗，棄去，再用 5ml甲醇洗脫收集洗脫液，洗脫液于40 °C下氮吹至近干，精密加入1ml甲醇溶解，用0.22μπι有 機濾膜過濾，即得待測樣品； 4) 液相色譜與質譜條件 色譜柱:Agilent ZORBAX Eclipse Plus柱2.1X50mm，1.8ym;流動相A為0.1% 甲酸，流 動相B為乙腈，采用梯度洗脫程序如下：0-4.0min，A、70-10%，B、30-90% ;4.0-5.5min，A、 10%，8、90%;5.5.-5.611^114、70%，8、30%;流速0.31111/1^11 ;柱溫40°(：;進樣量2以1;電噴霧 源ESI，正離子方式，選擇多反應監(jiān)測MRM，載氣溫度：150 °C，載氣流量：15L/min，霧化器壓力 40psi，鞘氣溫度350°C，鞘氣流量：12L/min，毛細管電壓3500V，定性定量離子:母離子m/z = 251.2，子離子m/z233.2和m/z205.2，碰撞能量分別為5V和20V，F(xiàn)rag均為380V。2. 根據(jù)權利要求1所述的一種固相萃取-液質串聯(lián)檢測國公酒中的桔霉素的方法，其特 征在于，所述的色譜儀采用Agilentl290-6490三重四級桿液相質譜聯(lián)用儀。3. 根據(jù)權利要求1所述的一種固相萃取-液質串聯(lián)檢測國公酒中的桔霉素的方法，其特 征在于，所述的HLB固相萃取柱使用前分別以3ml甲醇和3ml水活化。
【文檔編號】G01N30/02GK105911180SQ201610235251
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月15日
【發(fā)明人】陳學松, 羅達龍, 王 華
【申請人】廣西壯族自治區(qū)梧州食品藥品檢驗所