腹膜后起源的小兒神經(jīng)母細(xì)胞瘤ctc檢測試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了腹膜后起源的小兒神經(jīng)母細(xì)胞瘤CTC檢測試劑盒及檢測方法。具體的，本發(fā)明提供了一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測試劑盒，所述試劑盒含有如下組分：(i)紅細(xì)胞與白細(xì)胞聯(lián)合抗體；(ii)白細(xì)胞表面共同抗原抗體；(iii)細(xì)胞核熒光染料；和(iv)染色體FISH探針。采用用本發(fā)明的檢測試劑盒和方法可以在只需采集少量的血(如2ml或更少)的情況下，精確、快速檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞，從而診斷腹膜后起源的神經(jīng)母細(xì)胞瘤的患病風(fēng)險。
【專利說明】
腹膜后起源的小兒神經(jīng)母細(xì)胞瘤CTC檢測試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及細(xì)胞檢測領(lǐng)域;具體地，涉及一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測試劑盒及其檢測 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 小兒腫瘤是威脅兒童健康的重要問題，目前已成為了繼外傷之后導(dǎo)致兒童死亡的 第二大原因。其中，神經(jīng)母細(xì)胞瘤是小兒最常見的腹部惡性腫瘤，占所有兒童腫瘤的8~ 10 %，占嬰兒總癌癥發(fā)病率的28 %，為嬰兒階段發(fā)病率最高的惡性腫瘤，位居迄今為止治療 最為棘手的小兒常見惡性實體腫瘤之首。
[0003] 神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma，NB)是源于節(jié)后交感神經(jīng)系統(tǒng)的胚胎性惡性腫瘤， 主要起源于腎上腺，但也可起源于腎上腺外頸、縱膈、椎旁等交感神經(jīng)鏈分布的任何部位， 如腹膜后、胸部、頸部等，其發(fā)病率僅低于白血病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤。在臨床上，神經(jīng)母細(xì) 胞瘤往往包繞重要結(jié)構(gòu)臟器，完整切除率僅為70 %，盡管采用手術(shù)、化療、放療和生物治療 等綜合性措施，卻始終不能根除其定植于體內(nèi)的微小殘留灶，從而導(dǎo)致治療停止后的復(fù)發(fā) 和再次轉(zhuǎn)移。歐美國家的數(shù)據(jù)表明，高危組的神經(jīng)母細(xì)胞瘤(腫瘤包繞重要結(jié)構(gòu)臟器，無法 完整切除，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，N-myc基因擴(kuò)增和病理類型為預(yù)后不良型的腫瘤生物學(xué)類型）的5年 總體生存率僅為30-40%，而在國內(nèi)僅為20-30%。其所處情況之嚴(yán)峻使得對該腫瘤的診斷 及治療研究一直是醫(yī)學(xué)界研究的熱點和難點。
[0004] 神經(jīng)母細(xì)胞瘤具有惡性程度高、發(fā)生部位廣、疾病進(jìn)展迅速、易發(fā)生早期骨髓、骨 和肝、腦、肺等其他臟器轉(zhuǎn)移的特點，且疾病早期多無特異性全身癥狀，因此大多數(shù)患兒(大 于50%)確診時疾病已進(jìn)展至中、晚期，預(yù)后較差，長期存活率低。另外，該腫瘤起病隱匿，與 Ewing肉瘤、原發(fā)性神經(jīng)外胚層腫瘤等小圓細(xì)胞腫瘤起源相似，病理形態(tài)相似，難以鑒別。加 之小兒查體時配合性較差，且不能完整準(zhǔn)確地描述癥狀等也給疾病的確診帶來困難，導(dǎo)致 了一定程度的誤診、漏診。
[0005] 現(xiàn)有研究結(jié)果顯示，以腹部包塊為首發(fā)的患兒，如能對疾病早發(fā)現(xiàn)、早分期，即使 分期較差的患兒也不發(fā)生骨髓轉(zhuǎn)移，治療效果堪好。由此可見，在現(xiàn)有的治療水平基礎(chǔ)上， 尋找早期或超早期的診斷方法是何其重要，這無疑具有重大的臨床和社會意義。
[0006] 目前，神經(jīng)母細(xì)胞瘤的確診，主要借助手術(shù)中取得腫瘤組織，進(jìn)行病理學(xué)檢查，這 一方法通常需要在全麻下進(jìn)行，麻醉和手術(shù)具有巨大的風(fēng)險，嚴(yán)重者導(dǎo)致患兒在術(shù)中術(shù)后 死亡;而且，開放手術(shù)破壞了腫瘤包膜的完整性，又會進(jìn)一步增加腫瘤的侵襲力和轉(zhuǎn)移，結(jié) 果往往是得不償失。
[0007] CTC(循環(huán)腫瘤細(xì)胞)是指自發(fā)或診療操作時而進(jìn)入外周血的腫瘤細(xì)胞。具有高度 活力和高度轉(zhuǎn)移潛能的CTC可以在循環(huán)系統(tǒng)中存活，并在合適的環(huán)境中增殖，導(dǎo)致腫瘤的復(fù) 發(fā)和轉(zhuǎn)移。對CTC的監(jiān)測能夠為腫瘤的臨床進(jìn)展、療效判斷和預(yù)后評估等提供極具價值的科 學(xué)依據(jù)。
[0008] 現(xiàn)有的CTC檢測方法通常由富集和鑒定兩部分組成，其中富集是CTC檢測的難點， 也是CTC分子特征檢測和CTC計數(shù)的關(guān)鍵。常用的檢測方法如過濾法、免疫磁珠分離法、CTC 芯片等需要的樣本采集量比較大，操作過程復(fù)雜，檢測費用也比較高。
[0009] 此外，目前的標(biāo)準(zhǔn)或常規(guī)方法需要采集約7.5ml或更多的血液，而兒童尤其是嬰幼 兒采血相對比較困難，也不宜大量采血，這無疑是對患兒及其家庭經(jīng)濟(jì)狀況都提出了巨大 的挑戰(zhàn)。
[0010] 因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種微創(chuàng)，采血量少，檢測簡單快速且能實現(xiàn)早期診循 環(huán)腫瘤細(xì)胞(如腹膜后起源的神經(jīng)母細(xì)胞瘤)的檢測試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的是提供一種微創(chuàng)，采血量少，檢測簡單快速且能實現(xiàn)早期診循環(huán)腫 瘤細(xì)胞(如腹膜后起源的神經(jīng)母細(xì)胞瘤)的檢測試劑盒。
[0012] 本發(fā)明第一方面提供了一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測試劑盒，所述試劑盒含有如下組 分：
[0013] (i)紅細(xì)胞與白細(xì)胞聯(lián)合抗體；
[0014] (ii)白細(xì)胞表面共同抗原抗體；
[0015] (iii)細(xì)胞核熒光染料;和
[0016] (iv)染色體FISH探針。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，各組分分別位于不同容器中。
[0018]在另一優(yōu)選例中，所述白細(xì)胞表面共同抗原抗體包括⑶45抗體。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述細(xì)胞核熒光染料包括DAPI染料。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述染色體FISH探針包括針對染色體著絲粒的FISH探針。
[0021 ] 在另一優(yōu)選例中，所述染色體FISH探針包括針對8號染色體的FISH探針。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述染色體FISH探針包括CEP8。
[0023]在另一優(yōu)選例中，所述白細(xì)胞表面共同抗原抗體包括帶有可檢測標(biāo)記或不帶有檢 測標(biāo)記的紅細(xì)胞與白細(xì)胞聯(lián)合抗體。
[0024]在另一優(yōu)選例中，所述染色體FISH探針包括帶有可檢測標(biāo)記或不帶有可檢測標(biāo)記 的染色體FISH探針。
[0025]在另一優(yōu)選例中，所述可檢測標(biāo)記選自下組:生色團(tuán)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、熒光團(tuán)、同位 素或酶。
[0026]在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還包括用于采集血樣的采樣容器，采樣體積< 4ml， 較佳地，< 3ml，更佳地，< 2.5ml。
[0027]在另一優(yōu)選例中，所述采樣體積2 1。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還包括一種或種額外的檢測相關(guān)試劑，所述檢測相 關(guān)試劑選自下組:分離介質(zhì)、CTC細(xì)胞洗滌緩沖液、紅細(xì)胞裂解液、細(xì)胞固定液、通透處理劑、 洗滌緩沖液母液(SSC)、NP-40、抗體稀釋液、或其組合。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述檢測相關(guān)試劑可以為濃縮形式、原液形式或經(jīng)稀釋可直接 使用的形式。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述通透處理劑包括胃蛋白酶和/或甲醛。
[0031] 在另一優(yōu)選例中，所述抗體稀釋液包括PBS。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述抗體稀釋液包括含有FBS的roS，所述FBS的含量為0.5-5%， 較佳地，1 -4 %，更佳地，1 -3 %，以抗體稀釋液的總重計。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還包括標(biāo)簽或說明書，所述標(biāo)簽或說明書注明所述 試劑盒采集的血樣量為〇. 5-3.5ml，較佳地，l-3ml，更佳地，1.5-2.5ml。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞包括腹膜后起源的神經(jīng)母細(xì)胞瘤的腫瘤細(xì) 胞。
[0035] 本發(fā)明的第二方面提供了一種本發(fā)明第一方面所述檢測試劑盒的用途，用于制備 診斷循環(huán)腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)品。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞包括腹膜后起源的神經(jīng)母細(xì)胞瘤。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述檢測試劑盒可用于配套的檢測設(shè)備自動化操作。
[0038] 本發(fā)明第三方面提供了一種非診斷性的檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法，包括步驟：
[0039] (a)提供一待測血樣，所述血樣體積為l-4ml;
[0040] (b)去除血漿后，用本發(fā)明第一方面所述的檢測試劑盒處理，得到經(jīng)處理的血樣； 和
[0041] (c)用熒光原位雜交技術(shù)和免疫熒光染色技術(shù)對經(jīng)處理的血樣進(jìn)行檢測，觀察是 否存在所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞。
[0042] 在另一優(yōu)選例中，所述處理還包括用所述相關(guān)檢測試劑進(jìn)行處理，得到經(jīng)處理的 血樣。
[0043] 在另一優(yōu)選例中，所述哺乳動物包括人。
[0044] 在另一優(yōu)選例中，所述人的年齡為0.5-15歲，較佳地，1 -12歲，更佳地，1 -10歲。 [0045]在另一優(yōu)選例中，所述的檢測為定量檢測或定性檢測。
[0046]在另一優(yōu)選例中，所述方法包括步驟(d)，對經(jīng)處理的血樣進(jìn)行成像分析，根據(jù)成 像結(jié)果，確定是否存在所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞，并觀察所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞的數(shù)量。
[0047] 在另一優(yōu)選例中，當(dāng)DAPI+/CD45-/CEP8的細(xì)胞總數(shù)（即CTC總數(shù)）2 3,較佳地，4-9， 更佳地，4-7時，則可判斷該細(xì)胞為循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC細(xì)胞）。
[0048]在另一優(yōu)選例中，所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞包括腹膜后起源的神經(jīng)母細(xì)胞瘤的腫瘤細(xì) 胞。
[0049] 在另一優(yōu)選例中，當(dāng)DAPI+/CD45-/CEP8的細(xì)胞總數(shù)（即CTC總數(shù)）2 3,較佳地，4-9， 更佳地，4-7時，則可判斷對象患有腹膜后起源的神經(jīng)母細(xì)胞瘤。
[0050] 本發(fā)明第四方面提供了 一種試劑組合，所述試劑組合包括：
[0051] (i)紅細(xì)胞與白細(xì)胞聯(lián)合抗體；
[0052] (ii)白細(xì)胞表面共同抗原抗體；
[0053] (iii)細(xì)胞核熒光染料;和
[0054] (iv)染色體FISH探針。
[0055] 本發(fā)明第五方面提供了一種本發(fā)明第四方面所述試劑組合的用途，用于制備診斷 腹膜后起源的神經(jīng)母細(xì)胞瘤的試劑盒。
[0056]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0057]圖1顯示了CTC細(xì)胞在各個熒光通道中的細(xì)胞圖。
[0058]圖2顯示了CTC細(xì)胞在各個熒光通道中的細(xì)胞圖。
[0059]圖3顯示了手術(shù)前，CTC細(xì)胞在各個熒光通道中的細(xì)胞圖。
[0060]圖4顯示了手術(shù)后，CTC細(xì)胞在各個熒光通道中的細(xì)胞圖。
[0061]附圖中，merge表示合并或疊加，WBC表示白細(xì)胞;CTC表示循環(huán)腫瘤細(xì)胞。
【具體實施方式】
[0062]本發(fā)明人經(jīng)過長期廣泛而深入的研究，通過大量篩選和測試，首次意外地發(fā)現(xiàn)，用 含有（i)紅細(xì)胞與白細(xì)胞聯(lián)合抗體；（i i)白細(xì)胞表面共同抗原抗體(如CD45抗體）；（i i i)細(xì) 胞核熒光染料(如DAPI);和（iv)染色體FISH探針(如CEP8)的試劑盒檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞(如 腹膜后起源的神經(jīng)母細(xì)胞瘤），只需要采集極少量的血液(如2ml或更少)就可快速、精確檢 測到循環(huán)腫瘤細(xì)胞，特別適合用于診斷腹膜后起源的神經(jīng)母細(xì)胞瘤(尤其是腹膜后起源的 小兒神經(jīng)母細(xì)胞瘤）。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人完成了本發(fā)明。
[0063] 檢測試劑盒
[0064] 本發(fā)明提供一種快速、低成本、有效的檢測腹膜后起源的神經(jīng)母細(xì)胞瘤CTC檢測試 劑盒。
[0065] 在本發(fā)明中，本發(fā)明的試劑盒包含以下組分：
[0066] (i)紅細(xì)胞與白細(xì)胞聯(lián)合抗體；
[0067] (ii)白細(xì)胞表面共同抗原抗體；
[0068] (iii)細(xì)胞核熒光染料;和
[0069] (iv)染色體FISH探針。
[0070] 在本發(fā)明中，本發(fā)明的試劑盒中的各個組分之間的比例，以及各個組分的含量不 受限制。
[0071] 本發(fā)明的試劑中的各組分可購買獲得，或用常規(guī)方法制備。
[0072] 本發(fā)明的試劑盒可精確檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞(腹膜后起源的神經(jīng)母細(xì)胞瘤），并只需 采集很少的需(〇. 5-3.5ml，較佳地，1 -3ml，更佳地，1.5-2.5ml)。
[0073]檢測方法
[0074] 本發(fā)明還提供了一種檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞(如腹膜后起源的神經(jīng)母細(xì)胞瘤)的方法。
[0075] 在一優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明所述的檢測方法包括步驟：
[0076] (i)采集患者外周血2mL于BD抗凝管，48小時內(nèi)（盡量24h內(nèi)）用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行 檢測。
[0077] (ii)對全血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行富集，富集的細(xì)胞固定后涂到載玻片上；
[0078] (iii)對上述(2)所述載玻片上的細(xì)胞采用熒光原位雜交技術(shù)和免疫熒光染色技 術(shù)進(jìn)行鑒定；
[0079] (iv)將上述(3)所得細(xì)胞玻片置于熒光顯微鏡下判讀，拍照記錄下CTC細(xì)胞圖，并 統(tǒng)計CTC細(xì)胞總數(shù)。
[0080] (v)結(jié)果分析。如果檢測的目的是判別腫瘤類型，當(dāng)CTC細(xì)胞數(shù)2 15個/2mL血，則可 判斷該患者腫瘤類型為腹膜后起源的神經(jīng)母細(xì)胞瘤的可能性很大;如果檢測目的是腫瘤進(jìn) 展的實時監(jiān)控，則可比較本次檢測結(jié)果與上次檢測結(jié)果(通常監(jiān)控檢測的間隔時間是一個 月），通過CTC檢出數(shù)值變化預(yù)示腫瘤進(jìn)展情況，進(jìn)而確定是否需要聯(lián)合其他腫瘤干預(yù)方法 或更改治療方案。
[0081]具體地，當(dāng)采用本發(fā)明的檢測腹膜后起源的神經(jīng)母細(xì)胞瘤CTC檢測試劑盒進(jìn)行檢 測時，典型地可包括以下檢測步驟及后續(xù)CTC細(xì)胞判讀過程：
[0082] (1)循環(huán)腫瘤細(xì)胞富集部分(采用的試劑為Human CD45Depletion Cocktail試劑 盒，主要參考原試劑盒說明書）
[0083] 1.1 2mL全血800g離心8分鐘，去除上層血漿，加入與血漿等體積的CTC細(xì)胞洗滌緩 沖液，顛倒混勻。
[0084] 1.2向上述（1.1)中體系加入1 OOyL白細(xì)胞與紅細(xì)胞聯(lián)合抗體，充分混勻，室溫孵育 20分鐘。
[0085] 1.3取3mL分離介質(zhì)于干凈15mL離心管中。向上述（1.2)中體系加入2mLCTC細(xì)胞洗 滌緩沖液，充分混勻后，全部溶液體系輕輕疊加到3mL分離介質(zhì)上，963g( 2200rpm)離心20分 鐘(試劑盒說明書為1200g，我們調(diào)整后的參數(shù)離心效果更理想）。
[0086] 1.4離心后可見分層。轉(zhuǎn)移上層細(xì)胞層至新的15mL離心管中，加入CTC細(xì)胞洗滌緩 沖液補足體積至15ml，2000rpm離心5分鐘，棄上層溶液至lml處。（轉(zhuǎn)移后的洗滌步驟為我們 修改的）
[0087] 1.5(可選步驟)離心后觀察沉淀有無明顯的未去除干凈的紅細(xì)胞，如果沒有或極 少可直接進(jìn)行以下1.6步驟，如果有則需進(jìn)行紅細(xì)胞處理。具體操作為：向上述1.4步驟所得 溶液體系加入27°C預(yù)熱后的紅細(xì)胞裂解液3ml，搖勻液體，靜置3分鐘，每隔1分鐘搖勻一次 液體。
[0088] 1.6輕輕搖動離心管以散開細(xì)胞沉淀，加入CTC細(xì)胞洗滌緩沖液補足體積至15ml， 2000rpm離心5分鐘。
[0089] 1.7取一防脫載玻片，用免疫組化筆畫出lcmX lcm的方形涂布區(qū)域。
[0090] 1.8棄上層溶液至100yL處，輕輕吹散細(xì)胞沉淀，加入100yL細(xì)胞固定液，充分混勻， 所得細(xì)胞懸液全部涂布至載玻片上的細(xì)胞涂布區(qū)域。
[0091] 1.9玻片靜置晾干或31~32°C烘干過夜。
[0092] (2)熒光原位雜交技術(shù)聯(lián)合免疫熒光染色技術(shù)共同鑒定循環(huán)腫瘤細(xì)胞部分(CEP8 探針可市售獲得，例如購自Vysis公司）
[0093] 2.1實驗前試劑準(zhǔn)備：
[0094] a.按180yL/片的量取1 %甲醛，37 °C預(yù)熱20分鐘。
[0095] b.提前將20X SSC(PH=5.3)母液用無菌去離子水10倍稀釋制備成工作溶液，該溶 液可多配制，最多可室溫放置6個月。
[0096] c.提前配制洗滌緩沖液，可多配制，洗滌緩沖液可室溫放置6個月。
[0097] 2 ? 2將充分預(yù)熱的1 %甲醛與胃蛋白酶(0 ? 05mg/mL)按180yL/片:20yL/片的比例迅 速混合，立即滴加到上述1.8所得玻片的細(xì)胞涂布區(qū)域，確保溶液充分覆蓋整個標(biāo)本區(qū)，室 溫孵育10分鐘。
[0098] 2.3吸棄玻片上的液體，用2乂330 2001^/次.片洗滌玻片上的標(biāo)本區(qū)域，一共洗滌 3次。前兩次洗滌時，溶液加入后立即吸棄，最后一次溶液滴加后，靜置lmin后吸棄。
[0099] 2.4將標(biāo)本玻片放入含有70%、85%、100%無水乙醇的染色缸中分別靜置1分鐘、1 分鐘、2分鐘進(jìn)行CTC細(xì)胞脫水處理。脫水處理后的玻片豎立在無塵紙上輕輕嗑動，以吸干玻 片流下的殘留液，并用微型吹風(fēng)機將玻片吹干。完全干燥的玻片立即進(jìn)行下步操作。
[0100] 2.5滴加8號染色體FISH探針。按5yL/片的量將探針滴加至標(biāo)本區(qū)中央，蓋上蓋玻 片，用封片膠封片。本操作及以下操作均需在避光條件下進(jìn)行。
[0101] 2.6熒光原位雜交。上述玻片放上雜交儀，設(shè)置雜交程序為:73°C，10分鐘；37°C，6 小時。
[0102] 2.7雜交結(jié)束前10分鐘，進(jìn)行抗體混合液的配制。白細(xì)胞表面共同抗原抗體(CD45 抗體)用抗體稀釋液按1:100進(jìn)行稀釋，抗體混合液按200yL/片的量準(zhǔn)備。
[0103] 2.8標(biāo)本免疫熒光前處理。
[0104] a.雜交結(jié)束后，使用鑷子撕去封片膠，將玻片置于含有2X SSC的染色缸中，晃動移 除蓋玻片。立即進(jìn)行以下清洗步驟。
[0105] b.2X SSC 200yL/次.片洗滌玻片上的標(biāo)本區(qū)域，一個洗滌2次，每次靜置lmin。 [0106] c.洗滌緩沖液200yL/次.片洗滌玻片上的標(biāo)本區(qū)域，一共洗滌3次。前兩次洗滌時， 溶液加入后立即吸棄，最后一次溶液滴加后，靜置lmin后吸棄。
[0107] 2.9將玻片置于濕盒中，20(^17片滴加抗體混合液至玻片標(biāo)本區(qū)，30°(：避光孵育1 小時。
[0108] 2.10吸棄玻片上的抗體混合液，用洗滌緩沖液洗滌抗體孵育后的CTC細(xì)胞。洗滌步 驟同上2.8(c)。
[0109] 2.11按5yL/片滴加DAPI Mounting于標(biāo)本區(qū)中央，蓋上蓋玻片。即完成了CTC的試 劑盒檢測部分。
[0110] (3)CTC鏡下判讀。將以上所得細(xì)胞玻片置于熒光顯微鏡下判讀，同時拍照記錄下 所有CTC細(xì)胞在各個熒光通道中的細(xì)胞圖。讀取細(xì)胞玻片時，需先從視野的左上角開始，移 動載玻片過程中不要有視野的遺漏。在40倍物鏡下，首先在紅色通道中尋找可疑細(xì)胞，即沒 有紅色外圈（CD45不表達(dá)）的裸核細(xì)胞，然后再分別確認(rèn)該可疑細(xì)胞在藍(lán)色通道中是否有藍(lán) 色熒光信號和其在橙色通道中的看到的橙色熒光信號點個數(shù)，進(jìn)而判斷該細(xì)胞是否為CTC 細(xì)胞。凡是同時具備DAPI+/⑶45-/CEP8 (即：⑶45表達(dá)陰性，CEP8鑒定為異倍體)條件的細(xì)胞 即可判別為CTC細(xì)胞。
[0111] 通常，當(dāng)DAPI+/CD45-/CEP8細(xì)胞的數(shù)量2 3時，則可判定所檢測樣品中患有數(shù)量較 多的CTC細(xì)胞(如腹膜后起源的神經(jīng)母細(xì)胞瘤的腫瘤細(xì)胞），進(jìn)而判斷被檢測對象患有神經(jīng) 母細(xì)胞瘤(尤其是腹膜后起源的神經(jīng)母細(xì)胞瘤）。
[0112] 用本發(fā)明的檢測方法可快速、精確的檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞，從而準(zhǔn)確地診斷(或輔助 診斷)對象是否患有腹膜后起源的神經(jīng)母細(xì)胞瘤。
[0113] 本發(fā)明的主要優(yōu)點包括：
[0114] (1)本發(fā)明僅需2mL患者外周血，微創(chuàng)且血液采集量少，樣本獲取比較容易，也極大 減輕了對患兒尤其是不足周歲的幼兒的傷害。
[0115] (2)本發(fā)明的檢測試劑盒及檢測方法，操作簡單，能快速、準(zhǔn)確輔助診斷患兒腫瘤 類型是否為腹膜后起源神經(jīng)母細(xì)胞瘤，降低誤診率，也實現(xiàn)了對腫瘤早發(fā)現(xiàn)、早分期、早治 療，提高患兒治療效率和生存率。
[0116] (3)相較于現(xiàn)有的CTC檢測方法，本發(fā)明檢測試劑盒及檢測方法極大降低了檢測成 本，大大減輕了患者及其家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，對需進(jìn)行連續(xù)監(jiān)控檢測的患者尤為適用。
[0117] (4)本發(fā)明的試劑盒可檢測患兒外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞情況，輔助診斷患兒腫瘤類 型是否為腹膜后起源的神經(jīng)母細(xì)胞瘤，或?qū)崟r監(jiān)控腹膜后起源神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒的腫瘤進(jìn) 展?fàn)顩r，以實現(xiàn)對該類疾病做到早發(fā)現(xiàn)早分期早治療或及時調(diào)整治療方案的目的，這對腹 膜后起源的神經(jīng)母細(xì)胞瘤的診斷和治療有著及其重要的意義。
[0118] (5)本發(fā)明通過定期外周血CTC檢測，還可對已實施手術(shù)或進(jìn)行其他治療了的患兒 進(jìn)行疾病進(jìn)展的監(jiān)控，以便及時調(diào)整治療方案，提高治療效率。
[0119] (6)本發(fā)明的試劑盒可配合自動化的設(shè)備，使得循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測能夠自動化 完成。
[0120] 下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量 份數(shù)。
[0121] 本發(fā)明所用的材料如無特別說明，均為市售產(chǎn)品。
[0122] 實施例1
[0123] 腹膜后起源的神經(jīng)母細(xì)胞瘤的診斷試劑盒的制備及檢測效果驗證
[0124] 制備檢測腹膜后起源的神經(jīng)母細(xì)胞瘤CTC檢測試劑盒，所述試劑盒包括：白細(xì)胞與 紅細(xì)胞聯(lián)合抗體、分離介質(zhì)、CTC細(xì)胞洗滌緩沖液（2 %FBS+PBS)、紅細(xì)胞裂解液、細(xì)胞固定 液、胃蛋白酶(0.05mg/mL)、1 %甲醛、20 X SSC、8號染色體FISH探針、NP-40、抗體稀釋液（1 % FBS+PBS)、白細(xì)胞表面共同抗原抗體(CD45抗體）、細(xì)胞核熒光染料(DAPI)。
[0125] 試劑盒使用前部分工作溶液需提前進(jìn)行以下準(zhǔn)備：
[0126] (1)2 X SSC的制備:取50mL 20 X SSC(PH = 5 ? 3)母液，加入450mL無菌去離子水，充 分混勻即可獲得500mL 20X SSC(PH=5.3M^.。
[0127] (2)洗滌緩沖液即0.1 %NP-40的2 X SSC溶液(PH = 7.0~7.5)的制備:取上述（1)所 得的20 X SSC(PH= 5.3) 100mL、另取lmL NP-40及849mL無菌去離子水混勻，調(diào)PH至7.0~ 7.5，最終定容至100〇11^即可。
[0128] (3)抗體稀釋液（1%FBS+PBS)的制備：取lmL FBS加入99mL PBS，充分混勻即可。
[0129] 實施例2
[0130]用實施例1制備的腹膜后來源神經(jīng)母細(xì)胞瘤CTC檢測試劑盒，進(jìn)行檢測并進(jìn)行驗 證，具體步驟如下：
[0131] (1)米集數(shù)例：
[0132] 第一批次試驗：已確診的腹膜后來源神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒外周血2mL，或?qū)φ諅€體的 外周血2ml(其它腫瘤個體的外周血C1，或10個正常個體的外周血C2);
[0133] 第二批次試驗：已確診的腹膜后來源神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒外周血2mL，以及其它腫瘤 個體的外周血C3至C14,以及20個正常個體的外周血C15
[0134] (2)進(jìn)行CTC的富集及細(xì)胞玻片的制備：
[0135] a. 2mL外周血800g離心8分鐘，去除血漿，加入相應(yīng)等體積的CTC細(xì)胞洗滌緩沖液， 混勻后再加入lOOyL白細(xì)胞與紅細(xì)胞聯(lián)合抗體，室溫孵育20分鐘。再加入2mLCTC細(xì)胞洗滌緩 沖液，充分混勻后，全部體系疊加到3mL分離介質(zhì)上，963g(2200rpm)離心20分鐘，收集上層 細(xì)胞層至新的15mL離心管中，即實現(xiàn)了CTC的富集；
[0136] b.對以上收集的細(xì)胞用15mL細(xì)胞洗滌緩沖液，2000rpm離心5分鐘進(jìn)行細(xì)胞洗滌， 重復(fù)以上洗滌一次。最后制成1〇〇此細(xì)胞懸液，加入100此細(xì)胞固定液，充分混勻，將所有細(xì) 胞懸液全部涂布至載玻片上的細(xì)胞涂布區(qū)域，制成細(xì)胞玻片。細(xì)胞玻片32°C烘干過夜，為 CTC鑒定準(zhǔn)備；
[0137] (3)熒光原位雜交和免疫熒光染色共同鑒定CTC:
[0138] a.細(xì)胞玻片的熒光原位雜交檢測。20yL胃蛋白酶(0.05mg/mL)與180yL提前預(yù)熱至 37°C的1 %甲醛混合制備成工作溶液后立即覆蓋至整個標(biāo)本區(qū)，室溫孵育10分鐘對細(xì)胞膜 進(jìn)行處理。2X SSC對標(biāo)本區(qū)域進(jìn)行洗滌。用70%、85%、100%無水乙醇依次對細(xì)胞進(jìn)行脫水 處理。微型吹風(fēng)機將玻片完全吹干后立即滴加 lOyL 8號染色體FISH探針，用封片膠封片，雜 交儀上進(jìn)行熒光原位雜交。雜交程序為:73°C，10分鐘;37°C，6小時；
[0139] b.細(xì)胞玻片的免疫熒光檢測。雜交結(jié)束前10分鐘，進(jìn)行CD45抗體混合液的配制。雜 交結(jié)束后，用鑷子撕去封片膠，將玻片置于含有2X SSC的染色缸中，晃動移除蓋玻片。用2X SSC和洗滌緩沖液洗滌分別對玻片上的標(biāo)本區(qū)域進(jìn)行洗滌。將洗滌后的玻片置于濕盒中，滴 加200yL抗體混合液至玻片標(biāo)本區(qū)，30°C避光孵育1小時?？贵w孵育結(jié)束后吸棄玻片上的抗 體混合液，用洗滌緩沖液進(jìn)行細(xì)胞洗滌；
[0140] c.細(xì)胞核染色。滴加5yL DAPI Mounting于標(biāo)本區(qū)中央，蓋上蓋玻片使DAPI Mount ing在整個標(biāo)本區(qū)潤開，吸棄玻片周圍的多余液體，即完成了 CTC的鑒定檢測部分；
[0141] (4)CTC的鏡下判讀：
[0142] 按照CTC的判讀標(biāo)準(zhǔn)DAPI+/⑶45-/CEP8+ (三倍體或以上的多倍體)對以上所得細(xì) 胞玻片置于熒光顯微鏡下判讀，同時拍照記錄下所有CTC細(xì)胞在各個熒光通道中的細(xì)胞圖。
[0143] 檢測結(jié)果如表1所示。其中，對于2ml血樣，檢測到2 3個CTC細(xì)胞，可判定為患有腹 膜后來源神經(jīng)母細(xì)胞瘤。
[0144] 表1CTC檢測結(jié)果（外周血2ml)
[0147]表2其它腫瘤病例的CTC檢測結(jié)果(外周血2ml)

'[0149] 上述結(jié)果表明，腹膜后起源的神經(jīng)母細(xì)胞瘤與其他來源的腫瘤在外周血中CTC的 數(shù)量存在非常顯著的差別，前者外周血中CTC數(shù)量非常多，甚至達(dá)到約約50個/2mL，是CTC含 量最多的腫瘤。因此，采用本發(fā)明的檢測試劑盒或方法，僅用0.5 - 2毫升的血樣，就足以較 為準(zhǔn)確地判斷出腹膜后起源的神經(jīng)母細(xì)胞瘤。
[0150] 以一個被檢測個體中所檢測的2個CTC細(xì)胞為例，結(jié)果如圖1和圖2所示。結(jié)果表明， 本發(fā)明的檢測方法可精確檢測到腹膜后來源神經(jīng)母細(xì)胞瘤。
[0151] 實施例3
[0152] 腹膜后起源的神經(jīng)母細(xì)胞瘤CTC檢測試劑盒的可行性驗證
[0153] 應(yīng)用實施例1制備的檢測試劑盒進(jìn)行可行性驗證，具體情況如下：
[0154] (1)某5歲患兒出現(xiàn)不明原因發(fā)熱及輕度貧血現(xiàn)象，疑為神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者，采集 其外周血；
[0155] (2)應(yīng)用本發(fā)明腹膜后神經(jīng)母細(xì)胞瘤CTC檢測試劑盒對采集的外周血進(jìn)行循環(huán)腫 瘤細(xì)胞的富集及檢測，檢測步驟同實施例1中（2)~(4)。
[0156] (3)檢測結(jié)果顯示，該患者2mL外周血檢測到的CTC總數(shù)為16個，其中三倍體CTC 7 個，四倍體CTC 4個，五倍體及以上CTC 5個，CTC細(xì)胞圖如圖3所示。CTC總數(shù)大于10,該患者 為腹膜后起源的神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者的可能性非常大；
[0157] (4)醫(yī)生根據(jù)該檢測結(jié)果對該患者進(jìn)行了有針對性的檢查，在第二次腹部超聲時 發(fā)現(xiàn)可疑腫塊，并對其及時實施了手術(shù)及相關(guān)治療；
[0158] (5)術(shù)后3個月，再對該患者進(jìn)行了外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測，檢測過程同（2);
[0159] (6)經(jīng)檢測，該腹膜后來源神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者外周血CTC總數(shù)為2個，其中三倍體 CTC 1個，四倍體CTC 1個，CTC細(xì)胞圖如圖4所示?；颊咄庵苎狢TC數(shù)量急劇減少，其他臨床檢 測指標(biāo)也顯示患者恢復(fù)狀況極佳，可見治療效果較好，可維持原有治療方案繼續(xù)進(jìn)行治療；
[0160] (7)術(shù)后治療6個月后，采集其外周血，進(jìn)行外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測，檢測過程同 實施例1中（2)~(4);
[0161] (8)經(jīng)檢測，該腹膜后來源神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者外周血CTC總數(shù)降為0,與其他臨床檢 測結(jié)果相符，均顯示患者治療效果極佳。
[0162] 結(jié)果表明，本發(fā)明的檢測方法和試劑盒可精確檢測到腹膜后來源神經(jīng)母細(xì)胞瘤并 反映治療效果。
[0163] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【主權(quán)項】
1. 一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含有如下組分： (i) 紅細(xì)胞與白細(xì)胞聯(lián)合抗體； (ii) 白細(xì)胞表面共同抗原抗體； (iii) 細(xì)胞核熒光染料;和 (iv) 染色體FISH探針。2. 如權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述白細(xì)胞表面共同抗原抗體包括 ⑶45抗體。3. 如權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述細(xì)胞核熒光染料包括DAPI染料。4. 如權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述染色體FISH探針包括針對染色體 著絲粒的FISH探針。5. 如權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括一種或種額外的檢 測相關(guān)試劑，所述檢測相關(guān)試劑選自下組:分離介質(zhì)、CTC細(xì)胞洗滌緩沖液、紅細(xì)胞裂解液、 細(xì)胞固定液、通透處理劑、洗滌緩沖液母液(SSC )、NP-40、抗體稀釋液、或其組合。6. 如權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞包括腹膜后起源的 神經(jīng)母細(xì)胞瘤的腫瘤細(xì)胞。7. -種權(quán)利要求1所述檢測試劑盒的用途，其特征在于，用于制備診斷循環(huán)腫瘤細(xì)胞的 產(chǎn)品。8. -種非診斷性的檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法，其特征在于，包括步驟： (a) 提供一待測血樣，所述血樣體積為I-4ml; (b) 去除血漿后，用權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒處理，得到經(jīng)處理的血樣； (c) 用熒光原位雜交技術(shù)和免疫熒光染色技術(shù)對經(jīng)處理的血樣進(jìn)行檢測，觀察是否存 在所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞。9. 一種試劑組合，其特征在于，所述試劑組合包括： (i) 紅細(xì)胞與白細(xì)胞聯(lián)合抗體； (ii) 白細(xì)胞表面共同抗原抗體； (iii) 細(xì)胞核熒光染料;和 (iv) 染色體FISH探針。10. 如權(quán)利要求9所述試劑組合的用途，其特征在于，用于制備診斷腹膜后起源的神經(jīng) 母細(xì)胞瘤的試劑盒。
【文檔編號】G01N33/574GK105911269SQ201610121071
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年3月3日
【發(fā)明人】董瑞, 張楨珍, 董巋然, 鄭珊, 吳唯唯, 李凱, 鄭超, 劉翔琪, 許騁
【申請人】復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院, 上海張江轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研發(fā)中心有限公司