一種3-氨基-2-惡唑烷酮免疫檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種3?氨基?2?惡唑烷酮免疫檢測方法，呋喃唑酮在動物體內迅速代謝為3?氨基?2?惡唑烷酮(AOZ)，檢測呋喃唑酮的殘留實際上是檢測AOZ的殘留。本發(fā)明的檢測方法是將待檢物中的3?氨基?2?惡唑烷酮(AOZ)提取后改用3?醛基苯甲酸甲酯進行衍生化，得到3?醛基苯甲酸甲酯?3?氨基?2?惡唑烷酮(PCPME?AOZ)，然后再測定該衍生物的含量。以NP?AOZ和PCPME?AOZ為標準品進行間接競爭酶聯免疫吸附測定(icELISA)，結果證明用本發(fā)明的檢測方法能夠顯著提高呋喃唑酮殘留即3?氨基?2?惡唑烷酮(AOZ)免疫檢測的靈敏度。
【專利說明】
一種3-氨基-2-惡唑烷酮免疫檢測方法
技術領域
[0001 ]本發(fā)明涉及含有呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-惡唑烷酮的檢測方法及其應用。
【背景技術】
[0002]呋喃唑酮(痢特靈)是一種硝基呋喃類抗生素，為廣譜抗菌藥。3-氨基-2-惡唑烷酮 (3-Amino_2-〇xazolidinon，A0Z)是咲喃唑酮在動物體內的代謝物。咲喃唑酮可用于治療細 菌和原蟲引起的痢疾、腸炎、胃潰瘍等胃腸道疾患。對常見的革蘭氏陰性菌和陽性菌有抑制 作用。對毛滴蟲、賈第鞭毛蟲也有一定的活性。其作用機制為干擾細菌氧化還原酶從而阻斷 細菌的正常代謝。
[0003] 人口服呋喃唑酮吸收率低，通過血液循環(huán)主要停留在腸道內。但該藥物對肝、腎刺 激大、易充血及發(fā)生體內糖代謝及神經病變作用，并可在體內殘留。過量使用呋喃唑酮可能 會導致胃腸道反應;溶血性貧血、皮疹、藥熱等過敏反應;多發(fā)性神經炎;新生兒和G-6-PH缺 乏可致溶血性貧血。實驗證明，硝基呋喃類藥物及其代謝產物具有致癌和致突變的特性。
[0004] 由于呋喃唑酮的毒副作用，各國政府都采取了相關管制政策。美國在1975年和 1993年分別禁止了呋喃唑酮作為醫(yī)藥和獸藥使用。日本在1977年禁止了呋喃唑酮的使用。 2002年，中華人民共和國農業(yè)部將呋喃唑酮列為禁止使用的藥物，不得在動物性食品中檢 出。中華人民共和國食品藥品監(jiān)督總局也于2002年禁止了硝基呋喃類(包括呋喃唑酮)在動 物性食品中的使用。
[0005] 但是，硝基呋喃類藥物藥效顯著、價格低廉，能在動物體內迅速代謝從而難以檢 測。我國的養(yǎng)殖業(yè)中，仍有一些不法分子在利益的驅使下濫用了呋喃唑酮藥物，對消費者的 健康帶來了極大的隱患，同時也嚴重損害了農產品進出口貿易。因此市場上急需一種高效 快速靈敏的呋喃唑酮藥物殘留的檢測方法。
[0006] 由于酶聯免疫吸附檢測(ELISA)是一種具有突出優(yōu)勢的檢測方法。該方法具有快 速、簡單、準確、高通量、無需專業(yè)操作等優(yōu)點，使得它成為一種理想的市場監(jiān)查檢測方法。 國家標準(GB/T 20752-2006，豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產品中硝基呋喃類代謝物殘留量 的測定)等的文獻報道，把A0Z提取出來，在提取后用鄰硝基苯甲醛作為衍生劑，與A0Z發(fā)生 成肟反應從而生成NP-A0Z，但是NP-A0Z的酶聯免疫吸附檢測不夠靈敏。
[0007] 本發(fā)明創(chuàng)新地運用了一種呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-惡唑烷酮的檢測方法，使得 相應的ELISA檢測靈敏度大幅度提高。因此，本發(fā)明建立的酶聯免疫吸附檢測方法可以大大 提高檢測準確性，為各層監(jiān)督單位提供快速、高效、準確的檢測方法，具有不可估量的市場 價值。

【發(fā)明內容】

[0008] 為了使得用于檢測如動物源性食品及其加工產品等樣品中A0Z殘留的icELISA具 有更高的靈敏度，本發(fā)明創(chuàng)新了一種3-氨基-2-惡唑烷酮的處理方法，使得icELISA更加高 效更適宜于實際樣品的檢測。
[0009] 本發(fā)明所述的3-氨基-2-惡唑烷酮免疫檢測方法如下，將待測樣品中的3-氨基-2-惡唑烷酮通過肟反應衍生得到3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-惡唑烷酮后進行酶聯免疫吸 附檢測，以測定待測樣品中的3-氨基-2-惡唑烷酮含量。
[0010] 本發(fā)明中用3-醛基苯甲酸甲酯與待測樣品中的3-氨基-2-惡唑烷酮發(fā)生肟反應。
[0011] 本發(fā)明所述的酶聯免疫吸附檢測為間接競爭酶聯免疫吸附（icELISA)測定。
[0012] 本發(fā)明的待測樣品的獲取方法為將待檢物與甲醇-水混合溶液混合研勻，離心后 的沉淀物為待測樣品。
[0013] 本發(fā)明的待測樣品肟反應的操作方法步驟包括：1)將沉淀物與鹽酸溶液混合研 勻；2)再與3-醛基苯甲酸甲酯混勻后旋干;3)再加入1，4_二氧六環(huán)在氮氣保護條件下加熱 回流，減壓旋轉蒸發(fā)得到固體粉末;4)向步驟(3)的固體粉末中加入乙醇溶解;5)抽濾獲取 白色固體為含有衍生得到的3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-惡唑烷酮的物質。
[0014] 本發(fā)明所述的酶聯免疫吸附檢測中用完全抗原A0Z-3-醛基苯甲酸-BSA免疫動物 體獲得抗血清。所述的酶聯免疫吸附檢測為基于上述抗血清的3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-惡唑烷酮間接競爭酶聯免疫吸附反應。
[0015]本發(fā)明所述的酶聯免疫吸附檢測中以完全抗原A0Z-3-醛基苯甲酸-0VA作為固相 抗原。
[0016] 本發(fā)明所述的酶聯免疫吸附檢測中以3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-惡唑烷酮為 競爭性抑制物，以抗血清為一抗，以IgG-HRP為酶標二抗。
[0017] 本發(fā)明所述的3-氨基-2-惡唑烷酮免疫檢測方法的應用，尤其在于將待測樣品中 的3-氨基-2-惡唑烷酮通過肟反應衍生得到3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-惡唑烷酮后進行 酶聯免疫吸附檢測在3-氨基-2-惡唑烷酮快速檢測試劑盒方面的應用。
[0018] 以上檢測方法及其應用具有快速、簡單、準確、高通量、無需專業(yè)操作等優(yōu)點，使得 它成為一種理想的市場監(jiān)查檢測方法。
【附圖說明】
[0019] 圖1為3-氨基-2-惡唑烷酮(A0Z)的化學式；
[0020] 圖2為3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-惡唑烷酮(PCPME-A0Z)的化學式；
[0021] 圖3為鄰硝基苯甲醛-3-氨基-2-惡唑烷酮(NP-A0Z)的化學式；
[0022] 圖4為以PCPME-A0Z為標準抑制物的抗血清icELISA標準曲線；
[0023] 圖5為以NP-A0Z為標準抑制物的抗血清i cELI SA標準曲線
【具體實施方式】
[0024] 本發(fā)明中出現的技術術語及相關試劑配方如下：
[0025] △02:3-氨基2-惡挫燒酮（3-/\111；[110-2-(?&2011(1;[11011);
[0026] BSA:牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA)，分子量約為66.43kDa;
[0027] OVA:卵白蛋白（Albumin，from chicken egg white)，分子量約為44kDa;
[0028] Tween-20:吐溫20;
[0029] Gelatin:明膠；
[0030] DMEM:Dulbecco's modified Eagle's medium,細胞培養(yǎng)液；
[0031] PEG:聚乙二醇 2000;
[0032] HAT:hypoxanthine(次黃噪呤），aminopterin(氨基噪呤），thymidine(胸腺啼啶）；
[0033] PBS:磷酸鹽緩沖液（NaCl 137mM，KH2P04 1.5mM，Na2HP04 ? 12H20 8.3mM，pH 7.5)；
[0034] PBST: PBS溶液中加入0 ? 1 % 的Tween-20;
[0035] PBSTG: PBST溶液中加入0 ? 1 %的明膠；
[0036] 包被緩沖液：1.5g Na2C03、2.93g NaHC03溶于 1000mL水，pH 9.6;
[0037] 底物緩沖液：5.1g-水合檸檬酸、18.43g Na2HP04 ? 12H20、1.0mL Tween-20溶于 lOOOmL水，pH 5.0;
[0038] 文中出現的所有試劑及儀器設備均可配制或市購獲得，本發(fā)明具體實施例中所使 用的試劑均購買于Sigma公司。
[0039] 試驗例1:
[0040] 待檢物中3-氨基2-惡唑烷酮的獲取及其衍生物3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-惡 唑烷酮(PCPME-A0Z)的獲取。
[0041] 可參考國家標準(GB/T 20752-2006)的文獻報告，用文獻中的方法把3-氨基2-惡 唑烷酮提取出來，方法可以是（1)收集市場中或實驗室制備的待檢物，置于棕色離心管中， 加入甲醇-水混合溶液（甲醇與水的混合體積比為2:1)，研均，再用甲醇-水混合溶液洗滌均 質器刀頭，二者合并后離心，吸取上清液棄掉。
[0042] (2)向上述離心管中加入鹽酸溶液，研均，用鹽酸溶液洗滌均質刀頭，二者合并。
[0043] (3)把步驟(2)中的混合液中加入3-醛基苯甲酸甲酯，混勻后旋干。加入干燥的1， 4-二氧六環(huán)(1，4-dioxane)到反應瓶中，在氮氣保護條件下，加熱回流。
[0044] (4)用減壓旋轉蒸發(fā)儀脫溶劑得到固體粉末。
[0045] (5)向步驟(4)的固體粉末中加入乙醇，在超聲波水浴槽中促溶解。
[0046] (6)直接通過抽濾除掉3-醛基苯甲酸甲酯得到白色固體。
[0047] (7)干燥處理后得到白色粉末3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-惡唑烷酮（PCPME- A0Z)。
[0048]經過上述處理方案，若待檢物提取的待測樣品中含有3-氨基-2-惡唑烷酮(A0Z)， 其將與3-醛基苯甲酸甲酯發(fā)生成肟反應，衍生得到3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-惡唑烷酮 (PCPME-A0Z)〇
[0049] 具體的：
[0050] (1)待測樣品的獲取。收集市場中或實驗室制備的待檢物，稱取2.0g( ±0.01 g)，分 別置于50mL棕色離心管中，加入10mL甲醇-水混合溶液（甲醇與水的混合體積比為2:1)，均 質2min，再用5mL甲醇-水混合溶液洗滌均質器刀頭，二者合并5000r/min離心10min，吸取上 清液棄掉。向3個離心管中分別加入適量A0Z，使最終測定濃度為10.0ng/mL。
[0051 ] (2)向上述每個離心管中加入10mL 0.2mol/L鹽酸溶液，研均2min，用10mL 0.2mol/L的鹽酸溶液洗滌均質刀頭，二者合并。
[0052] (3)向步驟(2)的混合液中加入0.4mL3-醛基苯甲酸甲酯，混勻后懸干。加入干燥的 1，4-二氧六環(huán)（1，4-(1;[(^116)至1」251111單口反應瓶中，在氮氣保護條件下，加熱回流1.5至2.5 小時。
[0053] (4)用減壓旋轉蒸發(fā)儀脫溶劑得到固體粉末。
[0054] (5)向步驟(4)的固體粉末中加入乙醇，混勻溶解。
[0055] (6)直接通過抽濾除掉3-醛基苯甲酸甲酯。
[0056] (7)干燥上述混合液，處理后得到白色粉末。
[0057]以上化學反應使得待測樣品中可能含有的3-氨基-2-惡唑烷酮(A0Z)與3-醛基苯 甲酸甲酯發(fā)生成肟反應，衍生得到3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-惡唑烷酮(PCPME-A0Z)。 [0058] 試驗例2:
[0059]合成A0Z的半抗原和完全抗原，并用完全抗原免疫實驗小鼠獲得抗血清：
[0060]參考Kevin M等的文獻報道（Kevin M. Cooper，Anthony Caddel 1，Christopher T.Elliott,D.Glenn Kennedy.Production and characterisation of polyclonal antibodies to a derivative of 3_amin〇-2-〇xazolidinone，a metabolite of the nitrofuran furazolidone.Analytica Chimica △(^&，2004,520,79-86.)，合成厶02的半抗 原和完全抗原。用完全抗原A0Z-3-醛基苯甲酸-BSA(按蛋白的量計量，1. Omg/mL)與弗氏佐 劑按l:l(v/V)混合乳化，乳化完全后注射到小鼠體內。免疫Balb/c雌性小鼠，每只小鼠每次 分別在背部和腹腔各注射。四次免疫之后，取小鼠血液，離心之后得到抗血清。
[0061 ]具體的，制備了A0Z半抗原的方法步驟如下：
[0062] (1)依次取A0Z鹽酸鹽固體粉末38.0mg(l .Oequiv. )，3_醛基苯甲酸41.6mg (1 .Oequiv.)，干燥的1,4-二氧六環(huán)（1，4-dioxane)8mL共同加入到25mL單口反應瓶中，在氮 氣保護條件下，加熱回流2小時。
[0063 ] (2)用減壓旋轉蒸發(fā)儀脫溶劑得到白色固體粉末。
[0064] (3)向步驟(2)的固體粉末中加入8mL乙醇，在超聲波水浴槽中溶解lmin。
[0065] (4)由于A0Z-3-醛基苯甲酸在乙醇中的溶解性很差，而3-醛基苯甲酸在乙醇中溶 解性很好，直接通過抽濾除掉3-醛基苯甲酸得到白色固體。
[0066] (5)干燥步驟(4)中的白色固體得到半抗原A0Z-3-醛基苯甲酸。
[0067]具體的，制備了A0Z完全抗原的方法步驟如下：
[0068] (1)取半抗原A0Z-3-醛基苯甲酸2 ? 13mg(30 ? Oequiv ?)溶于0 ? 5mL N，N-二甲基甲酰 胺(DMF)，攪拌溶解。加入N-羥基琥珀酰亞胺(順3)1.5711^(45.0叫1^.)攪拌3〇1^11，再加入 1'1，1'1'-二環(huán)己基碳二亞胺(0(^)2.81311^(45.〇6911；[￥.)4°0攪拌過夜。
[0069] (2)稱取牛血清蛋白（85六）2〇11^(1.0叫11".）裝入1〇11^玻璃反應瓶中，再加入211^ PBS攪拌溶解。
[0070] (3)把步驟(1)中的混合物緩慢逐滴加入到步驟(2)的溶液中，4°C攪拌過夜。
[0071] (4)把步驟(3)中混合物轉移到透析袋中，用PBS透析2天，每天換液3次。最后按蛋 白質的量用PBS配成1.0mg/mL，分裝到1. OmL/管，-40 °C長期凍存。此過程就完成了半抗原與 蛋白質的偶聯(即得到完全抗原）。
[0072] 半抗原與卵清白蛋白（0VA)的偶聯方法同上。
[0073]具體的，用完全抗原A0Z-3-醛基苯甲酸-BSA免疫Balb/c雌性小鼠獲得抗血清的方 法步驟如下:取上述制備好的完全抗原一管（1.OmL)與弗氏佐劑按l:l(v/v)混合乳化，乳化 完全后注射到小鼠體內。
[0074] 免疫Balb/c雌性小鼠的免疫方案見表1。
[0075]表1完全抗原免疫小鼠的免疫方案
[0077] 將第四次免疫（四免）之后的小鼠進行眼眶取血，離心取血清，從而制備得到抗血 清。
[0078] 試驗例3:
[0079]以抗血清和PCPME-A0Z、NP_A0Z分別建立了間接競爭酶聯免疫吸附反應(icELISA) 進行對照及建立標準曲線的方法如下：
[0080] (1)取完全抗原A0Z-3-醛基苯甲酸-〇VA( 1 ? Omg/mL)用包被緩沖液稀釋1: 320000 倍，加到酶標板中200uL/孔。放入37 °C培養(yǎng)箱中溫育3h。
[0081 ] (2)用PBST洗板4次，甩干。
[0082] (3)將標準品 PCPME-A0Z 用 PBSTG 稀釋成系列梯度（2;1;0.5;0.25;0.125 ;0.0625; 0.03125;0即/11^)?；驅藴势汾?402用？8516稀釋成系列梯度（300;150 ;75;37.5;18.75; 9.375;Ong/mL)。用roSTG把抗血清稀釋120000倍。在酶標板孔中依次加入100uL濃度為標準 品和1 OOuL抗血清稀釋液。37 °C溫育30min。
[0083] (4)用PBST洗板4次，甩干。
[0084] (5)每孔加入200uL 用 PBSTG 稀釋的 IgG-HRP。
[0085] (6)用PBST洗板4次，甩干。
[0086] (7)每孔加入200uL底物緩沖液，顯色到一定程度再加入50uL硫酸(2M)終止反應。
[0087] (8)在492nm波長測吸光值。
[0088] 測得相應數據后，用分析軟件OriginPro 8.0建立標準曲線，見圖4(PCPME-A0Z為 標準品），圖5 (NP-A0Z為標準品）。
[0089]利用本發(fā)明的檢測方法，可以成功地使待檢物中可能殘留的A0Z經過一系列的衍 生化反應，最終得到了 PCPME-A0Z。并利用制備得到的抗血清，以PCPME-A0Z作為標準抑制物 建立了 icELISA，其標準曲線見圖4。同時，利用以已報道的衍生方法得到的NP-A0Z作為標準 抑制物建立了 icELISA，其標準曲線見圖5。以NP-A0Z為標準品進行間接競爭酶聯免疫吸附 測定（化￡1134)，得到的1050和檢測范圍分別為46.63即/11^，11.02~187.43叫/11^。而以 PCPME-A0Z為標準品進行間接競爭酶聯免疫吸附測定（icELISA)，得到的IC50和檢測范圍分 別為0 ? 37ng/mL，0 ? 08~1 ? 31ng/mL。結果證明以PCPME-A0Z為標準抑制物時，其icELISA的靈 敏度更高。實驗證明以本發(fā)明的A0Z檢測方法能大幅度提升icELISA靈敏度。
[0090]將待檢物中可能殘留的A0Z經過一系列的衍生化反應，最終得到了PCPME-A0Z，以 PCPME-A0Z作為標準抑制物建立了 i cELI SA，得到的吸光值與標準曲線比對，從而知悉A0Z的 含量，其能提高icELISA靈敏度，可以快速推廣市場應用，在市場監(jiān)測過程中具有更深遠的 意義。
[0091]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并非用以限定本發(fā)明的實質技術內容范 圍，本發(fā)明的實質技術內容是廣義地定義于申請的權利要求范圍中，任何他人完成的技術 實體或方法，若是與申請的權利要求范圍所定義的完全相同，也或是一種等效的變更，均將 被視為涵蓋于該權利要求范圍之中。
【主權項】
1. 一種3-氨基-2-惡唑烷酮免疫檢測方法，其特征在于，將待測樣品中的3-氨基-2-惡 唑烷酮通過肟反應衍生得到3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-惡唑烷酮后進行酶聯免疫吸附 檢測，以測定待測樣品中的3-氨基-2-惡唑烷酮含量。2. 如權利要求1所述的3-氨基-2-惡唑烷酮免疫檢測方法，其特征在于，用3-醛基苯甲 酸甲酯與待測樣品中的3-氨基-2-惡唑烷酮發(fā)生肟反應。3. 如權利要求1所述的3-氨基-2-惡唑烷酮免疫檢測方法，其特征在于，所述的酶聯免 疫吸附檢測為間接競爭酶聯免疫吸附測定。4. 如權利要求2所述的3-氨基-2-惡唑烷酮免疫檢測方法，其特征在于:待測樣品的獲 取方法為將待檢物與甲醇-水混合溶液混合研勻，離心后的沉淀物為待測樣品。5. 如權利要求4所述的3-氨基-2-惡唑烷酮免疫檢測方法，其特征在于，所述的待測樣 品肟反應的操作方法步驟包括： 1) 將沉淀物與鹽酸溶液混合研勻； 2) 再與3-醛基苯甲酸甲酯混勻后旋干； 3) 再加入1，4_二氧六環(huán)在氮氣保護條件下加熱回流，減壓旋轉蒸發(fā)得到固體粉末； 4) 向步驟(3)的固體粉末中加入乙醇溶解； 5) 抽濾獲取白色固體為含有衍生得到的3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-惡唑烷酮的物 質。6. 如權利要求1至5所述的任一 3-氨基-2-惡唑烷酮免疫檢測方法，其特征在于，酶聯免 疫吸附檢測中用完全抗原A0Z-3-醛基苯甲酸-BSA免疫動物體獲得抗血清。7. 如權利要求6所述的3-氨基-2-惡唑烷酮免疫檢測方法，其特征在于，酶聯免疫吸附 檢測為基于抗血清的3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-惡唑烷酮間接競爭酶聯免疫吸附反應。8. 如權利要求7所述的3-氨基-2-惡唑烷酮免疫檢測方法，其特征在于，酶聯免疫吸附 檢測中以完全抗原A0Z-3-醛基苯甲酸-OVA作為固相抗原。9. 如權利要求8所述的3-氨基-2-惡唑烷酮免疫檢測方法，其特征在于，酶聯免疫吸附 檢測中以3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-惡唑烷酮為競爭性抑制物，以抗血清為一抗，以 IgG-HRP為酶標二抗。10. 如權利要求1所述的3-氨基-2-惡唑烷酮免疫檢測方法的應用，其特征在于將待測 樣品中的3-氨基-2-惡唑烷酮通過肟反應衍生得到3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-惡唑烷酮 后進行酶聯免疫吸附檢測在3-氨基-2-惡唑烷酮快速檢測試劑盒方面的應用。
【文檔編號】G01N33/543GK105911272SQ201610339702
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月20日
【發(fā)明人】王保民, 張威, 陳俊玉, 王冕, 謝紫君, 楊濤, 寧香雪, 郭素琴, 譚桂玉, 丹陽
【申請人】福建安欣睿捷生物科技有限公司