一種同步定量檢測不同分子形式人中性粒細(xì)胞脂質(zhì)運載蛋白免疫層析裝置及其制備方法
【專利摘要】一種同步定量檢測不同分子形式人中性粒細(xì)胞脂質(zhì)運載蛋白(HNL)免疫層析裝置及其制備方法，屬于檢驗醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。由樣品稀釋液凍干粉、標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉及免疫層析試紙條組成；所述免疫層析試紙條由襯板、兩層濾血膜、樣品流動墊、UCP結(jié)合墊、分析膜和吸收墊組成。所述UCP結(jié)合墊包被UCP標(biāo)記的抗三種分子形式HNL抗體；所述分析膜上設(shè)有平行的三個檢測區(qū)T1、T2、T3和一個質(zhì)控區(qū)C，所述三個檢測區(qū)依次包被抗基質(zhì)金屬蛋白酶?9抗體、抗單體HNL抗體和抗同二聚體HNL抗體；質(zhì)控區(qū)C包被抗UCP標(biāo)記抗體來源動物免疫球蛋白的抗體。本發(fā)明使同一樣品在同一試紙條上聯(lián)合檢測三種分子形式HNL，具快速、定量、簡便等優(yōu)點，具有較大科研和臨床應(yīng)用前景。
【專利說明】
一種同步定量檢測不同分子形式人中性粒細(xì)胞脂質(zhì)運載蛋白 免疫層析裝置及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于臨床檢驗醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種同步聯(lián)合定量檢測不同分子形 式人中性粒細(xì)胞脂質(zhì)運載蛋白（HNL)的免疫層析裝置及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人中性粒細(xì)胞脂質(zhì)運載蛋白（human neutrophil lipocalin，HNL)最初是由Xu S. 等人(Scand.J. Cl in. Lab Invest 54,365-376)在中性粒細(xì)胞顆粒中發(fā)現(xiàn)的一種糖蛋白，屬 于脂質(zhì)運載蛋白（lipocalin)超家族成員，和其他脂質(zhì)運載蛋白具有相似的空間結(jié)構(gòu)。該蛋 白也稱中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白（neutrophil gelatinaseassociated lipocalin，NGAL)，又稱人脂質(zhì)運載蛋白2(lipocalin 2)等。蔡林君等人 (Clin. J. Am. Soc.Nephrol. 2010，5:2229-35)研究發(fā)現(xiàn)尿HNL以多種分子形式存在，有單體 (約25kDa)、同二聚體（約45kDa)以及與明膠酶(gelatinase)形成的異二聚體（約135kDa)。 除中性粒細(xì)胞能分泌HNL外，在生理或病理(如炎癥、感染、腫瘤、缺血等)條件下HNL在人體 多個組織表達(dá)。此外，氧化脅迫、一些細(xì)胞因子(如IL-10、TNF_a)能在體外誘導(dǎo)上皮細(xì)胞系 表達(dá)HNL(C1 in ? J ? Am? Soc ? N印hrol ? 2010，5:2229-35; J ? Immunol ? 2003，171:6630-9) 〇
[0003] 近年來，HNL作為腎損傷、腫瘤、急性細(xì)菌感染及炎癥等疾病的早期診斷生物標(biāo)志 物越來越受到人們重視。HNL在早期診斷因抗腫瘤藥物順鉑(Am. J.Nephrol. 2004，24: 307-15)、缺血(J.Am.Soc.N印hrol.2004,15:3073-82)、膿毒癥（中國實用醫(yī)藥2015,24:46-47)、 IgA腎病(Clin ? Immunol ? 2007，123:227-34;中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志2013，3:223-226)、系 統(tǒng)性紅斑狼瘡(Arthritis Rheum. 2006，54: 2577-84)、心臟外科手術(shù)（Lancet 2005，365: 1231-8;Clin.Chim.Acta. 2009,403:121-5;東南大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版)2012,1:67-71)等引起 的AKI時表現(xiàn)出了良好的早期預(yù)判能力。此外，有研究表明HNL具有作為卵巢癌 (Int.J.Cancer 2007,120: 2426-2434;實用腫瘤雜志2010,5:539-542 ?)、胰腺癌 (Br ? J? Cancer 2008，98:1540-1547 ?)、胃癌（Anat ? Rec ? 2010，293:1855-1863 ?)、結(jié)腸直腸 癌（Genet .Mol ? Res ? 2014，13 : 7102-7112 ;腫瘤學(xué)雜志2009，2 : 115-119 ?)、乳癌 (Biomed.Rep. 2013,1:479-483;中國實用醫(yī)藥2011,20:43-45.)等癌癥的生物標(biāo)志物的潛 力。Venge P?等人報道了HNL與急性感染的相關(guān)性(Scand.J.Clin.Lab Invest 2011,55: 125-131；Cl in.Chem.Lab Med.2011,49:999-1003；Int.Urol.Nephrol.2014, 46:2243-2249)。隨著研究的不斷深入，HNL作為疾病診斷生物標(biāo)志物的功能越來越受到人們的重視。
[0004] 目前，HNL作為急性腎損傷早期診斷生物標(biāo)志物的研究報道較多。與現(xiàn)行的臨床上 采用的血清肌酐(sCr)指標(biāo)相比，許多研究結(jié)果顯示HNL能提前1到2天預(yù)判患者是否將發(fā)生 AKI，這為臨床爭取到了提前介入治療AKI的寶貴時間，將來HNL有可能成為AKI臨床即時就 地檢驗(Point of Care Testing，P0CT)項目。因此，急需開發(fā)便攜、快速、易操作、定量的 HNL檢測技術(shù)。目前生物體液樣本中HNL定量方法主要基于抗原抗體特異性反應(yīng)的免疫檢測 技術(shù)，如RIA(國際專利W0/1995/029404A1和中國ZL 200980155194)、ELISA(歐洲專利EP 2225268和中國專利ZL200980155194)、Western-blotting、膠乳免疫比濁法（中國專利ZL 201410431182和ZL201210394943)、化學(xué)發(fā)光免疫分析法（中國專利申請?zhí)?01510184818和 201410197672)等。以上方法有各自的優(yōu)點，但也存在缺點，尤其HNL作為POCT項目檢測時它 們的缺點尤為突出。如RIA存在測試時間過長、需要專門的防輻射場地、易造成環(huán)境污染等 問題；ELISA自動化程度不高、實驗操作時間長、需專業(yè)人員操作，且成本高。Western-blotting 操作時間長而復(fù)雜，且測定精密度低； 化學(xué)發(fā)光法測定線性范圍較小 ，檢測成本 高;膠乳免疫比濁法特異性低、試劑穩(wěn)定性和均一性差、檢測線性范圍窄及測試時間較長。 可見上述HNL檢測方法目前不能滿足HNL的P0CT項目檢測要求。近年來，為了滿足HNL快速定 量的需求，多種免疫層析技術(shù)用于HNL的定量檢測（中國專利ZL20 1220323587、 ZL201420423962、ZL201220392399、ZL201220323586 和 ZL201220497401)等。免疫層析技術(shù) 是一種快速診斷方法，常用于P0CT項目。免疫層析基本原理是將特異的抗體或抗原預(yù)先固 定在檢測膜(如硝酸纖維素膜)的檢測區(qū)內(nèi)并進(jìn)行干燥處理，當(dāng)該干燥的膜的一端浸入樣品 后，由于毛細(xì)現(xiàn)象(毛細(xì)管作用），樣品將沿著該膜向前移動，當(dāng)移動至固定有抗體或抗原的 區(qū)域時，樣品中相應(yīng)的抗原或抗體即與該抗體或抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，經(jīng)多種技術(shù)如 熒光標(biāo)記技術(shù)、免疫膠體金技術(shù)、免疫酶染色技術(shù)、量子點標(biāo)記技術(shù)及上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)等方 法使該檢測區(qū)顯示一定的信號，從而實現(xiàn)特異性定性或定量檢測特定的抗原或抗體。因顯 色技術(shù)的不同免疫層析可分為免疫膠體金層析技術(shù)、免疫酶標(biāo)層析技術(shù)、免疫熒光層析技 術(shù)等。HNL免疫層析技術(shù)與上述其他HNL定量技術(shù)相比具有操作方便和檢測快速等優(yōu)點，但 其缺點也很明顯。熒光免疫層析由于熒光染料易發(fā)生衰退或淬滅影響產(chǎn)品穩(wěn)定性;熒光乳 膠顆粒的缺點是熒光染料系物理摻雜，容易發(fā)生泄漏，同時高分子乳膠顆粒的表面修飾方 法有限且多數(shù)具有疏水性，從而易發(fā)生非特異性吸附。免疫膠體金技術(shù)采用物理吸附的方 法結(jié)合，抗原或抗體易從金納米顆粒表面脫落下來，導(dǎo)致標(biāo)記物不穩(wěn)定，從而影響檢測性 能。
[0005] 近年來，以上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料(up-converting phosphor，UCP)為顯示劑的免疫層析 上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)(up-converting phosphor technology，UPT)是目前該領(lǐng)域的一個研究開 發(fā)熱點。UCP由主基質(zhì)（host matrix)、吸收子(absorber)和發(fā)射子(emitter)三部分組成， 通常由稀土金屬元素?fù)诫s于晶體的晶格中構(gòu)成。UCP具有上轉(zhuǎn)發(fā)光現(xiàn)象，在紅外光激發(fā)下發(fā) 射可見光。由于無背景干擾、穩(wěn)定性好、無悴滅、環(huán)境友好和生物相容性好等優(yōu)異性能，UCP 作為示蹤劑已應(yīng)用于多種P0CT檢測系統(tǒng)中。中國專利(ZL201220497401)公開了一種HNL檢 測的上轉(zhuǎn)發(fā)光快速定量裝置，該技術(shù)部分克服了目前HNL檢測技術(shù)的不足但不能區(qū)分測定 不同分子形式HNL，從而限制了該方法的臨床應(yīng)用潛力。
[0006] 以上HNL定量方法雖有各自的優(yōu)點但都存在一嚴(yán)重不足，即不能有效區(qū)分測定和 同步測定不同分子形式HNL。而HNL的分子存在形式與疾病具有顯著相關(guān)性，不同分子形式 HNL預(yù)示不同的病理過程。因此，區(qū)分測定不同分子形式HNL技術(shù)具有重要的實驗室研究和 將來臨床應(yīng)用價值。而目前并沒有聯(lián)合同步定量快速檢測HNL的技術(shù)公開。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種同步聯(lián)合定量檢測不 同分子形式人中性粒細(xì)胞脂質(zhì)運載蛋白（HNL)的免疫層析裝置及其制備方法，該裝置基于 上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)(up-converting phosphor technology，UPT)和免疫層析技術(shù)。該發(fā)明與 現(xiàn)有技術(shù)相比最大的優(yōu)點是快速同步定量單體、同二聚體及異二聚體三種分子形式HNL。該 裝置具有樣品前處理簡單、樣品用量少、檢測過程方便和快速、靈敏度和特異性高等優(yōu)點。
[0008] 為了實現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案:一種同步聯(lián)合定量檢測不同分子 形式人中性粒細(xì)胞脂質(zhì)運載蛋白（HNL)的免疫層析裝置，由樣品稀釋液凍干粉、標(biāo)準(zhǔn)品凍干 粉及免疫層析試紙條組成；所述的樣品稀釋液凍干粉是將20mL、pH = 7.2~7.5,含150~ 250mmol/L NaCl、0 ? 25~0 ? 5% (vol/vol)Tween-20、0 ? 5%~2% (wt/vol)BSA的50~100mM HEPES緩沖液經(jīng)機(jī)械或磁力攪拌充分后，采用0.22wii或0.45wii濾器進(jìn)行過濾除菌后凍干獲 得;所述標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉是400yg/mL的單體、同二聚體或異二聚體三種分子形式HNL的pH = 7.2~7.4、10mm〇l/L的PBS緩沖溶液10yL凍干獲得;所述免疫層析試紙條由襯板、兩層濾血 膜、樣品流動墊、UCP結(jié)合墊、分析膜和吸收墊組成;兩層濾血膜分為前置濾血膜和后置濾血 膜，兩層濾血膜、樣品流動墊、UCP結(jié)合墊、分析膜和吸收墊從前至后順次搭接粘貼于襯板 上，常規(guī)方法組裝或用塑料殼進(jìn)行封裝;所述濾血膜經(jīng)濃度為0.0~lOwnol/L的fMLP(N-甲 酰-L-甲硫氨酰-L-白氨酰-L苯丙氨酸)溶液和7.0~28.5U/mL的肝素鈉溶液浸泡濕潤后晾 干得到;所述UCP結(jié)合墊包被能同時識別單體、同二聚體和異二聚體三種分子形式人中性粒 細(xì)胞脂質(zhì)運載蛋白（HNL)的UCP標(biāo)記的抗三種分子形式HNL抗體，所述UCP粒徑為400~ 600nm;所述分析膜上設(shè)有平行的三個檢測區(qū)（T1、T2和T3)和一個質(zhì)控區(qū)（C)，所述三個檢測 區(qū)依次包被抗基質(zhì)金屬蛋白酶-9 (MMP-9)抗體、抗單體HNL抗體和抗同二聚體HNL抗體，所述 抗體針對的抗原為人源HNL;質(zhì)控區(qū)（C)包被抗UCP標(biāo)記抗體來源動物免疫球蛋白的抗體;所 述襯板用于支撐兩層濾血膜、樣品流動墊、UCP結(jié)合墊、分析膜和吸收墊的組裝，所述兩層濾 血膜用于增加樣品的上樣量、有效實現(xiàn)樣品中雜質(zhì)過濾及實現(xiàn)本發(fā)明用于全血樣品的分 析，所述樣品流動墊用于銜接濾血膜和UCP結(jié)合墊，所述UCP結(jié)合墊用于結(jié)合UCP標(biāo)記抗體， 所述分析膜用于檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的設(shè)置從而實現(xiàn)HNL的定量，所述吸收墊用于收集分析后 的樣品溶液。
[0009] 具體制備方法如下：
[0010] 1)試劑的制備
[0011] a)樣品稀釋液凍干粉
[0012] 將20mL、pH = 7.2~7.5,含 150~250mmol/L NaCl、0.25~0.5%(vol/vol)Tween-20、0.5%~2% (wt/vol)BSA的50~100mM HEPES緩沖液經(jīng)機(jī)械或磁力攪拌充分后，樣品稀 釋液采用0.22mi或0.45mi濾器進(jìn)行過濾除菌，凍干后室溫保存。
[0013] 樣品稀釋液凍干粉使用前加入20mL去離子水充分溶解后獲得樣品稀釋液。
[0014] b)標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉
[0015] 400yg/mL的單體、同二聚體或異二聚體三種分子形式HNL的pH= 7.2~7.4、 10mm〇l/L的PBS緩沖溶液10yL凍干獲得；
[0016] 標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉使用前加入lOiiL去離子水充分溶解后獲得標(biāo)準(zhǔn)品母液。
[0017] c)HNL 和 MMP-9 蛋白
[0018] HNL和MMP-9蛋白采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)制備和/或通過商業(yè)途徑獲得。單體HNL為利 用原核表達(dá)載體和真核表達(dá)載體在相應(yīng)宿主細(xì)胞表達(dá)純化獲得或為商品化的HNL (Biophys ? Res ? Commun ? 1994，202:1468-1475; Sigma公司的SRP6465)。同二聚體HNL和異二 聚體HNL從人血液中分離獲得，具體是將血液血沉棕黃層自然沉降去除紅細(xì)胞后獲得粒細(xì) 胞，粒細(xì)胞經(jīng)氮氣空化破碎獲得粒細(xì)胞顆粒，然后酸裂解顆粒后進(jìn)行分離純化 (Scand.J.Clin.Lab.Invest.1994,54(5):365-376；J.Biol.Chem.268(14):10425-10432.)。麗?-9蛋白為利用原核表達(dá)載體和真核表達(dá)載體在相應(yīng)宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)純化獲得 或為商品化的MMP-9(Protein Expr? Purif ? 2010，72:87-94;Protein Expr? Purif ? 2016， 126:42-48; R&D公司的M8945等）。
[0019] d)抗特定分子開$SHNL抗體
[0020] 抗HNL抗體(包括抗單體HNL抗體、抗同二聚體HNL抗體及抗異二聚體HNL抗體)為商 品化的抗體或以HNL為抗原通過常規(guī)抗體制備技術(shù)制備的抗HNL抗體(如Abeam的ab63929或 P&M Venge Diagnostics Development公司的HNL mab 697等）；以上抗體經(jīng)單體HNL，同二 聚體HNL或異二聚體HNL抗原篩選獲得針對特定分子形式的抗HNL的抗體。
[0021] e)MMP_9抗體和質(zhì)控區(qū)包被用抗體
[0022] MMP-9抗體和質(zhì)控區(qū)包被用抗體采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)制備和/或通過商業(yè)途徑獲 得(Sigma公司的HPA001238、AMAB90805等KMMP-9抗體為以人MMP-9為抗原制備的多克隆抗 體或單克隆抗體;質(zhì)控區(qū)包被是抗UCP標(biāo)記抗體來源動物免疫球蛋白的抗體，如兔抗鼠IgG 抗體或羊抗鼠IgG抗體或其他動物來源的抗鼠IgG抗體或抗兔IgG，具體由UCP標(biāo)記的抗體種 類而定。
[0023] f)抗體溶液的制備
[0024] 抗體溶液(包括抗HNL抗體溶液或抗MMP9抗體溶液或質(zhì)控區(qū)抗UCP標(biāo)記抗體來源動 物免疫球蛋白的抗體溶液)是將抗體溶于抗體緩沖液后制備得到;抗體溶液中抗體濃度為 lmg/mL;抗體緩沖液為含1 % (vol/vol)甲醇、pH=8 ?0的 100mM Tris-HCL溶液，或pH=7 ? 2~ 7.4的 10mmol/L PBS緩沖液。
[0025] g)UCP標(biāo)記的抗體溶液的制備
[0026] UCP為實驗室合成的或商品化的平均粒徑為400~600nm的經(jīng)二氧化硅包被和表面 功能化修飾的由稀土金屬元素所構(gòu)成的晶體材料(Anal. Biochem. 2001，293(1):22-30;US patant 1997，5:674-698) ;UCP與抗HNL抗體共價鏈接形成UCP標(biāo)記的抗體。
[0027] UCP標(biāo)記的抗體溶液具體制備步驟如下：
[0028] (a)取平均直徑為400~600nm的表面硅烷化和羧基化修飾的UCP(NaYF4:Er，Yb或 其他組分的UCP材料)懸浮液(5mg/mL)lmL加入離心管中13000rpm離心10min，棄上清；
[0029] (b)向所得沉淀中加入lmL DMS0-MES緩沖液(含33%(V/V)DMS0，10mM MES的水溶 液)輕微混勻后進(jìn)行超聲處理(超聲條件為:20kHz，320W，每次超聲15s，停15s，一共3次）；
[0030] (C)再于 13000rpm 離心 10min，棄上清；
[0031] (d)重復(fù)步驟(b)和(c)兩次；
[0032] (e)向所得沉淀中加入0.8mL DMS0-MES緩沖液輕微混勻后進(jìn)行超聲處理(超聲條 件為:20kHz，320W，每次超聲15s，停15s，一共3次）；
[0033] (f)加入新配制的40yL、30mM的羧基活化試劑EDC(l-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳 二亞胺鹽酸鹽)和40yL、30mM的蛋白交聯(lián)劑Sulfo-NHS(N-羥基硫代琥珀酰亞胺），然后渦旋 震蕩混勾；
[0034] (g)在冰浴中進(jìn)行超聲處理(超聲條件為：20kHz，320W，每次超聲15s，停15s，一共 60次）；
[0035] (h)13000rpm 離心 lOmin，棄上清；
[0036] (i)加入 1.2mL DMSO-MES緩沖液(含33%(V/V)DMS0，10mM MES的水溶液）輕微混勻 后進(jìn)行超聲處理(超聲條件為:20kHz，320W，每次超聲15s，停15s，一共3次）；
[0037] (j) 13000rpm 離心10min，棄上清；
[0038] (k)重復(fù)步驟(i)和(j)3次；
[0039] (1)加入lmL DMS0-MES緩沖液(含33%(V/V)DMS0，10mM MES的水溶液)輕微混勻后 進(jìn)行超聲處理(超聲條件為:20kHz，320W，每次超聲15s，停15s，一共3次）；
[0040] (m)往上述UCP懸浮液液加入0.5mL、lmg/mL的抗HNL抗體溶液，顛倒混勻室溫孵育 3h，孵育過程中確保UCP不沉淀；
[0041 ] (n)加入150iiL pH=ll的2M甘氨酸緩沖液后進(jìn)行超聲處理混勻（超聲條件為： 20沾^，3201，每次超聲158，停158，一共3次）；
[0042] (〇) l3〇OOrpm 離心10min，棄上清；
[0043] (p)加入5mL UCP標(biāo)記抗體保存液（25mmol/L的甘油、0 ? 02% (vol/vol )Triton和 0.1%(wt/vol)NaN3的水溶液），進(jìn)行超聲處理混勻（超聲條件為：20kHz，320W，每次超聲 15s，停 15s，一共 3次）；
[0044] (q)過夜后重復(fù)步驟(〇)和(p)-次；
[0045] (r)13000rpm 離心 10min，棄上清；
[0046] (s)向所得沉淀中加入含有25mmol/L甘油、0 ? 02% (vol/vol )Triton_100和0 ? 1 % (wt/vo 1) NaN3的水溶液，混勻獲得UCP標(biāo)記的抗體溶液。
[0047] 2)免疫層析試紙條的制備
[0048] a)濾血膜
[0049]濾血膜材料為玻璃纖維素膜或具有類似性質(zhì)的膜材料，上下兩層相互錯開搭接， 經(jīng)濃度為0.0~lOwnol/L fMLP溶液和7.0~28.5U/mL肝素鈉溶液浸泡后晾干備用。
[0050] b)樣品流動墊
[0051] 樣品流動墊材料為高親水性的玻璃纖維或具有類似性質(zhì)的膜材料，用于銜接濾血 膜和UCP結(jié)合墊。
[0052] c)UCP 結(jié)合墊
[0053] UCP結(jié)合墊為硝酸纖維素膜或具有類似性質(zhì)的膜材料，按0.25~0.5mL/cm2的量將 濃度為lmg/mL的UCP標(biāo)記的抗體溶液均勻加在UCP結(jié)合墊上，30 °C~35 °C干燥。
[0054] d)分析膜T/C區(qū)制備
[0055] 分析膜材料為硝酸纖維素膜或具有類似性質(zhì)的膜材料;利用手工方法或?qū)Ｓ玫狞c 樣儀在分析膜上從濾血膜往吸收墊方向依次均勻噴涂抗基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP_9)抗體溶 液(T1)、抗單體HNL抗體溶液(T2)、抗同二聚體HNL抗體溶液(T3)及抗UCP標(biāo)記抗體來源動物 免疫球蛋白的抗體溶液(C)，所用抗體濃度為lmg/mL，最終噴涂量為0.025~0.05mL/mm，相 當(dāng)于每毫米T/C線噴涂25ng~50ng抗體;各線之間的間距根據(jù)UCP讀數(shù)儀檢測窗口設(shè)定，瞭 干備用。
[0056] e)吸收墊
[0057]吸收墊為吸水濾紙或具有類似功能的材料。
[0058] f)襯板
[0059] 襯板的材料為具有自粘貼性質(zhì)聚氯乙烯膠板或具有類似功能的材料。
[0060] g)試紙條組裝
[0061] 將襯板、兩層濾血膜濾、UCP結(jié)合墊、樣品流動墊、分析膜及吸收墊按常規(guī)方法進(jìn)行 組裝，進(jìn)一步可用塑料殼進(jìn)行封裝。
[0062] 3)裝置的使用
[0063]首先將標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉加入10此去離子水充分溶解后制得標(biāo)準(zhǔn)品母液，然后用樣品 稀釋液對標(biāo)準(zhǔn)品母液進(jìn)行2倍法梯度稀釋獲得不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品梯度濃度溶液，取50~150 yL標(biāo)準(zhǔn)品梯度濃度溶液加入水平放置的免疫層析裝置的加樣孔(加樣孔為前置濾血膜或位 于前置濾血膜上對應(yīng)塑料殼預(yù)留缺口的位置）；在15~20min內(nèi)利用UPT讀數(shù)儀對相應(yīng)的T1、 T2和T3帶進(jìn)行掃描讀數(shù)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品峰面積讀數(shù)(AUC)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0064] 然后將待測的血清、血漿、尿樣或全血樣品經(jīng)樣品稀釋液稀釋5~200倍后，取50~ 150yL加入水平放置的免疫層析裝置的加樣孔;在15~20min內(nèi)利用UPT讀數(shù)儀對相應(yīng)的T1、 T2、和T3帶進(jìn)行掃描讀數(shù)，然后根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行不同樣本中不同分子形式NGAL的 定量。
【附圖說明】
[0065] 圖1為本發(fā)明一種同步聯(lián)合定量檢測不同分子形式人中性粒細(xì)胞脂質(zhì)運載蛋白 (HNL)免疫層析裝置的UCP免疫層析試紙條的剖面示意圖。其中1和2分別為前置和后置的濾 血膜、3為樣品流動墊、4為UCP結(jié)合墊、5為分析膜、6為吸收墊、7為襯板、8為UCP結(jié)合墊中包 被的UCP標(biāo)記的抗三種分子形式HNL抗體、9為檢測區(qū)T1 (包被抗MMP-9抗體）、10為檢測區(qū)T2 (包被抗單體HNL抗體）、11為檢測區(qū)T3(包被抗同二聚體HNL抗體）、12為質(zhì)控區(qū)C(包被抗UCP 標(biāo)記抗體來源動物免疫球蛋白的抗體）。其中各部分按圖1順序首尾重疊(2~5mm)搭接然后 粘于襯板上。
[0066] 圖2為實施例2所述分析膜的結(jié)構(gòu)示意圖。分析膜為啞鈴型（啞鈴型分析膜可提高 檢測的靈敏度），中部寬度為4mm,兩端寬度為5mm;兩端為等腰梯形，梯形高度為2mm;其中 T1、T2及T3為檢測區(qū)部位，C為質(zhì)控區(qū)部位;T1離分析膜前端10mm，T2離分析膜前端15mm，T3 離分析膜前端20mm，C離分析膜前端25mm; T1、T2、T3及C分別包被抗MMP-9抗體、抗單體HNL抗 體、抗同二聚體HNL抗體及抗鼠IgG抗體。
[0067]圖3為實施例3方法繪制的不同濃度三種分子形式HNL對應(yīng)UCP峰面積(AUC)的標(biāo)準(zhǔn) 曲線。該標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)表1數(shù)繪制，其中橫坐標(biāo)是不同分子形式HNL的濃度，縱坐標(biāo)是峰面 積；圖3左圖是根據(jù)表1異二聚體HNL濃度與H(l st)和Tl(2nd)的平均值繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖3 中圖是根據(jù)表1單體HNL濃度與T2(l st)和T2(2nd)的平均值繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖3右圖是根據(jù) 表1同二聚體HNL濃度與T3(l st)和T3(2nd)的平均值繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖中所列數(shù)學(xué)公式是 對應(yīng)趨勢線的公式用于實際樣品各種HNL濃度計算；圖中所列R 2值是對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的趨勢 線的相關(guān)系數(shù)平方。
[0068]圖4為實施例4異二聚體、單體及同二聚體HNL在健康對照、病毒感染及細(xì)菌感染患 者尿樣中的濃度。圖4是根據(jù)表2峰下面積(AUC)數(shù)據(jù)并利用圖3標(biāo)準(zhǔn)曲線的趨勢線公式計算 出各種分子形式HNL的濃度;然后將不同分子形式HNL濃度根據(jù)對應(yīng)樣本來源特征分組，繪 制得到圖4。圖4由醫(yī)學(xué)統(tǒng)計軟件MedCal c (版本13.0.0.0.0)繪制的Box-wh i sker圖，其中每 個"〇"、"A" ""代表一個樣品。
【具體實施方式】
[0069] 下面將用實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。本發(fā)明實施例是用于本發(fā)明的進(jìn)一步解釋而 不是對本發(fā)明的限定。根據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)進(jìn)行的具體改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0070] 實施例1: 一種同步聯(lián)合定量檢測不同分子形式人中性粒細(xì)胞脂質(zhì)運載蛋白（HNL) 免疫層析裝置組成及保存
[0071] 1)裝置的組成:樣品稀釋液凍干粉1瓶、UCP免疫層析試紙條若干、標(biāo)準(zhǔn)品溶液凍干 粉1套；
[0072] 2)裝置的保存條件:室溫保存。
[0073]實施例2: -種同步聯(lián)合定量檢測不同分子形式人中性粒細(xì)胞脂質(zhì)運載蛋白（HNL) 免疫層析裝置的UPT免疫層析試紙條的制備 [0074] 1)溶液配制
[0075] a)fMLP溶液配制
[0076] 先將fMLP(購自Sigma公司）溶于二甲基亞砜(DMS0)配制成50mM的儲存液，然后用 pH=7.4的50mM HEPES溶液將50mM fMLP存儲液稀釋成5wnol/L的fMLP溶液。
[0077] b)肝素鈉溶液配制
[0078] 將肝素鈉（購自Sigma公司）溶于50mM HEPES(pH 7.4)溶液，配制成141]/11^的肝素 鈉溶液。
[0079] c)抗體溶液配制
[0080] 抗MMP-9多克隆抗體(購自abeam公司，ab5707)，抗三種分子形式人HNL單克隆抗體 (以人同二聚體HNL為抗原免疫小鼠制備的單克隆抗體，能與三種分子形式HNL進(jìn)行抗原抗 體反應(yīng)，該抗體記作anti-HNL Ab 1)，抗單體HNL抗體(購自abcam，abl25075，該抗體記作 anti-HNL Ab2)，抗同二聚體抗體（以人同二聚體HNL為抗原免疫小鼠制備的單克隆抗體，與 單體和異二聚體HNL沒有交叉反應(yīng)，該抗體記作anti-HNL Ab 3);以上抗MMP-9抗體、anti-HNL Ab2及anti-HNL Ab3分別溶解在含l%(vol/vol)甲醇的pH=8.0、100mM Tris-HCL溶液 中，抗體的濃度為lmg/mL;anti-HNL Abl溶解在pH=7.4的PBS緩沖液中，濃度為lmg/mL。 [0081 ] d)UCP標(biāo)記的抗體溶液的制備
[0082] (a)取平均直徑為400nm的表面硅烷化和羧基化修飾的UCP(NaYF4:Er，Yb)懸浮液 (5mg/mL) lmL加入離心管中13000rpm離心1 Omin，棄上清；
[0083] (b)向所得沉淀中加入lmL DMS0-MES緩沖液(含33%(V/V)DMS0，10mM MES的水溶 液)輕微混勻后進(jìn)行超聲處理(超聲條件為:20kHz，320W，每次超聲15s，停15s，一共3次）；
[0084] (c)再于 13000rpm 離心 lOmin，棄上清；
[0085] (d)重復(fù)步驟(b)和(c)兩次；
[0086] (e)向所得沉淀中加入0.8mL DMS0-MES緩沖液輕微混勻后進(jìn)行超聲處理(超聲條 件為:20kHz，320W，每次超聲15s，停15s，一共3次）；
[0087] (f)加入新配制的40yL、30mM的羧基活化試劑EDC(l-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基 碳二亞胺鹽酸鹽)和40yL、30mM的蛋白交聯(lián)劑Sulf〇-NHS(N-羥基硫代琥珀酰亞胺），然后渦 旋震蕩混勻；
[0088] (g)在冰浴中進(jìn)行超聲處理(超聲條件為：20kHz，320W，每次超聲15s，停15s，一共 60次）；
[0089] (h)13000rpm 離心 lOmin，棄上清；
[0090] (i)加入 1.2mL DMS0-MES緩沖液(含33%(V/V)DMS0，10mM MES的水溶液）輕微混勻 后進(jìn)行超聲處理(超聲條件為:20kHz，320W，每次超聲15s，停15s，一共3次）；
[0091] (j) 13000rpm 離心 lOmin，棄上清；
[0092] (k)重復(fù)步驟(i)和(j)3次；
[0093] (1)加入1!1^01^0-]\^5緩沖液(含33%(￥〇1八〇1)01^0，1011111^5的水溶液)輕微混 勻后進(jìn)行超聲處理(超聲條件為:20kHz，320W，每次超聲15s，停15s，一共3次）；
[0094] (m)往上述UCP懸浮液液加入0.5mL、lmg/mL的anti-HNL Abl溶液，顛倒混勻室溫孵 育3h，孵育過程中確保UCP不沉淀；
[0095] (n)加入150yL pH=ll的2M甘氨酸緩沖液后進(jìn)行超聲處理混勻（超聲條件為： 20沾^，3201，每次超聲158，停158，一共3次）；
[0096] (〇) 13000rpm 離心10min，棄上清；
[0097] (p)加入5mL UCP標(biāo)記抗體保存液（25mmol/L的甘油、0 ? 02% (vol/vol )Triton和 0.1 % (wt/vol )NaN3的水溶液，進(jìn)行超聲處理混勻(超聲條件為:20kHz，320W，每次超聲15s， 停15s，一共3次）；
[0098] (q)過夜后重復(fù)步驟(〇)和(p)-次；
[0099] (r)13000rpm 離心 10min，棄上清；
[0100] (s)向所得沉淀中加入含有25mmol/L甘油、0 ? 02% (vol/vol )Triton_100和0 ? 1 % (wt/vo 1) NaN3的水溶液，混勻獲得UCP標(biāo)記的抗體溶液。
[0101] 2)UPT免疫層析試紙條的制備 [0102] a)濾血膜制備
[0103]濾血膜材料為玻璃纖維素膜(Whatman，LFl)，由上下兩層3/4錯開組成;將前沿層 和后續(xù)層玻璃纖維素膜經(jīng)14U/mL肝素鈉溶液浸泡濕潤后晾干備用;兩層濾血膜尺寸均為為 10mm 長，5mm 寬。
[0104] b)樣品流動墊制備
[0105] 樣品流動墊材料為高親水性的玻璃纖維素膜（Milipore，Hi-FlowTMPlus membrane，HF 075)，用于銜接濾血膜和UCP結(jié)合墊;尺寸為10mm長，5mm寬；樣品流動墊前端 2mm搭在濾血膜上，流動墊后端2mm搭在UCP結(jié)合墊上。
[0106] c)UCP 結(jié)合墊
[0107] UCP結(jié)合墊為玻璃纖維素膜（Milipore，SureWick?Pad Materials，G028)，按 0.5mL/cm2的量將濃度為lmg/mL的UCP標(biāo)記的anti-HNL Ab 1抗體溶液均勾加在UCP結(jié)合墊 上，30 °C干燥;然后裁剪成8mm長、5mm寬；其前端2mm長搭在樣品流動墊下，其后端2mm長搭在 分析膜上。
[0108] c)分析膜T/C線制備
[0109] 分析膜材料為硝酸纖維素膜(11111?證6 4￡99，120~1608/4〇11);借助微量移液器 利用手工方法在分析膜上從濾血膜往吸收墊方向依次均勻噴涂抗基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP- 9)抗體(T1)溶液、抗單體HNL抗體(T2)溶液、抗同二聚體HNL抗體(T3)溶液及抗鼠IgG抗體 (C)溶液，所用抗體濃度為lmg/mL，最終噴涂量為0.05mL/mm，相當(dāng)于每毫米T/C線噴涂50ng 抗體;T1區(qū)離分析膜前端10mm，T2區(qū)離分析膜前端15mm，T3區(qū)離分析膜前端20mm，C區(qū)離分析 膜前端25mm;將分析膜按【附圖說明】圖2尺寸裁剪;分析膜前端2mm長搭在UCP結(jié)合墊下，后端 2mm長搭在吸收墊下。
[0110] d)吸收墊
[0111] 吸收墊材料為吸水濾紙(Whatman，CF4);尺寸為長25mm，寬5mm);吸收墊前端2mm長 搭在分析膜上。
[0112] e)襯板
[0113] 襯板的材料為具有自粘貼性質(zhì)聚氯乙烯膠板或具有類似功能的材料。
[0114] f)試紙條組裝
[0115] 將襯板、兩層濾血膜濾、UCP結(jié)合墊、樣品流動墊、分析膜及吸收墊按【附圖說明】圖1 次序進(jìn)行組裝，進(jìn)一步用塑料殼進(jìn)行封裝。
[0116] 實施例3: -種同步聯(lián)合定量檢測不同分子形式人中性粒細(xì)胞脂質(zhì)運載蛋白（HNL) 免疫層析裝置的標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0117] 1)溶液配制
[0118] a)樣品稀釋液配制
[0119] 樣品稀釋液由樣品稀釋液凍干粉稀釋獲得。
[0120] 樣品稀釋液凍干粉為20mL、pH 7.2的含200臟〇1/1恥(：1、0.5%(￥〇1八〇1奵￥6611-20、1 % (wt/vol )BSA的100mmol/L HEPES溶液經(jīng)磁力攪拌充分，采用0.22_ol/L濾器進(jìn)行過 濾除菌后凍干得到。樣品稀釋液是向上述樣品稀釋液凍干粉加20mL去離子水混勻獲得。
[0121 ] b)HNL標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度溶液配制
[0122 ] HNL標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度溶液母液由標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉加去離子水獲得。標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉含 400yg/mL的單體、同二聚體、或異二聚體HNL的pH = 7.2的10mmol/L的roS緩沖溶液各10此， 凍干獲得。
[0123] HNL標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度溶液具體制備步驟如下：
[0124] (a)向上述各標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉中加10此去離子水混勻獲得標(biāo)準(zhǔn)品母液，向標(biāo)準(zhǔn)品母 液中加入990此樣品稀釋液混勻后標(biāo)記為S單、S同及S異。
[0125] (b)取 7 個離心管分別標(biāo)記為 S1、S2、S3、S4、S5、S6&S7。
[0126] (c)在S1管中加S單、S同及S異溶液各0.5mL，然后加入樣品稀釋液0.5mL，渦旋震蕩混 勻。
[0127] (c)取S1管中l(wèi)mL溶液至S2管，然后加lmL樣品稀釋液至S2后渦旋震蕩混勻。
[0128] (d)取S2管中l(wèi)mL溶液至S3管，然后加lmL樣品稀釋液至S3后渦旋震蕩混勻。
[0129] (e)取S3管中l(wèi)mL溶液至S4管，然后加lmL樣品稀釋液至S4后渦旋震蕩混勻。
[0130] (f)取S4管中l(wèi)mL溶液至S5管，然后加lmL樣品稀釋液至S5后渦旋震蕩混勻。
[0131] (g)取S5管中l(wèi)mL溶液至S6管，然后加lmL樣品稀釋液至S6后渦旋震蕩混勻。
[0132] (h)加lmL樣品稀釋液至S7管。
[0133] 2)UPT免疫層析測定HNL濃度
[0134] (a)將7支實施例2制備的HNL UPT免疫層析試紙條置于水平桌面上并標(biāo)上U7、U6、 1]5、1]4、1]3、1]2和譏；
[0135] (b)依次取 37、36、35、34、33、32及31管中溶液100此加至對應(yīng)的1]7、1]6、1]5、1]4、1]3、 U2和U1免疫試紙條加樣孔。
[0136] 3)等待15分鐘后，依次對1]7、1]6、1]5、1]4、1]3、1]2及1]1上的分析膜的1'1、了2及了3進(jìn)行 UPT讀數(shù)，采集峰面積(AUC)，分別記作Tl(l st)、T2ast^T3ast)。
[0137] 4)重復(fù)步驟2)和3)，采集峰面積(AUC)，分別記作Tl(2nd)、T2(2 nd)和T3(2nd)。
[0138] 5)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0139] 表1是本實施例HNL標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度溶液與對應(yīng)的UPT讀數(shù)的峰面積(AUC)。其中T1 是指異二聚體HNL的AUC數(shù)值、T2是單體HNL的AUC數(shù)值、T3是同二聚體的AUC數(shù)值；l sm2n<^ 指兩次實驗結(jié)果。
[0140] 表1:標(biāo)準(zhǔn)樣品的UCP讀數(shù)
[0143] 根據(jù)表1兩次（ls4P2nd)UPT讀數(shù)的峰面積(AUC)的平均值與對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度，繪 制不同濃度三種分子形式HNL對應(yīng)UCP峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖3。
[0144] 實施例4:一種同步聯(lián)合定量檢測不同分子形式人中性粒細(xì)胞脂質(zhì)運載蛋白（HNL) 免疫層析裝置用于急性細(xì)菌感染、病毒感染及正常對照組尿樣中三種分子形式HNL濃度定 量
[0145] 本實例采用實施例2制備的UPT免疫層析試紙條和實施例3的操作步驟，對臨床尿 液樣本進(jìn)行稀釋后用本發(fā)明方法進(jìn)行三種分子形式HNL的定量。
[0146] 1)尿樣稀釋方法如下：
[0147] (a)取1.5mL離心管若干并做好標(biāo)記。
[0148] (b)取360yL樣品稀釋液至每個1.5mL離心管中，加入40yL尿樣，渦旋震蕩混勻。
[0149] 2)結(jié)果
[0150] 表2:為尿液樣本中不同分子形式HNL的UPT峰下面積(AUC)讀數(shù)
[0153]圖4是本實施例采用實施例3方法建立的UPT HNL免疫試紙條的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過該 標(biāo)準(zhǔn)曲線上趨勢線公式和表2數(shù)據(jù)可計算得出健康對照組、患流行性感冒組及細(xì)菌性炎癥 患者組的尿液樣本中不同分子形式HNL的濃度。
【主權(quán)項】
1. 一種同步聯(lián)合定量檢測不同分子形式人中性粒細(xì)胞脂質(zhì)運載蛋白（HNL)的免疫層析 裝置，其特征在于：由樣品稀釋液凍干粉、標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉及免疫層析試紙條組成;所述免疫 層析試紙條由襯板、兩層濾血膜、樣品流動墊、UCP結(jié)合墊、分析膜和吸收墊組成;兩層濾血 膜分為前置濾血膜和后置濾血膜，兩層濾血膜、樣品流動墊、UCP結(jié)合墊、分析膜和吸收墊從 前至后順次搭接粘貼于襯板上，常規(guī)方法組裝或用塑料殼進(jìn)行封裝;所述濾血膜經(jīng)濃度為 O. O~ΙΟμ mol/L的fMLP溶液和7.0~28.5U/mL的肝素鈉溶液浸泡濕潤后晾干得到；所述UCP 結(jié)合墊包被能同時識別單體、同二聚體和異二聚體三種分子形式人中性粒細(xì)胞脂質(zhì)運載蛋 白HNL的UCP標(biāo)記的抗三種分子形式HNL抗體;所述分析膜上設(shè)有平行的三個檢測區(qū)Tl、T2、 Τ3和一個質(zhì)控區(qū)C，所述三個檢測區(qū)依次包被抗基質(zhì)金屬蛋白酶-9抗體、抗單體HNL抗體和 抗同二聚體HNL抗體，所述抗體針對的抗原為人源HNL;質(zhì)控區(qū)C包被抗UCP標(biāo)記抗體來源動 物免疫球蛋白的抗體;所述襯板用于支撐兩層濾血膜、樣品流動墊、UCP結(jié)合墊、分析膜和吸 收墊的組裝。2. 如權(quán)利要求1所述的一種同步聯(lián)合定量檢測不同分子形式人中性粒細(xì)胞脂質(zhì)運載蛋 白（HNL)的免疫層析裝置，其特征在于:所述的樣品稀釋液凍干粉是將20mL、pH=7.2~7.5， 含 150~250mmol/L NaCl、0.25~0.5%(丫〇1八〇1)?。?611-20、0.5%~2%(￥七八〇1)85厶的50 ~IOOmM HEPES緩沖液經(jīng)機(jī)械或磁力攪拌充分后，采用0.22μπι或0.45μπι濾器進(jìn)行過濾除菌 后凍干獲得。3. 如權(quán)利要求1所述的一種同步聯(lián)合定量檢測不同分子形式人中性粒細(xì)胞脂質(zhì)運載蛋 白（HNL)的免疫層析裝置，其特征在于:所述標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉是400yg/mL的單體、同二聚體或 異二聚體三種分子形式HNL的pH=7.2~7.4、lOmmol/L的PBS緩沖溶液IOyL凍干獲得。4. 如權(quán)利要求1所述的一種同步聯(lián)合定量檢測不同分子形式人中性粒細(xì)胞脂質(zhì)運載蛋 白（HNL)的免疫層析裝置，其特征在于：上轉(zhuǎn)發(fā)光材料UCP為平均粒徑為400~600nm的經(jīng)二 氧化硅包被和表面功能化修飾的由稀土金屬元素所構(gòu)成的晶體材料。5. 如權(quán)利要求1所述的一種同步聯(lián)合定量檢測不同分子形式人中性粒細(xì)胞脂質(zhì)運載蛋 白（HNL)的免疫層析裝置，其特征在于:首先將標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉加入IOyL去離子水充分溶解后 制得標(biāo)準(zhǔn)品母液，然后用樣品稀釋液對標(biāo)準(zhǔn)品母液進(jìn)行2倍法梯度稀釋獲得不同濃度的標(biāo) 準(zhǔn)品梯度濃度溶液，取50~150yL標(biāo)準(zhǔn)品梯度濃度溶液加入水平放置的免疫層析裝置的加 樣孔，加樣孔為前置濾血膜或位于前置濾血膜上對應(yīng)塑料殼預(yù)留缺口的位置;在15~20min 內(nèi)利用UPT讀數(shù)儀對相應(yīng)的T1、T2和T3帶進(jìn)行掃描讀數(shù)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品峰面積讀數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線;然后將待測的血清、血漿、尿樣或全血樣品經(jīng)樣品稀釋液稀釋5~200倍后，取50~150yL 加入水平放置的免疫層析裝置的加樣孔;在15~20min內(nèi)利用UPT讀數(shù)儀對相應(yīng)的T1、T2、和 Τ3帶進(jìn)行掃描讀數(shù)，然后根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行不同樣本中不同分子形式NGAL的定量； 樣品稀釋液凍干粉使用前加入20mL去離子水充分溶解后獲得樣品稀釋液。6. 權(quán)利要求1所述的一種同步聯(lián)合定量檢測不同分子形式人中性粒細(xì)胞脂質(zhì)運載蛋白 (HNL)的免疫層析裝置的制備方法，其步驟如下： a)樣品稀釋液凍干粉的制備 將2011^、？!1 = 7.2~7.5，含150~250111111。1/1他(：1、0.25~0.5%(￥。1八。1)了￥6611-20、 0.5 %~2 % (wt/vol )BSA的50~IOOmM HEPES緩沖液經(jīng)機(jī)械或磁力攪拌充分后，樣品稀釋液 采用0 · 22μηι或0 · 45μηι濾器進(jìn)行過濾除菌，凍干后室溫保存； b) 標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉的制備 400yg/mL的單體、同二聚體或異二聚體三種分子形式HNL的pH=7 · 2~7 · 4、10mmol/L的 PBS緩沖溶液IOyL凍干獲得； c) 濾血膜的制備 濾血膜材料為玻璃纖維素膜或具有類似性質(zhì)的膜材料，前置濾血膜和后置濾血膜上下 兩層相互錯開搭接，經(jīng)濃度為0.0~lOymol/L fMLP溶液和7.0~28.5U/mL肝素鈉溶液浸泡； d) 樣品流動塾的制備 樣品流動墊材料為高親水性的玻璃纖維或具有類似性質(zhì)的膜材料，用于銜接濾血膜和 UCP結(jié)合墊； e) UCP結(jié)合墊的制備 UCP結(jié)合墊為硝酸纖維素膜或具有類似性質(zhì)的膜材料，按0.25~0.5mL/cm2的量將濃度 為lmg/mL的UCP標(biāo)記的抗體溶液均勻加在UCP結(jié)合墊上，30°C~35°C干燥； f) 分析膜T/C區(qū)的制備 分析膜材料為硝酸纖維素膜或具有類似性質(zhì)的膜材料;利用手工方法或?qū)Ｓ玫狞c樣儀 在分析膜上從濾血膜往吸收墊方向依次均勾噴涂抗基質(zhì)金屬蛋白酶-9抗體溶液、抗單體 HNL抗體溶液、抗同二聚體HNL抗體溶液及抗UCP標(biāo)記抗體來源動物免疫球蛋白的抗體溶液， 分別形成平行的三個檢測區(qū)T1、T2、T3和一個質(zhì)控區(qū)C，所用抗體濃度為lmg/mL，最終噴涂量 為0.025~0.05mL/mm，相當(dāng)于每毫米T/C線噴涂25ng~50ng抗體;各線之間的間距根據(jù)UCP 讀數(shù)儀檢測窗口設(shè)定，晾干； g) 吸收墊的制備 吸收墊為吸水濾紙或具有類似功能的材料； h) 襯板的制備 襯板的材料為具有自粘貼性質(zhì)聚氯乙烯膠板或具有類似功能的材料； i) 試紙條組裝 將襯板、兩層濾血膜濾、UCP結(jié)合墊、樣品流動墊、分析膜及吸收墊按常規(guī)方法組裝或用 塑料殼進(jìn)行封裝，從而得到一種同步聯(lián)合定量檢測不同分子形式人中性粒細(xì)胞脂質(zhì)運載蛋 白HNL的免疫層析裝置。7. 如權(quán)利要求1所述的一種同步聯(lián)合定量檢測不同分子形式人中性粒細(xì)胞脂質(zhì)運載蛋 白（HNL)的免疫層析裝置的制備方法，其特征在于:抗體溶液是將抗體溶于抗體緩沖液后制 備得到；抗體溶液中抗體濃度為lmg/mL，抗體緩沖液為含1 % (voI/vo 1)甲醇、pH= 8.0的 IOOmM Tris-HCL溶液，或pH=7.2~7.4的 10mmol/L PBS緩沖液。8. 如權(quán)利要求1所述的一種同步聯(lián)合定量檢測不同分子形式人中性粒細(xì)胞脂質(zhì)運載蛋 白HNL的免疫層析裝置的制備方法，其特征在于:UCP標(biāo)記的抗體溶液的制備步驟如下， (a) 取平均直徑為400~600nm、濃度為5mg/mL的表面硅烷化和羧基化修飾的UCP懸浮液 ImL加入離心管中13000rpm離心I Omin，棄上清； (b) 向所得沉淀中加入ImL DMSO-MES緩沖液，為含33% (V/V)DMS0和IOmM MES的水溶 液，輕微混勻后進(jìn)行超聲處理;超聲條件為20kHz、320W，每次超聲15s，停15s，一共3次； (c) 再于13000rpm離心10min，棄上清； (d) 重復(fù)步驟(b)和(C)兩次； (e) 向所得沉淀中加入0.8mL DMSO-MES緩沖液輕微混勻后進(jìn)行超聲處理； 超聲條件為20kHz、320W，每次超聲15s，停15s，一共3次； (f) 加入新配制的40yL、30mM的羧基活化試劑EDC和40yL、30mM的蛋白交聯(lián)劑Sulfo-NHS，然后渦旋震蕩混勻； (g) 在冰浴中進(jìn)行超聲處理，超聲條件為20kHz、320W，每次超聲15s，停15s，一共60次； (h) 13000rpm 離心 lOmin，棄上清； (i) 加入1.2mL DMSO-MES緩沖液，為含33% (V/V)DMS0和IOmM MES的水溶液，輕微混勻 后進(jìn)行超聲處理，超聲條件為20kHz、320W，每次超聲15s，停15s，一共3次； (j) 13000rpm 離心 IOmin，棄上清； (k) 重復(fù)步驟(i)和(j)3次； (l) 加入ImL DMSO-MES緩沖液，為含33 % (V/V)DMS0，IOmM MES的水溶液，輕微混勻后進(jìn) 行超聲處理，超聲條件為20kHz、320W，每次超聲15s，停15s，一共3次； (m) 往上述UCP懸浮液液加入0.5mL、lmg/mL的抗HNL抗體溶液，顛倒混勻室溫孵育3h，孵 育過程中確保UCP不沉淀； (η)加入150yL、pH= 11的2M甘氨酸緩沖液后進(jìn)行超聲處理混勻，超聲條件為20kHz、 320W，每次超聲15s，停15s，一共3次； (o)13000rpm離心 lOmin，棄上清； (P)加入5mL UCP標(biāo)記抗體保存液，為25mmol/L甘油、0.02% (vol/vol )Triton和0 · 1 % (WtzVol)NaN3的水溶液，進(jìn)行超聲處理混勻，超聲條件為20kHz、320W，每次超聲15s，停15s， 一共3次； (q)過夜后重復(fù)步驟(〇)和(P)-次； (!?)13000印111離心1〇111；[11，棄上清； (s)向所得沉淀中加入含有25mmol/L甘油、0 ·02% (vol/vol )Triton_100和0 · 1 % (wt/ V01) NaN3的水溶液，混勻獲得UCP標(biāo)記的抗體溶液。
【文檔編號】G01N33/558GK105911274SQ201610407218
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年6月12日
【發(fā)明人】蔡林君, 楊津, 陳雷, 趙冰, 姜春來, 孔維
【申請人】吉林大學(xué)