電致化學(xué)發(fā)光成像方法快速分析單細(xì)胞內(nèi)成分的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種電致化學(xué)發(fā)光成像方法快速分析單細(xì)胞內(nèi)成分的方法利用，魯米諾電致化學(xué)發(fā)光被首次應(yīng)用于單細(xì)胞內(nèi)生物分子(如葡萄糖)的檢測(cè)。在檢測(cè)過程中，單個(gè)細(xì)胞被直接定位在單個(gè)細(xì)胞大小的微洞電極；加入含有魯米諾、曲通100和葡萄糖氧化酶的混合溶液后，曲通100可以破壞細(xì)胞膜，釋放細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖到微洞中，和洞內(nèi)的葡萄糖氧化酶反應(yīng)生成過氧化氫；過氧化氫與魯米諾反應(yīng)在正電位下產(chǎn)生光信號(hào)。這種新發(fā)明的電化學(xué)發(fā)光測(cè)定方法將有可能被應(yīng)用于對(duì)單細(xì)胞中更多的細(xì)胞內(nèi)分子進(jìn)行快速分析，以闡明細(xì)胞間的異質(zhì)性。
【專利說明】
電致化學(xué)發(fā)光成像方法快速分析單細(xì)胞內(nèi)成分的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物儀器檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種電致化學(xué)發(fā)光成像方法快速分析單細(xì)胞內(nèi)成分的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]電化學(xué)發(fā)光是物質(zhì)發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)后形成的激發(fā)態(tài)物質(zhì)躍迀、釋放能量并誘導(dǎo)光學(xué)輻射的一個(gè)過程。與化學(xué)發(fā)光和熒光等檢測(cè)系統(tǒng)相比，電化學(xué)發(fā)光結(jié)合了電化學(xué)和光學(xué)方法，具有許多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。具體而言，與化學(xué)發(fā)光相比，電化學(xué)發(fā)光更可控，對(duì)于發(fā)射光的選擇性分離也更好;與熒光相比，電化學(xué)發(fā)光不存在激發(fā)光，這使得背景光的干擾被降到最低，從而獲得較高的靈敏度。因此，在生化分析中，電化學(xué)發(fā)光是一種強(qiáng)有力的分析工具。
[0003]眾所周知，魯米諾-過氧化氫體系能產(chǎn)生較強(qiáng)的電化學(xué)發(fā)光。在此過程中，魯米諾和過氧化氫發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生對(duì)二氮烯和其他含氧化物，并進(jìn)一步經(jīng)過高能電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，生成3-氨基鄰苯二甲酸，進(jìn)而發(fā)射光信號(hào)?？紤]到相應(yīng)的氧化酶與目標(biāo)分子反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生過氧化氫，我們?cè)谙惹暗墓ぷ髦幸肽懝檀佳趸?，利用魯米諾電化學(xué)發(fā)光，對(duì)膽固醇在單個(gè)細(xì)胞細(xì)胞膜中的含量進(jìn)行分析。為了提高分析速度，我們意識(shí)到可以使用電化學(xué)發(fā)光成像進(jìn)行平行測(cè)定，即使用電子倍增CCD(EM CCD)把多個(gè)細(xì)胞表面的過氧化氫或者活性膽固醇的發(fā)光情況記錄在一張圖像中。雖然我們的工作已經(jīng)證明了電化學(xué)發(fā)光是單細(xì)胞分析的有效方法，然而這個(gè)方法受限于分析細(xì)胞表面分子。因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)小分子波動(dòng)與細(xì)胞活性相關(guān)聯(lián)，對(duì)于生物學(xué)研究而言是相當(dāng)重要，因此如能利用電化學(xué)發(fā)光對(duì)細(xì)胞內(nèi)分子進(jìn)行，將具有重要的生物學(xué)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明目的:為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種電致化學(xué)發(fā)光成像方法快速分析單細(xì)胞內(nèi)成分的方法。
[0005]技術(shù)方案:為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明的電致化學(xué)發(fā)光成像方法快速分析單細(xì)胞內(nèi)成分的方法，待檢測(cè)的成分在對(duì)應(yīng)的氧化酶的作用下催化產(chǎn)生雙氧水，其特征在于，包括如下步驟:
[0006](I)提供表面具有若干微孔的氧化銦錫電極表面作為微電極，將該微電極作為工作電極與電化學(xué)工作站連接，銀/氯化銀和鉑電極分別作為參比電極和輔助電極，通過電沉積將金納米顆粒沉積到微電極的微孔表面；
[0007](2)以含有200-500μΜ L012的10_20mM PBS的混合溶液作為氧化銦錫片發(fā)光成像的溶液加入到微孔中，將待分析的單個(gè)細(xì)胞設(shè)置于微孔內(nèi)，加入表面活性劑和待分析成分對(duì)應(yīng)的氧化酶，使用電壓發(fā)生器施加正負(fù)交替的電壓在電極上誘使發(fā)光，然后使用電化學(xué)發(fā)光成像裝置連續(xù)采集曝光時(shí)間為60s的兩張照片，來收集來自細(xì)胞的發(fā)光信號(hào)；
[0008](3)使用Image J軟件計(jì)算兩個(gè)圖像中發(fā)光強(qiáng)度的差異，同時(shí)為了校準(zhǔn)來自ITO微孔處的發(fā)光差異，將50-100μΜ過氧化氫水溶液引入微孔內(nèi)并對(duì)微孔發(fā)光的光強(qiáng)進(jìn)行采集，在微電極的微孔內(nèi)的單個(gè)細(xì)胞的發(fā)光強(qiáng)度和加入的過氧化氫收集到的發(fā)光強(qiáng)度的比率作為信號(hào)被用于細(xì)胞內(nèi)成分的分析檢測(cè)。
[0009]其中，所述的待檢測(cè)成分可以為葡萄糖、乳酸或膽固醇中的任意一種或其他在氧化酶作用下可以產(chǎn)生雙氧水的物質(zhì)。
[0010]優(yōu)選地，步驟(I)中，所謂微電極表面設(shè)置有64-256個(gè)用于容納單個(gè)細(xì)胞的微孔。[0011 ] 所述金納米粒子的電沉積通過在含有l(wèi)-5mM HAuCl4的0.1M HCl溶液中，循環(huán)掃描得到，其中，電勢(shì)由-0.2V到0.55V，循環(huán)掃描400-800s。
[0012]所述電壓發(fā)生器施加的正負(fù)交替的電壓為lV，2s和_lV，0.5s。
[0013]步驟(2)中，所述的表面活性劑為0.1 -0.5 %的Tr i ton X-100，所述的葡萄糖氧化酶的濃度為0.l-0.5U/mL。
[0014]在本文中，電化學(xué)發(fā)光方法被首次嘗試用來分析單細(xì)胞中的物質(zhì)，細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖被選為模型分子。如圖1所示，單個(gè)細(xì)胞被置于氧化銦錫電極表面的微孔上。加入的表面活性劑，如triton X-100，可以溶解細(xì)胞膜，使得細(xì)胞內(nèi)葡萄糖被釋放，與溶液中的葡萄糖氧化酶進(jìn)行反應(yīng);生成的過氧化氫在正電壓的刺激下，可以誘導(dǎo)發(fā)光，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的分析。微孔結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)不僅可以保留單個(gè)細(xì)胞，也可以降低過氧化氫從氧化銦錫電極表面擴(kuò)散到微孔的過程，從而可以在一段時(shí)間內(nèi)應(yīng)該使用魯米諾發(fā)光成像系統(tǒng)持續(xù)地收集光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的快速檢測(cè)。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)細(xì)胞，增加了檢測(cè)通量，并通過對(duì)微孔鍍金修飾，增強(qiáng)了發(fā)光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)微洞的電致發(fā)光成像。
【附圖說明】
[0015]圖1電致化學(xué)發(fā)光成像裝置和單細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的檢測(cè)技術(shù)示意圖；
[0016]圖2微孔中電沉積AuNPs(實(shí)線)和未沉積Au NPs(虛線)的ITO區(qū)域的特征發(fā)光曲線。光電倍增管(PMT)電壓為800V;
[0017]圖3氧化銦錫片上制備的微洞鍍金后在含有200μΜL012的1mM PBS中電致化學(xué)發(fā)光照片。(A)明場(chǎng)照片；(B-H)5，10，20，50，100，200，500μΜ雙氧水加入前后的發(fā)光差異照片；
(I)發(fā)光差異強(qiáng)度和雙氧水濃度的相關(guān)性。誤差棒代表來自64個(gè)微洞的發(fā)光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)偏差;
[0018]圖4(A)單個(gè)細(xì)胞位于微洞中的明場(chǎng)照片；(B)加入葡萄糖氧化酶和曲通100后在第一個(gè)60s采集的發(fā)光照片；(C)第二個(gè)60s采集的發(fā)光照片；(D)這兩張照片的發(fā)光差異；
[0019]圖5(A)微洞中單個(gè)饑餓細(xì)胞的明場(chǎng)圖像；(B)只加入曲通100后，第一個(gè)個(gè)60s內(nèi)收集到的發(fā)光圖像;(C)第二個(gè)60s內(nèi)收集的發(fā)光圖像;(D)兩張圖像之間的發(fā)光差異；
[0020]圖6(A)微孔中單個(gè)饑餓細(xì)胞的明場(chǎng)圖像；(B)加入葡萄糖氧化酶/曲通100后首個(gè)60s內(nèi)收集到的發(fā)光圖像;(C)第二個(gè)60s內(nèi)收集的發(fā)光圖像;(D)兩張圖像之間的發(fā)光差異；[0021 ]圖7(A) 128個(gè)正常細(xì)胞的發(fā)光比率；(B) 128個(gè)饑餓處理4h的細(xì)胞.每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面通過具體的實(shí)例詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0023]化學(xué)試劑和細(xì)胞培養(yǎng):光致抗蝕劑SU-8和顯影劑是從Microchem公司(Newton，MA)購置的?；衔?-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并[3，4-d]噠嗪-1，4(2H，3H)_ 二酮(L012)從光化工美國公司購買得到。其他所有化學(xué)試劑都是從西格瑪奧德里奇公司購置的。實(shí)驗(yàn)中采用電阻率為18.2MΩ /cm的純水。緩沖溶液均經(jīng)過消毒處理。
[0024]Hela細(xì)胞來自于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所(中國上海)C=Hela細(xì)胞在加有10% (v/v)牛胎血清(FBS)和I %(v/v)抗菌素(青霉素/鏈霉素)的DEME高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)過程在37 °C恒溫，含5 % C02的濕潤環(huán)境中進(jìn)行。
[0025]本實(shí)例提供了一種電致化學(xué)發(fā)光成像方法快速分析單細(xì)胞內(nèi)成分的方法，包括如下步驟:
[0026](I)金納米顆粒(Au-NPs)在氧化銦錫微洞電極表面的沉積:在氧化銦錫表面上制備獲得了直徑為30微米的64個(gè)微洞，用于容納單個(gè)細(xì)胞。簡要來說，在氧化銦錫片(邊長2cm)上旋轉(zhuǎn)鍍上一層厚度約30μπι的SU-8光刻膠，65°C軟烤3分鐘，95°C軟烤7分鐘后，通過氧化鐵掩模片和光刻系統(tǒng)對(duì)氧化銦錫玻璃上的光刻膠紫外照射20s;接著65°C軟烤I分鐘，95°C軟烤3分鐘，未聚合的光刻膠通過SU-8顯影劑進(jìn)行移除;暴露出來的ITO區(qū)域就可以導(dǎo)電，得到一個(gè)有64個(gè)孔徑為30μπι的微孔電極。接下來，將具有微洞的玻片在120°C下硬烤30min;并將O型圈粘附在氧化銦錫片上，以形成細(xì)胞室。將該微電極作為工作電極與電化學(xué)工作站(CHI 630E，辰華公司)連接，銀/氯化銀和鉑電極分別作為參比電極和輔助電極。金納米粒子的電沉積通過在含有ImM HAuCl4的0.1M HCl溶液中.循環(huán)掃描(電勢(shì)由-0.2V到0.55V，400s)得到。(2)電化學(xué)發(fā)光成像:化學(xué)發(fā)光成像的光學(xué)裝置如圖1所示，其由1X目鏡(Olympus ,Japan)、一根管和 EM CCD (Evo Ive ,Photometries，Tuson，AZ)所組成，這種直立的成像系統(tǒng)設(shè)計(jì)使得傳輸過程中化學(xué)發(fā)光損失達(dá)到最小，且提供了最短的光通路傳輸。分散的細(xì)胞在磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4，1011^)環(huán)境中與20(^1 L012—起加入細(xì)胞格室，單個(gè)細(xì)胞借助其自身重力落入細(xì)胞格室大小的微孔中，顯微鏡下通過反復(fù)操作達(dá)到高負(fù)載效率。多余的細(xì)胞在粘附在洞外表面前，使用新鮮緩沖溶液反復(fù)輕柔清除掉。裝有細(xì)胞的64微孔的氧化銦錫玻璃片作為工作電極，Ag/AgCl電極和Pt絲分別作為參考電極和輔助電極連接;含有200μΜ L012的1mM PBS(pH 7.4)作為氧化銦錫片發(fā)光成像的溶液。電壓發(fā)生器(DG1021，1^801，0^肪)施加正負(fù)交替的電壓(1￥，28和-1￥，0.58)在電極上誘使發(fā)光。隨后，在緩沖溶液中加入0.1%的Triton X-100和0.lm/mL葡萄糖氧化酶，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解;釋放細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖與葡萄糖氧化酶發(fā)生反應(yīng)雙氧水，提高發(fā)光強(qiáng)度。使用EM CCD連續(xù)采集曝光時(shí)間為60s的兩張照片，來收集來自細(xì)胞的發(fā)光信號(hào)。這兩個(gè)圖像中發(fā)光強(qiáng)度的差異，使用Image J軟件進(jìn)行計(jì)算。為了校準(zhǔn)來自ITO微孔處的發(fā)光差異，50μΜ過氧化氫水溶液被引入并對(duì)微孔發(fā)光的光強(qiáng)進(jìn)行采集。在微洞電極上細(xì)胞和過氧化氫收集到的發(fā)光強(qiáng)度的比率作為信號(hào)被用于細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的分析檢測(cè)。
[0027]實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0028]為了實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的分析檢測(cè)，對(duì)微孔中過氧化氫溶液的成像是非常關(guān)鍵的。我們?cè)谥暗囊恍┕ぷ髦幸呀?jīng)證實(shí)了，通過電化學(xué)發(fā)光成像，氧化銦錫表面ΙΟμΜ濃度的過氧化氫是可以被檢測(cè)到的。然而，氧化銦錫玻璃在經(jīng)過多重的微加工過程制備微洞后發(fā)光很弱，造成較高的檢測(cè)限。發(fā)光效率的損失可能是由于氧化銦錫的微孔區(qū)域在經(jīng)過微加工后殘留的光刻膠所導(dǎo)致的。由于有報(bào)道表明，金納米粒子(Au NPs)能夠加速與魯米諾電化學(xué)發(fā)光相關(guān)聯(lián)的電化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生更多的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)，因此我們?cè)谘趸熷a微孔中電鍍產(chǎn)生Au NPs以改善檢測(cè)限。優(yōu)化后的的電鍍時(shí)間為400s，相對(duì)于沒有修飾Au NPs的ITO區(qū)域，Au NPs覆蓋的氧化銦錫區(qū)域的發(fā)光量增加了十倍，發(fā)光情況如圖2中所示。發(fā)光強(qiáng)度的增加使得氧化銦錫微孔中過氧化氫電化學(xué)發(fā)光具有了較好的檢測(cè)限。
[0029]圖3A顯示出，在10倍目鏡下氧化銦錫片上的64微孔在電鍍修飾AuNPs后的明場(chǎng)照片。當(dāng)過氧化氫濃度從5μΜ上升到升高到500μΜ時(shí)，魯米諾發(fā)光照片被收集。圖3Β-Η中計(jì)算并展示了過氧化氫加入前后光信號(hào)的差異。加入后發(fā)光信號(hào)的增強(qiáng)說明過氧化氫在氧化銦錫微洞電極上可以被觀測(cè)到。發(fā)光強(qiáng)度的增加與過氧化氫的濃度呈正相關(guān)，如圖31所示，這表明了我們的平臺(tái)可以提供單細(xì)胞的定量檢測(cè)。過氧化氫的檢測(cè)限是5μΜ，比我們以前實(shí)驗(yàn)中的檢測(cè)限(ΙΟμΜ)有所改善。這些64孔板中微孔的發(fā)光強(qiáng)度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為17.6%，接近我們課題組之前報(bào)告過的八個(gè)微電極陣列的標(biāo)準(zhǔn)偏差15.6%。這種標(biāo)準(zhǔn)偏差的相似性說明微孔中Au NPs覆蓋的ITO區(qū)域是相對(duì)均勻的。
[0030]為了實(shí)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞中葡萄糖的快速分析，電致化學(xué)發(fā)光成像被應(yīng)用于同時(shí)記錄64個(gè)細(xì)胞/微孔的發(fā)光強(qiáng)度。圖4Α顯示了有單細(xì)胞的64微孔的明場(chǎng)圖像。細(xì)胞成功進(jìn)入到微孔中的效率超過了80%。無細(xì)胞的微孔或有多個(gè)細(xì)胞的微孔在接下來的電化學(xué)發(fā)光分析中被排除。在葡萄糖氧化酶/Titron Χ-100被加入到緩沖溶液中之后，視頻記錄顯示了微孔中的細(xì)胞在第45-60S開始破碎。因此，如圖4Β和C所示，以60s的曝光時(shí)間進(jìn)行成像。在第一幅圖像中，發(fā)光強(qiáng)度顯示背景發(fā)光僅僅是來源于L012的。在第二個(gè)圖像中，L012，以及從細(xì)胞內(nèi)釋放出的葡萄糖與水溶液中葡萄糖氧化酶反應(yīng)產(chǎn)生的過氧化氫是發(fā)光的主要來源。圖4D展示了這兩張圖像的發(fā)光差異，每個(gè)微孔顯示出了更多的發(fā)光。如圖5中所示，加入Titron X-100進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明，這兩張圖像沒有給出任何發(fā)光差異。這些結(jié)果表明，我們的電致化學(xué)發(fā)光成像方法能夠在單細(xì)胞層面實(shí)現(xiàn)對(duì)胞內(nèi)葡萄糖的可視化。
[0031]為了校準(zhǔn)從這些細(xì)胞產(chǎn)生的光強(qiáng)，裝載有細(xì)胞的氧化銦錫片被洗凈，除去殘留在微孔中的過氧化氫;然后，由50μΜ過氧化氫，200μΜ L012和0.1 %的Titron Χ-100構(gòu)成的新鮮緩沖液被加入到氧化銦錫表面，重新進(jìn)行發(fā)光成像。圖7Α中顯示了 128個(gè)細(xì)胞在給予50μΜ過氧化氫下的發(fā)光情況，平均發(fā)光率的計(jì)算結(jié)果是1.06±0.46，證明了微孔中過氧化氫濃度在50μΜ附近?？紤]一個(gè)細(xì)胞和一個(gè)微孔的體積分別是IpL和21pL，細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖濃度被估計(jì)為約1禮，這是與文獻(xiàn)值比較接近的。128個(gè)細(xì)胞的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差是43.4% ;根據(jù)目前我們所能了解到的，這是首次對(duì)細(xì)胞內(nèi)葡萄糖水平的巨大差異有所報(bào)道。由于葡萄糖是細(xì)胞中重要的營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物，這種差異可以促進(jìn)我們進(jìn)一步理解細(xì)胞之間的異質(zhì)性。
[0032]為了進(jìn)一步驗(yàn)證我們對(duì)細(xì)胞內(nèi)葡萄糖含量的測(cè)定方法，對(duì)“饑餓”細(xì)胞進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。在此實(shí)驗(yàn)中，這些細(xì)胞被置于細(xì)胞外緩沖溶液(ECB:135mM NaCl，5mM KCl, ImM MgCl2,ImM CaCl2aOmM HEPES，5mM glucose,pH 7.4)中培養(yǎng)4個(gè)小時(shí)，以降低細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖含量?！梆囸I”細(xì)胞的明場(chǎng)和圖像之間的差異顯示在圖6中。在微孔中觀測(cè)到了微弱的發(fā)光，這也證實(shí)了在“饑餓”細(xì)胞中仍然存在一定量的葡萄糖。與對(duì)正常細(xì)胞的測(cè)定類似，利用50μΜ過氧化氫產(chǎn)生的光強(qiáng)對(duì)128個(gè)細(xì)胞的發(fā)光情況進(jìn)行校正，如圖7Β所示。與正常細(xì)胞的結(jié)果相比，對(duì)“饑餓”細(xì)胞的發(fā)光情況進(jìn)行計(jì)算可以得到一個(gè)較小的平均值，約為0.36±0.19，這應(yīng)當(dāng)歸因于在饑餓期間的葡萄糖消耗。根據(jù)圖31中的校準(zhǔn)曲線，可以估計(jì)細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖濃度約為0.36mM。這個(gè)對(duì)不同狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)葡萄糖水平的變化證實(shí)了發(fā)光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)葡萄糖濃度是相關(guān)聯(lián)的。這個(gè)實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為52.8%，揭示了在饑餓處理后細(xì)胞的異質(zhì)性仍然存在。
[0033]在本實(shí)例中，魯米諾電化學(xué)發(fā)光首次被應(yīng)用在對(duì)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖進(jìn)行分析。在與電化學(xué)發(fā)光成像平臺(tái)結(jié)合之后，64個(gè)單細(xì)胞在60s內(nèi)就能得到分析，這大大加快了單細(xì)胞分析速度。在對(duì)正常細(xì)胞和饑餓細(xì)胞的胞內(nèi)葡萄糖進(jìn)行觀測(cè)后，研究結(jié)果顯示細(xì)胞之間展現(xiàn)出了高度的異質(zhì)性。這是首次利用電致化學(xué)發(fā)光分析對(duì)單細(xì)胞內(nèi)分子進(jìn)行檢測(cè)，這將解除此前該技術(shù)僅能被用于測(cè)量細(xì)胞表面物質(zhì)的限制。因此，這種方法將會(huì)被用于檢測(cè)更多的細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物，從而對(duì)更多的生物現(xiàn)象加以探討。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種電致化學(xué)發(fā)光成像方法快速分析單細(xì)胞內(nèi)成分的方法，待檢測(cè)的成分在對(duì)應(yīng)的氧化酶的作用下催化產(chǎn)生雙氧水，其特征在于，包括如下步驟: (1)提供表面具有若干微孔的氧化銦錫電極表面作為微電極，將該微電極作為工作電極與電化學(xué)工作站連接，銀/氯化銀和鉑電極分別作為參比電極和輔助電極，通過電沉積將金納米顆粒沉積到微電極的微孔表面； (2)以含有200-500μΜL012的10-20mM PBS的混合溶液作為氧化銦錫片發(fā)光成像的溶液加入到微孔中，將待分析的單個(gè)細(xì)胞設(shè)置于微孔內(nèi)，加入表面活性劑和待分析成分對(duì)應(yīng)的氧化酶，使用電壓發(fā)生器施加正負(fù)交替的電壓在電極上誘使發(fā)光，然后使用電化學(xué)發(fā)光成像裝置連續(xù)采集曝光時(shí)間為60s的兩張照片，來收集來自細(xì)胞的發(fā)光信號(hào)； (3)使用ImageJ軟件計(jì)算兩個(gè)圖像中發(fā)光強(qiáng)度的差異，同時(shí)為了校準(zhǔn)來自ITO微孔處的發(fā)光差異，將50-100μΜ過氧化氫水溶液引入微孔內(nèi)并對(duì)微孔發(fā)光的光強(qiáng)進(jìn)行采集，在微電極的微孔內(nèi)的單個(gè)細(xì)胞的發(fā)光強(qiáng)度和加入的過氧化氫收集到的發(fā)光強(qiáng)度的比率作為信號(hào)被用于細(xì)胞內(nèi)成分的分析檢測(cè)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的待檢測(cè)成分為葡萄糖、乳酸或膽固醇中的任意一種。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(I)中，所謂微電極表面設(shè)置有64-256個(gè)用于容納單個(gè)細(xì)胞的微孔。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(I)中，所述金納米粒子的電沉積通過在含有l(wèi)_5mM HAuClJ^0.lM HCl溶液中，循環(huán)掃描得到，其中，電勢(shì)由-0.2V到0.55V，循環(huán)掃描400-800s。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述電壓發(fā)生器施加的正負(fù)交替的電壓為lV，2s和-lV，0.5s。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的表面活性劑為0.Ι-Ο.5 % 的Triton X_100，所述的葡萄糖氧化酶的濃度為0.1-0.5U/mL。
【文檔編號(hào)】G01N21/76GK105928927SQ201610237426
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年4月15日
【發(fā)明人】江德臣, 方丹君, 徐晶晶
【申請(qǐng)人】南京大學(xué)