一種碳量子點修飾的葡萄糖氧化酶酶膜及其制備方法
【專利摘要】一種碳量子點修飾的葡萄糖氧化酶酶膜及其制備方法，屬于電化學(xué)生物傳感器及其制備技術(shù)領(lǐng)域。碳量子點修飾的葡萄糖氧化酶酶膜以硝酸纖維素膜為基質(zhì)膜，含有催化劑葡萄糖氧化酶和納米材料碳量子點，以及防腐劑苯甲酸、抗菌劑慶大霉素、保護劑牛血清白蛋白、軟化劑甘油、交聯(lián)劑戊二醛等組分。制備方法：首先將苯甲酸、慶大霉素等添加劑按一定比例溶于葡萄糖氧化酶溶液中，然后將碳量子點、戊二醛與葡萄糖氧化酶溶液混合交聯(lián)，再取混合液滴到硝酸纖維素基體上，干燥后即獲得本發(fā)明酶膜。優(yōu)點在于，有效提高了電子傳遞速率，降低了測試電壓。用于溶液中葡萄糖檢測，具有酶活性高、穩(wěn)定性好、檢測線性范圍寬及靈敏度高。制備方法簡便易行、成本較低。
【專利說明】
一種碳量子點修飾的葡萄糖氧化酶酶膜及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于電化學(xué)生物傳感器及其制備技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種碳量子點修飾的葡萄糖氧化酶酶膜及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]電化學(xué)生物傳感器因其分析準確、快速、選擇性好、靈敏度高等優(yōu)點，近幾十年已經(jīng)得到越來越多的關(guān)注。在電化學(xué)生物傳感器中，葡萄糖傳感器的研究占有很大的比例。但是，傳感器存在酶易失活和泄露、儲存和使用壽命較短等問題，制約了酶膜型葡萄糖生物傳感器的實際應(yīng)用。目前的解決方法主要是使用新穎的固定基體材料、添加納米材料和提高酶固定技術(shù)及工藝優(yōu)化等。
[0003]在專利(I)CNlOl140258中，楊文勝等人用戊二醛作為交聯(lián)劑將葡萄糖氧化酶固定在硝酸基纖維素膜上，并與鉑電極構(gòu)成了葡萄糖生物傳感器，研究結(jié)果表明葡萄糖氧化酶能夠很好地固定在硝酸基纖維素膜上，所制得的傳感器的線性響應(yīng)范圍為0.05?4.0mmol/L，響應(yīng)時間小于80s，葡萄糖電化學(xué)生物傳感器對β-D-葡萄糖的響應(yīng)靈敏度為1.ΙμΑ.L/mmol。但該方法制備的葡萄糖生物傳感器線性響應(yīng)范圍較窄，響應(yīng)時間較長，另外其響應(yīng)靈敏度也較低。
[0004]在文獻(2)山東科學(xué)，2010，23(2):14-17中，畢元春等人制備了不同粒徑、形貌和分散性的金納米粒子，并分別對葡萄糖氧化酶膜進行修飾。研究結(jié)果表明:粒徑小、分散性好的球狀金納米粒子可以極大地提高葡萄糖氧化酶酶膜的靈敏度，說明使用納米材料不僅可以增加酶的吸附量和穩(wěn)定性，還可以提高酶的催化活性，使酶電極的電流響應(yīng)靈敏度得到顯著提高。但采用金納米材料，存在成本較高的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種碳量子點修飾的葡萄糖氧化酶酶膜及其制備方法。碳量子點具有較好生物相容性和較強的導(dǎo)電性，能夠促進酶與電極間的電子傳遞，并可以降低過氧化氫的催化電位；以硝酸纖維素膜為基體膜，為葡萄糖氧化酶提供一個三維多孔結(jié)構(gòu)基底，使得葡萄糖氧化酶更好地分散到這些孔狀結(jié)構(gòu)中，提高酶與待測物的接觸面積。
[0006]本發(fā)明碳量子點修飾的葡萄糖氧化酶酶膜以硝酸纖維素膜為基質(zhì)膜，含有催化劑葡萄糖氧化酶和納米材料碳量子點，以及防腐劑苯甲酸、抗菌劑慶大霉素、保護劑牛血清白蛋白、軟化劑甘油、交聯(lián)劑戊二醛等組分；其中，硝酸纖維素膜厚度為50?150μπι，孔徑為
0.20?1.Ομπι，葡萄糖氧化酶含量為3.6 X 12?5.5 X 13活力單位U/cm2，苯甲酸含量為4.3X 10—4?2.2 X 10—3g/cm2，慶大霉素含量為I.9 X 10—3?9.7 X 10—3g/cm2，牛血清白蛋白含量為2.3 X 10—4?I.2 X 10—3g/cm2，甘油含量為3.2 X 10—4?I.7 X 10—3g/cm2，戊二醛含量為6.7X 10—3?3.4 X 10—2g/cm2，碳量子點含量為2.2 X 10-5?I.2 X 10-4g/cm2。
[0007]本發(fā)明還提供上述以硝酸纖維素膜為基體的碳量子點修飾的葡萄糖氧化酶酶膜的制備方法:首先是將硝酸纖維素基體膜在在磷酸緩沖溶液PBS中進行浸泡處理，然后用高純氮氣將基體膜吹干，粘上O型橡膠圈后進行壓實，再將含有甘油、苯甲酸、牛血清白蛋白、慶大霉素的葡萄糖氧化酶液與戊二醛溶液、碳量子點溶液進行混合交聯(lián)，取定量混合交聯(lián)液滴到已制備好的酶膜上，晾干后待用。具體工藝步驟為:
[0008](I)將硝酸纖維素膜浸泡在pH值為4.5?7.5的磷酸緩沖溶液PBS中5?1h，取出后用高純氮氣將硝酸纖維素膜吹干，然后用703有機硅膠將硝酸纖維素膜和O圈粘牢后放入冰箱中3?5h，壓實，待用；
[0009](2)以pH值為4.5?7.5的磷酸緩沖溶液PBS為溶劑，配制葡萄糖氧化酶混合溶液，其中葡萄糖氧化酶的活度為6.92 X 16?4.33 X 107U/L，甘油濃度為0.092?0.46g/L，苯甲酸濃度為0.12?0.62g/L，牛血清白蛋白濃度為0.20?1.0g/L，慶大霉素濃度為1.5?7.6g/L;配制體積比為1:100?5:100的戊二醛溶液;配制固液比為1:100?1:1的碳量子點溶液；
[0010](3)按照體積比為3:1:4的比例將葡萄糖氧化酶混合溶液、戊二醛溶液及碳量子點溶液進行混合，混合交聯(lián)10?30min，用移液槍取13?29yL混合液滴在步驟(I)制備的硝酸纖維素膜上，晾干后形成面積為0.70?0.75cm2的酶膜圓斑，放入4 °C冰箱中保存待用。
[0011]將上述葡萄糖氧化酶酶膜套在Pt電極頂端作為工作電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，Pt絲作為對電極組裝成三電極體系，可用于溶液中葡萄糖濃度的檢測。將該三電極體系置于pH值為4.5?7.5的磷酸緩沖溶液中，用CHI660D電化學(xué)工作站進行電化學(xué)表征。采用計時電流i_t法測試傳感器對β-D-葡萄糖的響應(yīng)電流(如圖1所示)，其響應(yīng)時間為20s;由圖2可以看出，該傳感器對β-D-葡萄糖的線性響應(yīng)范圍為0.001?5.0mmol/L，大于文獻⑴中傳感器的線性響應(yīng)范圍，同時由線性擬合方程得出本發(fā)明傳感器對β-D-葡萄糖的響應(yīng)靈敏度為1.955μΑ.L/mmol;由圖3可以計算出本發(fā)明葡萄糖氧化酶酶膜的米氏常數(shù)為2.44mmol/L，說明本發(fā)明的葡萄糖氧化酶酶膜對葡萄糖表現(xiàn)出良好的親和性;對本發(fā)明的葡萄糖氧化酶膜進行連續(xù)124次測試(如圖4所示)，其響應(yīng)信號未見明顯下降，124次的測試中響應(yīng)信號大小波動在5.0 %以內(nèi)；前30次測試中(如圖5所示)，響應(yīng)信號大小波動在3.8 %以內(nèi)，這說明本發(fā)明以硝酸纖維素膜為基體的碳量子點修飾的葡萄糖氧化酶酶膜具有良好的操作穩(wěn)定性;對本發(fā)明的葡萄糖氧化酶酶膜進行儲存穩(wěn)定性測試(如圖6所示)，可以看出其儲存穩(wěn)定性良好。
[0012]本發(fā)明的特點及優(yōu)勢在于:采用硝酸纖維素膜作為基體膜，因其具有良好的生物相容性，能夠較好地保持酶的活性，并且價位低廉;采用碳量子點修飾酶膜，有效提高了電子傳遞速率，降低了測試電壓;在制備方法方面，本發(fā)明制備方法簡便易行、工序較少、耗時較短、制備過程成本較低，易于推廣應(yīng)用;在性能方面，本發(fā)明葡萄糖氧化酶酶膜具有較低的測試電壓、較寬的線性響應(yīng)范圍和較好的操作穩(wěn)定性，適合在發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用。
【附圖說明】
[0013]圖1為本發(fā)明實施例1制備的葡萄糖氧化酶酶膜對β-D-葡萄糖的計時電流1-t響應(yīng)曲線;其中，橫坐標為時間t，單位:秒(s)，縱坐標為響應(yīng)電流I，單位:微安(μΑ)。
[0014]圖2為β-D-葡萄糖濃度與響應(yīng)電流的關(guān)系曲線；其中，橫坐標為β-D-葡萄糖的濃度，單位:毫摩爾/升(mmol/L)，縱坐標為響應(yīng)電流I，單位:微安(μΑ)。
[0015]圖3為β-D-葡萄糖濃度的倒數(shù)與響應(yīng)電流的倒數(shù)的關(guān)系曲線;其中，橫坐標為β-D-葡萄糖濃度的倒數(shù)，單位:升/毫摩爾(L/mmol)，縱坐標為響應(yīng)電流I的倒數(shù)，單位:I/微安(1/μΑ)0
[0016]圖4為本發(fā)明實施例1制備的葡萄糖氧化酶酶膜的操作穩(wěn)定性測試圖；其中，橫坐標為測試次數(shù)，單位:次，縱坐標為相對響應(yīng)值，單位:百分數(shù)(% )。
[0017]圖5為本發(fā)明實施例1制備的葡萄糖氧化酶酶膜前30次的響應(yīng)情況;其中，橫坐標為測試次數(shù)，單位:次，縱坐標為相對響應(yīng)值，單位:百分數(shù)(% )。
[0018]圖6為本發(fā)明實施例1制備的葡萄糖氧化酶酶膜儲存穩(wěn)定性測試圖；其中，橫坐標為測試次數(shù)，單位:周，縱坐標為相對響應(yīng)值，單位:百分數(shù)(% )。
【具體實施方式】
:
[0019]實施例1
[0020]將平均孔徑為0.45μηι，厚度為10ym的硝酸纖維素膜浸入到pH值為5.5的磷酸緩沖溶液PBS中處理5h，取出，用高純犯吹干，粘O形橡膠圈上，壓實3h待用;配制葡萄糖氧化酶活度為1.73 X 107U/L的葡萄糖氧化酶混合溶液，甘油濃度為0.18g/L，苯甲酸濃度為0.25g/L，牛血清白蛋白濃度為0.4g/L，慶大霉素濃度為3.04g/L ；配制體積比3.0 %的戊二醛溶液，配制濃度為0.38g/L碳量子點水溶液;分別取葡萄糖氧化酶混合溶液6yL，戊二醛溶液2yL，碳量子點溶液SyL進行混合交聯(lián)，滴涂到已壓實的硝酸纖維素膜上，干燥后于4°C冰箱中保存。
[0021]將上述酶膜套在Pt電極頂端作為工作電極，Pt絲電極作為對電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，測試底液PBS的pH為5.5，采用CHI660D電化學(xué)工作站對所構(gòu)建的葡萄糖傳感器進行電化學(xué)表征。采用i_t法測試傳感器對β-D-葡萄糖的響應(yīng)電流(如圖1所示)，得出其響應(yīng)時間為20s;本發(fā)明傳感器對β-D-葡萄糖的響應(yīng)線性范圍為0.001?5.0mmol/L(如圖2所示)，且由線性擬合方程得出其響應(yīng)靈敏度為1.955μΑ.L/mmol;計算出其米氏常數(shù)為2.44mmol/L(如圖3所示)；本發(fā)明所制酶膜連續(xù)使用124次其響應(yīng)信號未見明顯下降(如圖4所示)，124次的測試中響應(yīng)信號大小波動在5%以內(nèi)；前30次測試中響應(yīng)信號大小波動在3.8%以內(nèi)(如圖5所示)，該葡萄糖氧化酶膜儲存穩(wěn)定性(如圖6所示)良好，在第9周時達到初始測試值的80%。
[0022]實施例2
[0023]將平均孔徑為0.20μηι，厚度為80μηι的硝酸纖維素膜浸入到pH值為7.0的磷酸緩沖溶液中處理7h，取出，用高純％吹干，粘O形橡膠圈上，壓實4h待用；配制葡萄糖氧化酶活度為1.73 X 107U/L的葡萄糖氧化酶混合溶液，甘油濃度為0.18g/L，苯甲酸濃度為0.5g/L，牛血清白蛋白濃度為0.4g/L，慶大霉素濃度為6.08g/L ；配制體積比3.0%的戊二醛溶液，配制濃度為0.38g/L碳量子點水溶液;分別取葡萄糖氧化酶混合溶液6yL，戊二醛溶液2yL，碳量子點溶液SyL進行混合交聯(lián)，滴涂到已壓實的硝酸纖維素膜上，干燥后于4°C冰箱中保存。
[0024]將上述酶膜套在Pt電極頂端作為工作電極，Pt絲電極作為對電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，測試底液PBS的pH為5.5，采用CHI660D電化學(xué)工作站對所構(gòu)建的葡萄糖傳感器進行電化學(xué)表征。采用i_t法測試傳感器對β-D-葡萄糖的響應(yīng)電流，其響應(yīng)時間小于50s;本發(fā)明傳感器對β-D-葡萄糖響應(yīng)的線性范圍為0.05?5.0mmo I /L，由線性擬合方程得出其響應(yīng)靈敏度為1.822μΑ.L/mmol;計算出其米氏常數(shù)為21.71mmol/L;該葡萄糖氧化酶膜穩(wěn)定性良好，在第8周時達到初始測試值的80%。
[0025]實施例3
[0026]將平均孔徑為1.Ομπι，厚度為ΙΟΟμπι的硝酸纖維素膜浸入到pH值為5.5的磷酸緩沖溶液中處理5h，取出，用高純％吹干，粘O形橡膠圈上，壓實3h待用；配制葡萄糖氧化酶活度為6.92 X 106U/L的葡萄糖氧化酶混合溶液，甘油濃度為0.46g/L，苯甲酸濃度為0.62g/L，牛血清白蛋白濃度為I.0g/L，慶大霉素濃度為7.6g/L ；配制體積比2.0 %的戊二醛溶液，配制濃度為0.38g/L碳量子點水溶液;分別取葡萄糖氧化酶混合溶液6yL，戊二醛溶液2yL，碳量子點溶液SyL進行混合交聯(lián)，滴涂到已壓實的硝酸纖維素膜上，干燥后于4°C冰箱中保存。
[0027]將上述酶膜套在Pt電極頂端作為工作電極，Pt絲電極作為對電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，測試底液PBS的pH為6.5，采用CHI660D電化學(xué)工作站對所構(gòu)建的葡萄糖傳感器進行電化學(xué)表征。采用i_t法測試傳感器對β-D-葡萄糖的響應(yīng)電流，其響應(yīng)時間小于30s;本發(fā)明傳感器對β-D-葡萄糖響應(yīng)的線性范圍為0.001?4.0mmol/L，由線性擬合方程得出其響應(yīng)靈敏度為1.857μΑ.L/mmol ；計算出其米氏常數(shù)為2.94mmol/L;該葡萄糖氧化酶膜穩(wěn)定性良好，在第9周時達到初始測試值的80%。
[0028]實施例4
[0029]將平均孔徑為0.8μm，厚度為120μm的硝酸纖維素膜浸入到pH值為6.5的磷酸緩沖溶液中處理10h，取出，用高純他吹干，粘O形橡膠圈上，壓實4h待用；配制葡萄糖氧化酶活度為6.92 X 106U/L的葡萄糖氧化酶混合溶液，甘油濃度為0.18g/L，苯甲酸濃度為0.37g/L，牛血清白蛋白0.8g/L，慶大霉素3.04g/L ；配制體積比2.0%的戊二醛溶液，配制濃度為0.38g/L碳量子點水溶液;分別取葡萄糖氧化酶混合溶液6yL，戊二醛溶液2yL，碳量子點溶液8yL進行混合交聯(lián)，滴涂到已壓實的硝酸纖維素膜上，干燥后于4°C冰箱中保存。
[0030]將上述酶膜套在Pt電極頂端作為工作電極，Pt絲電極作為對電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，測試底液PBS的pH為6.5，采用CHI660D電化學(xué)工作站對所構(gòu)建的葡萄糖傳感器進行電化學(xué)表征。采用i_t法測試傳感器對β-D-葡萄糖的響應(yīng)電流，其響應(yīng)時間小于40s;本發(fā)明傳感器對β-D-葡萄糖響應(yīng)的線性范圍為0.009?5.0mmol/L，由線性擬合方程得出其響應(yīng)靈敏度為1.926μΑ.L/mmol;計算出其米氏常數(shù)為3.17mmol/L;該葡萄糖氧化酶膜穩(wěn)定性良好，在第8周時達到初始測試值的80%。
[0031]實施例5
[0032]將平均孔徑為0.8μηι，厚度為150μηι的硝酸纖維素膜浸入到pH值為7.0的磷酸緩沖溶液中處理6h，取出，用高純％吹干，粘O形橡膠圈上，壓實4h待用；配制葡萄糖氧化酶活度為4.33 X 107U/L的葡萄糖氧化酶混合溶液，甘油濃度為0.092g/L，苯甲酸濃度為0.37g/L，牛血清白蛋白濃度為0.8g/L，慶大霉素濃度為3.04g/L ；配制體積比2.0 %的戊二醛溶液，配制濃度為0.38g/L碳量子點水溶液;分別取葡萄糖氧化酶混合溶液6yL，戊二醛溶液2yL，碳量子點溶液SyL進行混合交聯(lián)，滴涂到已壓實的硝酸纖維素膜上，干燥后于4°C冰箱中保存。
[0033]將上述酶膜套在Pt電極頂端作為工作電極，Pt絲電極作為對電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，測試底液PBS的pH為7.0，采用CHI660D電化學(xué)工作站對所構(gòu)建的葡萄糖傳感器進行電化學(xué)表征。采用i_t法測試傳感器對β-D-葡萄糖的響應(yīng)電流，其響應(yīng)時間小于35s;本發(fā)明傳感器對β-D-葡萄糖響應(yīng)的線性范圍為0.001?5.0mmoI/L，由線性擬合方程得出其響應(yīng)靈敏度為1.896μΑ.L/mmol;計算出其米氏常數(shù)為2.69mmol/L;該葡萄糖氧化酶膜穩(wěn)定性良好，在第9周時達到初始測試值的80%。
【主權(quán)項】
1.一種碳量子點修飾的葡萄糖氧化酶酶膜，其特征在于，該酶膜以硝酸纖維素膜為基質(zhì)膜，含有催化劑葡萄糖氧化酶和納米材料碳量子點，以及防腐劑苯甲酸、抗菌劑慶大霉素、保護劑牛血清白蛋白、軟化劑甘油、交聯(lián)劑戊二醛組分;其中，硝酸纖維素膜厚度為50?150μηι，孔徑為0.20?I.Ομπι，葡萄糖氧化酶含量為3.6 X 12?5.5 X 13活力單位U/cm2，甘油含量為3.2 X 10—4?I.7 X 10—3g/cm2，苯甲酸含量為4.3 X 10—4?2.2 X 10—3g/cm2，牛血清白蛋白含量為2.3 X 10—4?I.2 X 10—3g/cm2，慶大霉素含量為I.9 X 10—3?9.7 X 10—3g/cm2，戊二醛含量為6.7 X 10—3?3.4 X 10—2g/cm2，碳量子點含量為2.2 X 10—5?I.2 X 10—4g/cm2。2.—種制備權(quán)利要求1所述碳量子點修飾的葡萄糖氧化酶酶膜的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)將硝酸纖維素膜浸泡在pH值為4.5?7.5的磷酸緩沖溶液PBS中5?10小時，取出后用高純氮氣將硝酸纖維素膜吹干，然后用703有機硅膠將硝酸纖維素膜和O圈粘牢后放入冰箱中3?5小時，壓實，待用； (2)以pH值為4.5?7.5的磷酸緩沖溶液PBS為溶劑，配制葡萄糖氧化酶混合溶液，其中葡萄糖氧化酶的活度為6.92 X 16?4.33 X 107U/L，甘油濃度為0.092?0.46g/L，苯甲酸濃度為0.12?0.62g/L，牛血清白蛋白濃度為0.20?1.0g/L，慶大霉素濃度為1.5?7.6g/L;配制體積比為I: 100?5:100的戊二醛溶液;配制固液比為1:100?1:1的碳量子點溶液； (3)按照體積比為3:1:4的比例將葡萄糖氧化酶混合溶液、戊二醛溶液及碳量子點溶液進行混合，混合交聯(lián)10?30分鐘，用移液槍取13?29yL混合液滴在步驟(I)制備的硝酸纖維素膜上，晾干后形成面積為0.70?0.75cm2的酶膜圓斑，放入4 °C冰箱中保存待用。
【文檔編號】G01N27/327GK105928999SQ201610229037
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月13日
【發(fā)明人】楊文勝, 王明明, 劉長霞, 陳旭
【申請人】北京化工大學(xué)