一種巴西綠蜂膠質(zhì)量控制方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種巴西綠蜂膠質(zhì)量控制方法，通過以下步驟實(shí)現(xiàn)：用乙醇超聲提取供試蜂膠樣品，過濾，用高效液相色譜檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算6個評價指標(biāo)成分含量，以這6個成分的含量高低評價巴西綠蜂膠的質(zhì)量優(yōu)劣，即這6個成分的含量總和大于10％為優(yōu)質(zhì)蜂膠，小于6％為劣質(zhì)蜂膠。本發(fā)明將巴西綠蜂膠化學(xué)成分與抗氧化活性相結(jié)合，闡明了巴西綠蜂膠抗氧化物質(zhì)基礎(chǔ)，避免了某些主要成分并未發(fā)揮較強(qiáng)的藥理活性的弊端，更能真實(shí)反應(yīng)巴西綠蜂膠的抗氧化活性。本發(fā)明方法設(shè)計合理，克服現(xiàn)有巴西綠蜂膠以總黃酮為質(zhì)控指標(biāo)的不合理性，以及克服多個黃酮或酚酸類含量檢測與活性無相關(guān)性等缺陷，為巴西綠蜂膠質(zhì)量控制提出一種新的方法。
【專利說明】
一種巴西綠蜂膠質(zhì)量控制方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于蜂膠質(zhì)量控制領(lǐng)域，涉及一種巴西綠蜂膠質(zhì)量控制方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 巴西綠蜂膠采自巴西東南部和中西部地區(qū)，其植物來源是Bacchar is dracunculifolia DC.，是目前國內(nèi)外商業(yè)上最流行、研究最多的蜂膠類型之一，現(xiàn)已廣泛 應(yīng)用于保健食品中來改進(jìn)人類健康和預(yù)防疾病。
[0003] 巴西綠蜂膠進(jìn)口至中國已有十余年歷史，由于缺少質(zhì)量評價方法，只能參照中國 蜂膠的國家標(biāo)準(zhǔn)，以總黃酮含量作為質(zhì)控指標(biāo)。而巴西綠蜂膠主要成分為異戊烯苯丙類和 P-香豆酸的異戊烯基衍生物，黃酮類化合物含量較低。顯然以總黃酮含量為指標(biāo)不適合巴 西綠蜂膠質(zhì)量控制。
[0004] 目前關(guān)于巴西綠蜂膠中黃酮類、酚酸類的含量檢測以及指紋圖譜的研究較多。然 而，在不同的檢測條件下所用指標(biāo)及建立的指紋圖譜各不相同，再加上蜂膠中不同化學(xué)成 分所發(fā)揮的藥理活性并不相同，目前，巴西綠蜂膠的質(zhì)控方法與其療效無相關(guān)性，難以達(dá)到 確保蜂膠有效性和藥效穩(wěn)定性的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種巴西綠蜂膠質(zhì)量控制方法，通過以下步驟實(shí)現(xiàn)：
[0006] 1.蜂膠樣本制備
[0007] 對供試樣品進(jìn)行冷凍粉碎后，用70~95%乙醇超聲提取15~45min，料液比為1:10 ~30，反復(fù)提取3次，合并濾液，經(jīng)冷凍除蠟后用95 %的乙醇定容至50mL，經(jīng)微孔膜過濾得R1 檢測樣本液；
[0008] 2.高效液相色譜法檢測
[0009] 檢測條件：Sepax HP-C18( 150mm*4.6mm, 5_);流動相：甲醇-0.1 % 乙酸；流速： 1. OmL/min;波長：280nm，柱溫:33°C，進(jìn)樣量：5yL，優(yōu)化后的梯度洗脫程序為:0-10min，15-25 % 甲醇；10-25min，25-40 % 甲醇；25-55min，40-60 % 甲醇；55-75min，60-75 % 甲醇；75-90min，75-85% 甲醇；
[0010] 3 ?質(zhì)量評價
[0011] 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和峰面積，計算出綠原酸、咖啡酸、3，5-二咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖 啡酰奎寧酸、3,4,5_三咖啡?？鼘幩岷桶⑻嫫チ諧的含量，以這6個成分的含量高低評價巴 西綠蜂膠的質(zhì)量優(yōu)劣，即這6個成分的含量總和大于10%為優(yōu)質(zhì)蜂膠，小于6%為劣質(zhì)蜂膠。
[0012] 本發(fā)明的另一個目的是提供所述的方法在評價巴西綠蜂膠質(zhì)量中的應(yīng)用。所述的 巴西綠蜂膠質(zhì)量評價方法所采用的活性指標(biāo)成分為綠原酸、咖啡酸、3，5-二咖啡?？鼘幩?、 4,5_二咖啡?？鼘幩?、3,4,5_三咖啡?？鼘幩岷桶⑻嫫チ諧，當(dāng)這6個成分的含量總和大于 10 %為優(yōu)質(zhì)蜂膠，小于6 %為劣質(zhì)蜂膠。
[0013] 本發(fā)明克服巴西綠蜂膠質(zhì)量控制中采用總黃酮或單個黃酮或酚酸的僅以化學(xué)成 分信息進(jìn)行質(zhì)控的弊端，提供了一種以抗氧化活性成分來評價巴西綠蜂膠質(zhì)量優(yōu)劣的評價 方法。與現(xiàn)有的巴西綠蜂膠質(zhì)量控制方法相比，本發(fā)明具有下述特點(diǎn)：（1)明確巴西綠蜂膠 抗氧化活性成分，以抗氧化活性成分為指標(biāo)能夠反應(yīng)巴西綠蜂膠的抗氧化活性強(qiáng)弱。（2)以 抗氧化活性成分為指標(biāo)，更能真實(shí)地體現(xiàn)巴西綠蜂膠的藥理活性。本發(fā)明將巴西綠蜂膠化 學(xué)成分與抗氧化活性相結(jié)合，闡明了巴西綠蜂膠抗氧化物質(zhì)基礎(chǔ)，避免了某些主要成分并 未發(fā)揮較強(qiáng)的藥理活性的弊端，更能真實(shí)反應(yīng)巴西綠蜂膠的抗氧化活性。本發(fā)明方法克服 現(xiàn)有巴西綠蜂膠以總黃酮為質(zhì)控指標(biāo)的不合理性，以及克服多個黃酮或酚酸類含量檢測與 活性無相關(guān)性等缺陷，為巴西綠蜂膠質(zhì)量控制提出一種新的方法。
【附圖說明】
[0014]圖1是巴西綠蜂膠與DPPH自由基反應(yīng)前(a)與反應(yīng)后(b)HPLC對比模式圖譜：1、綠 原酸;2、咖啡酸;3、3，5-二咖啡?？鼘幩?4、4，5-二咖啡酰奎寧酸;5、3，4，5-三咖啡?？鼘?酸;6、阿替匹林C。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 本發(fā)明結(jié)合具體實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。
[0016] 實(shí)施例1
[0017] (1)蜂膠樣本制備
[0018] 取不同批次的3個巴西綠蜂膠樣，冷凍粉碎后，用95%乙醇超聲提取30min，料液比 為1:15,反復(fù)提取3次，合并濾液，經(jīng)冷凍除蠟后用95%的乙醇定容至50mL，經(jīng)微孔膜過濾分 別得S1、S2、S3檢測樣本液。
[0019] (2)高效液相色譜檢測
[0020] 條件：Sepax HP_C18( 150mm*4? 6mm,5_);流動相：甲醇-〇 ? 1 % 乙酸；流速：1 ? OmL/ min;波長：280nm。柱溫：33 °C。進(jìn)樣量:5yL。優(yōu)化后的梯度洗脫程序為:0-10min，15-25 %甲 醇；10-25min，25-40 % 甲醇；25-55min，40-60 % 甲醇；55-75min，60-75 % 甲醇；75-90min， 75-85% 甲醇。
[0021] (3)離線 HPLC-DPPH 分析
[0022] 分別移取SI、S2、S3蜂膠醇提液，加入新鮮配置的DPPH乙醇溶液，室溫條件下避光 反應(yīng)一段時間，經(jīng)濾膜過濾后作為實(shí)驗組；同時用等體積的無水乙醇替代DPPH按上述操作 處理作為空白對照樣。分別進(jìn)供試樣和空白對照各5yL，進(jìn)行HPLC分析。
[0023]由圖1可知，反應(yīng)后蜂膠中的成分峰1 (綠原酸）、2 (咖啡酸）、3 (3，5-二咖啡酰奎寧 酸）、4(4,5_二咖啡酰奎寧酸）、5(3,4,5-三咖啡?？鼘幩幔?、6(阿替匹林〇的峰面積發(fā)生了 顯著的下降，而其他成分峰在反應(yīng)后無明顯的下降。
[0024]表1巴西綠蜂膠中共有成分的峰面積下降率

[0026]根據(jù)反應(yīng)后蜂膠中抗氧化成分的峰面積下降率定量評價各活性成分的效價值，山 奈酚>3，4，5-三咖啡酰奎寧酸>3，5-二咖啡?？鼘幩岫?，5-二咖啡?？鼘幩帷禈迥痉印怠稻G原 酸〉咖啡酸〉阿替匹林C。因此，可根據(jù)本發(fā)明建立的HPLC方法測定抗氧化活性成分的含量來 評價巴西綠蜂膠抗氧化活性的高低，從而評價其質(zhì)量優(yōu)劣。
[0027] (4)巴西綠蜂膠抗氧化活性質(zhì)量評價
[0028] 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算綠原酸、咖啡酸、3，5-二咖啡?？鼘幩帷?，5-二咖啡?？鼘幩?、 3，4，5-三咖啡?？鼘幩岷桶⑻嫫チ諧的含量，如表2所不，這6個成分的含量與巴西綠蜂膠的 抗氧化活性成正相關(guān)，三個樣本總抗氧化活性成分含量均介于6%~8%之間，表現(xiàn)了一般 的抗氧化活性。
[0029]表2巴西綠蜂膠抗氧化活性成分含量(mg/g)與抗氧化活性(IC50，iig/mL)
[0031] 實(shí)施例2
[0032] (1)蜂膠樣本制備
[0033] 取不同批次的3個巴西綠蜂膠樣，冷凍粉碎后，用70%乙醇超聲提取45min，料液比 為1:30,反復(fù)提取3次，合并濾液，經(jīng)冷凍除蠟后用95%的乙醇定容至50mL，經(jīng)微孔膜過濾分 別得S4、S5、S6檢測樣本液。
[0034] (2)高效液相色譜檢測條件
[0035] Sepax HP-C18(150mm*4.6mm，5iim);流動相：甲醇-〇? 1%乙酸；流速：1 .OmL/min;波 長:280nm。柱溫:33°C。進(jìn)樣量：5此。優(yōu)化后的梯度洗脫程序為：0-10min，15-25 %甲醇；10-25min，25-40 % 甲醇；25-55min，40-60 % 甲醇；55-75min，60-75 % 甲醇；75-90min，75-85 % 甲醇。
[0036] (3)巴西綠蜂膠抗氧化活性質(zhì)量評價
[0037] 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算綠原酸、咖啡酸、3，5-二咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖啡?？鼘幩帷?3，4，5-三咖啡?？鼘幩岷桶⑻嫫チ諧的含量，如表2所不，這6個成分的含量與巴西綠蜂膠的 抗氧化活性成正相關(guān)，三個樣本均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性，其中S4樣的活性成分含量最 高，DPPH清除活性最強(qiáng)。
[0038]表2巴西綠蜂膠抗氧化活性成分含量(mg/g)與抗氧化活性（IC50，iig/mL)
[0039]
[0040] 實(shí)施例3
[00411 (1)蜂膠樣本制備
[0042] 取不同批次的3個巴西綠蜂膠樣，冷凍粉碎后，用85%乙醇超聲提取45min，料液比 為1:10,反復(fù)提取3次，合并濾液，經(jīng)冷凍除蠟后用95%的乙醇定容至50mL，經(jīng)微孔膜過濾分 別得S7、S8、S9檢測樣本液。
[0043] (2)高效液相色譜檢測條件
[0044] Sepax HP-C18(150mm*4.6mm，5iim);流動相：甲醇-〇? 1%乙酸；流速：1 .OmL/min;波 長:280nm。柱溫:33°C。進(jìn)樣量：5此。優(yōu)化后的梯度洗脫程序為：0-10min，15-25 %甲醇；10-25min，25-40 % 甲醇；25-55min，40-60 % 甲醇；55-75min，60-75 % 甲醇；75-90min，75-85 % 甲醇。
[0045] (3)巴西綠蜂膠抗氧化活性質(zhì)量評價
[0046] 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算綠原酸、咖啡酸、3，5-二咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖啡?？鼘幩?、 3，4，5-三咖啡?？鼘幩岷桶⑻嫫チ諧的含量，如表3所不，這6個成分的含量與巴西綠蜂膠的 抗氧化活性成正相關(guān)，三個樣本抗氧化活性均較強(qiáng)。
[0047]表3巴西綠蜂膠抗氧化活性成分含量(mg/g)與抗氧化活性（IC50，iig/mL)
【主權(quán)項】
1. 一種巴西綠蜂膠質(zhì)量控制方法，其特征在于，通過以下步驟實(shí)現(xiàn)： (1) 蜂膠樣本制備 對供試樣品進(jìn)行冷凍粉碎后，用70~95 %乙醇超聲提取15~45min，料液比為I: IO~ 30，反復(fù)提取3次，合并濾液，經(jīng)冷凍除蠟后用95 %的乙醇定容至50mL，經(jīng)微孔膜過濾得Rl檢 測樣本液； (2) 高效液相色譜檢測 檢測條件：Sepax HP-C18(150mm*4.6mm，5ym);流動相：甲醇-0 · 1 % 乙酸；流速：I .OmL/ min;波長：280nm。柱溫：33°C。進(jìn)樣量：5yL，梯度洗脫程序為：O-IOmin，15-25 %甲醇；10-25min，25-40 % 甲醇；25-55min，40-60 % 甲醇；55-75min，60-75 % 甲醇；75-90min，75-85 % 甲醇； (3) 質(zhì)量評價 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和峰面積，計算出綠原酸、咖啡酸、3，5-二咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖啡酰 奎寧酸、3，4,5_三咖啡酰奎寧酸和阿替匹林C的含量，以這6個成分的含量高低評價巴西綠 蜂膠的質(zhì)量優(yōu)劣，當(dāng)6個成分的含量總和大于10%為優(yōu)質(zhì)蜂膠，小于6%為劣質(zhì)蜂膠。2. 權(quán)利要求1所述的一種巴西綠蜂膠質(zhì)量控制方法評價巴西綠蜂膠質(zhì)量中的應(yīng)用。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所采用的評價指標(biāo)成分為綠原酸、咖啡酸、 3，5-二咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖啡?？鼘幩帷?，4，5-三咖啡?？鼘幩岷桶⑻嫫チ諧，當(dāng)這6個 成分的含量總和大于10%為優(yōu)質(zhì)蜂膠，小于6%為劣質(zhì)蜂膠。
【文檔編號】G01N30/02GK105929074SQ201610279885
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月28日
【發(fā)明人】張翠平, 胡福良, 申小閣, 劉嘉
【申請人】浙江大學(xué), 蜂乃寶本鋪（南京）保健食品有限公司