一種基于金銀核殼結(jié)構(gòu)拉曼增強(qiáng)效應(yīng)的金黃色葡萄球菌腸毒素b免疫檢測方法
【專利摘要】一種基于金銀核殼結(jié)構(gòu)拉曼增強(qiáng)效應(yīng)的金黃色葡萄球菌腸毒素B免疫檢測方法，屬于免疫分析技術(shù)領(lǐng)域。包括：具有強(qiáng)拉曼增強(qiáng)效應(yīng)的金銀核殼結(jié)構(gòu)的合成，檢測腸毒素B的免疫分析方法的建立。以對(duì)硝基苯硫酚（4?NTP）修飾15 nm金納米粒子，用檸檬酸在金納米粒子表面還原硝酸銀形成9nm的銀殼，從而得到內(nèi)嵌拉曼信標(biāo)4?NTP的金銀核殼結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)本身具有很強(qiáng)的拉曼增強(qiáng)效應(yīng)，且拉曼信號(hào)穩(wěn)定均一，不易丟失。在金銀核殼納米粒子上標(biāo)記腸毒素B單抗，微孔板上預(yù)先包被金黃色葡萄球菌腸毒素B的捕獲抗體。樣品中的腸毒素B首先被微孔板上的抗體捕獲，再與金銀核殼納米粒子標(biāo)記的抗體結(jié)合，板上的拉曼信號(hào)通過拉曼光譜儀掃描得到。本方法腸毒素B的檢測限0.002ng/mL，顯著低于傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫方法。
【專利說明】
一種基于金銀核殼結(jié)構(gòu)拉曼増強(qiáng)效應(yīng)的金黃色葡萄球菌腸毒素B免疫檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種基于金銀核殼結(jié)構(gòu)拉曼增強(qiáng)效應(yīng)的金黃色葡萄球菌腸毒素B免疫檢測方法，屬于免疫分析技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一種常見的食源性致病菌，金黃色葡萄球菌腸毒素是金黃色葡萄球菌在食品中的主要危害因子。金黃色葡萄球菌腸毒素是一類分子量在28-30kDa，耐酸、耐熱、耐蛋白酶的超抗原，人的半數(shù)致死劑量(LD50)僅為20ng/kg。腸毒素B是一種廣泛被研究的金黃色葡萄球菌腸毒素，是食品的主要腸毒素之一，目前已被美國疾病預(yù)防控制中心列為B級(jí)生物戰(zhàn)劑。
[0003]肉制品尤其是熟食肉制品是金黃色葡萄球菌的天然培養(yǎng)基，極易受到金黃色葡萄球菌及其腸毒素的污染。經(jīng)過熱處理可以殺滅金黃色葡萄球菌，然而一旦菌體產(chǎn)生外分泌的腸毒素，那么存在于食物中的腸毒素非常穩(wěn)定，100°C、30min不被破壞，攝入人體后可以抵抗腸胃液中蛋白酶的分解，并引起人體的嘔吐、腹瀉等癥狀。腸毒素的傳統(tǒng)免疫學(xué)檢測方法包括間接血凝技術(shù)和免疫擴(kuò)散方法，在檢測小分子量的腸毒素時(shí)，反應(yīng)時(shí)間較長，16-24h才能出現(xiàn)陽性結(jié)果，且檢測限無法滿足安全限量要求。目前，一些基于雙抗體夾心酶聯(lián)吸附免疫分析(ELISA)原理的檢測試劑盒已經(jīng)在部分地區(qū)使用，檢測的靈敏度可達(dá)ng/L的水平，然而由于食品基質(zhì)如肉制品、乳制品干擾嚴(yán)重，常常需要對(duì)檢測樣本進(jìn)行稀釋，因此傳統(tǒng)免疫方法的檢測靈敏度有待于提升。
[0004]因此，本發(fā)明利用貴金屬基質(zhì)的拉曼增強(qiáng)效應(yīng)，合成了本身具有強(qiáng)拉曼信號(hào)的單分散的金銀核殼納米粒子。由于信標(biāo)分子內(nèi)嵌在金銀殼層之間，保證了強(qiáng)拉曼效應(yīng)的同時(shí)避免了信標(biāo)分子的脫落。將金銀核殼納米粒子標(biāo)記金黃色葡萄球菌腸毒素B單克隆抗體后成功應(yīng)用于金黃色葡萄球菌腸毒素B的免疫檢測。該免疫方法可以檢測到0.002ng/mL的金黃色葡萄球菌腸毒素B，顯著低于傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫方法(0.3-lng/mL)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服上述不足之處，提供一種基于金銀核殼結(jié)構(gòu)拉曼增強(qiáng)效應(yīng)的金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)免疫檢測方法，用于食品中SEB的高靈敏、高通量免疫檢測。
[0006]按照本發(fā)明提供的技術(shù)方案，為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明合成一種具有高拉曼強(qiáng)度的金銀核殼納米粒子，建立了一種食品中SEB的微孔板拉曼免疫檢測方法，該方法包括對(duì)合成方法的優(yōu)化。
[0007]其中，高拉曼強(qiáng)度的金銀核殼納米粒子是通過先修飾拉曼信標(biāo)分子對(duì)硝基苯硫酸4-NTP到Au表面，然后通過調(diào)節(jié)AgNO3的量來控制銀殼厚度在9nm，此時(shí)金銀核殼納米粒子拉曼增強(qiáng)效應(yīng)和光學(xué)活性達(dá)到平衡，拉曼信號(hào)最強(qiáng)。
[0008]同時(shí)，選擇4-NTP作為信標(biāo)分子，使得金銀核殼納米粒子拉曼特征峰在1333cm—S很好的避免了拉曼信號(hào)與微孔板在1080cm—1處的強(qiáng)峰形成干擾。
[0009]將合成的金銀核殼納米粒子標(biāo)記抗體，應(yīng)用于基于微孔板的免疫檢測。金銀核殼納米粒子具有很強(qiáng)的拉曼信號(hào)，可以顯著提高免疫檢測的靈敏度。
[0010]本發(fā)明方法的檢測分析原理是:酶標(biāo)板上包被了捕獲抗體金黃色葡萄球菌腸毒素抗體K3，可以有效捕獲SEB;洗板3次，洗去未結(jié)合的抗體，加入封閉液220yL封閉板孔上多余結(jié)合位點(diǎn);洗板3次，加入樣品及對(duì)照，37°C孵育Ih;洗板3次，加入金銀核殼納米粒子標(biāo)記的金黃色葡萄球菌腸毒素抗體1F6，37°C孵育Ih;洗板4次，拍干后掃描拉曼信號(hào)。
[0011]首先以對(duì)硝基苯硫酸4-NTP修飾15 nm金納米粒子，用梓檬酸在金納米粒子表面還原硝酸銀形成9nm的銀殼，從而得到內(nèi)嵌拉曼信標(biāo)4-NTP的金銀核殼結(jié)構(gòu)，其具有強(qiáng)拉曼信號(hào)的、區(qū)別于微孔板本底信號(hào)的金銀核殼納米粒子;金銀核殼納米粒子標(biāo)記腸毒素B單克隆抗體，并應(yīng)用于金黃色葡萄球菌腸毒素B的免疫檢測;具體步驟為:
(1)金銀核殼納米粒子的合成:采用梓檬酸還原法合成15nm金納米粒子AuNP，通過金巰鍵與信標(biāo)分子4-1'0'?進(jìn)行偶聯(lián):取511^合成的金納米粒子8000印1]1離心15 min，用ImL 1mM磷酸鹽緩沖液PB重懸；加入25yL 200μΜ的對(duì)硝基苯硫酚4-NTP，室溫避光反應(yīng)6_8h ；然后8000rpm離心15 min，加入600yL超純水和300yL質(zhì)量體積比為10%的聚乙烯吡咯烷酮;再加Al20yL 2mM AgNO3和10yL 0.1M的檸檬酸三鈉，迅速震蕩后室溫靜置10 min;8500rpm離心15 min后，棄去上清，用ImL 1mM PB重懸合成金銀核殼納米粒子；
對(duì)金銀核殼納米粒子的銀殼厚度、拉曼信號(hào)通過投射電鏡和拉曼光譜儀進(jìn)行表征；
(2)金銀核殼納米粒子標(biāo)記腸毒素B單克隆抗體:
ImL步驟(I)制備的金銀核殼納米粒子中加入終濃度為10yg/mL的金黃色葡萄球菌腸毒素B單克隆抗體1F6，加入8yL 0.2 M Na2CO3調(diào)節(jié)pH到7.5，室溫震蕩反應(yīng)2h;向體系中加入50yL 20mg/mL的BSA，室溫震蕩反應(yīng)2h;8500rpm離心15 min后完成金銀核殼納米粒子的標(biāo)記腸毒素B單克隆抗體；
(3)金黃色葡萄球菌腸毒素B免疫檢測:
a、將終濃度為5yg/mL、0.0lM碳酸鹽緩沖液為溶劑的金黃色葡萄球菌腸毒素包被抗體K3加入到微孔板中，加入量為10yL/孔，37°C孵育2h;
b、用1mMPBS,0.1% Tween 20的洗液洗步驟a所得微孔板3次，每次間隔3 min;加入封閉液，即質(zhì)量濃度為0.2%明膠，溶劑為0.0lM碳酸鹽緩沖液，37°C孵育2h;
c、用1mMPBS,0.1% Tween 20的洗液洗步驟b所得微孔板3次，每次間隔3 min;按ΙΟΟμL/孔加入金黃色葡萄球菌腸毒素B樣品到微孔板中，37°C反應(yīng)Ih;
d、用1mMPBS,0.1% Tween 20的洗液洗步驟c所得微孔板3次，每次間隔3 min;加入步驟(2)制備的金銀核殼納米粒子標(biāo)記的金黃色葡萄球菌腸毒素B單克隆抗體1F6，加入量為10yL/孔，37°C 反應(yīng) Ih;
e、用1mMPBS.0.l%Tween 20的洗液洗步驟(1所得微孔板4次，每次間隔3 min;最后一次洗板后用吸水紙排干微孔板，然后用拉曼光譜儀掃描樣品信號(hào)，得到檢測結(jié)果。
[0012]如果樣品中SEB濃度多0.002ng/mL，那么祥品中SEB被捕獲抗體K3捕獲并與金銀核殼納米粒子標(biāo)記的1F6抗體結(jié)合。此時(shí)，酶標(biāo)微孔板上有拉曼信號(hào)檢出，并被判定為陽性;如果樣品中SEB濃度<0.002ng/mL那么捕獲的腸毒素B數(shù)量太小不足以引起足夠的拉曼信號(hào)，被判定為陰性。
[0013]步驟(I)中所述聚乙烯吡咯烷酮、AgNO3和檸檬酸三鈉，步驟(2)中所述Na2CO3和BSA的溶劑均為超純水。
[0014]步驟(3)c中所述金黃色葡萄球菌腸毒素B樣品的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為100pg/mL、50 pg/mL、20 pg/mL、10 pg/mL、5 pg/mL、2 pg/mL及0 pg/mL。
[0015]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明提供的高拉曼強(qiáng)度的金銀核殼納米粒子合成方法以及金黃色葡萄球菌腸毒素SEB高靈敏、高通量免疫檢測方法。合成的金銀核殼納米粒子具有很強(qiáng)的拉曼信號(hào)可以區(qū)分微孔板自身拉曼信號(hào)，并對(duì)傳統(tǒng)免疫檢測進(jìn)行增敏。該發(fā)明建立的免疫方法可以檢測到0.002ng/mL的金黃色葡萄球菌腸毒素B，顯著低于傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫方法(0.3-lng/mL)ο
[0016]生物材料保藏保藏:金黃色葡萄球菌腸毒素B單克隆抗體1F6，保藏編號(hào)為CGMCCN0.10866，公開于申請(qǐng)?zhí)?201510669537.1;金黃色葡萄球菌腸毒素包被抗體K3，保藏編號(hào)CGMCC N0.10863，公開于申請(qǐng)?zhí)?201510669537.1。
【附圖說明】
[0017]圖1合成的銀殼厚度為9nm的金銀核殼納米粒子TEM表征圖。
[0018]圖215nm的金納米粒子以及銀殼厚度為9nm的金銀核殼納米粒子紫外圖譜。
[0019]圖315nm的金納米粒子以及銀殼厚度為9nm的金銀核殼納米粒子拉曼圖譜。
[0020]圖4基于金銀核殼納米粒子拉曼增強(qiáng)的金黃色葡萄球菌腸毒素SEB免疫檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0021 ] (I)具有強(qiáng)拉曼增強(qiáng)效應(yīng)的金銀核殼納米粒子的合成，具體步驟為:
采用梓檬酸還原法合成15nm金納米粒子Au NP:先用洗潔精清洗300 mL錐形瓶和磁力攪拌子B500，再用超純水沖洗6遍;倒入100 mL 0.01% (m/V，超純水)的氯金酸溶液HAuCl4,用5層保鮮膜封口，并在加熱板上加熱攪拌至煮沸狀態(tài)，保持10 min。取200 yL 10% (m/V,超純水)的檸檬酸三鈉溶液并快速加入沸騰的溶液中，再用5層保鮮膜封口并再煮沸15min，直至溶液顏色變?yōu)榫萍t色并保持不變;停止加熱，保持?jǐn)嚢柚敝晾鋮s至室溫，并加超純水至溶液體積為100 mL。
[0022]通過金巰鍵將15nm金納米粒子Au NP與信標(biāo)分子4-NTP進(jìn)行偶聯(lián):取5mL合成的金納米粒子8000rpm離心15 min，用ImL 1mM磷酸鹽緩沖液I3B重懸;加入25yL 200μΜ的對(duì)硝基苯硫酚4-見13，室溫避光反應(yīng)6-811;然后8000印111離心15 min，加入600 yL超純水和300 yL的10% (m/V，超純水)的聚乙烯吡咯烷酮；再加入120 yL 2mM AgN03(超純水)和100 yL
0.1M的檸檬酸三鈉(超純水)，迅速震蕩后室溫靜置10 min;8500rpm離心15 min后，棄去上清，用ImL 1mM PB重懸合成金銀核殼納米粒子；
對(duì)金銀核殼納米粒子的銀殼厚度、拉曼信號(hào)通過投射電鏡和拉曼光譜儀進(jìn)行表征;合成的銀殼厚度為9nm的金銀核殼納米粒子TEM表征圖如圖1所示，合成的銀殼厚度為9nm的金銀核殼納米粒子紫外圖譜如圖2所示，15nm的金納米粒子以及銀殼厚度為9nm的金銀核殼納米粒子拉曼圖譜如圖3所示。
[0023](2)金銀核殼納米粒子標(biāo)記腸毒素B單克隆抗體:
ImL步驟(I)制備的金銀核殼納米粒子中加入終濃度為10yg/mL的金黃色葡萄球菌腸毒素B單克隆抗體1F6，加入8yL 0.2 M Na2CO3調(diào)節(jié)pH到7.5，室溫震蕩反應(yīng)2h;向體系中加入50yL 20mg/mL的BSA，室溫震蕩反應(yīng)2h;8500rpm離心15 min后完成金銀核殼納米粒子的標(biāo)記腸毒素B單克隆抗體；
(3)金黃色葡萄球菌腸毒素B免疫檢測:
a、將終濃度為5yg/mL、0.0lM碳酸鹽緩沖液為溶劑的金黃色葡萄球菌腸毒素包被抗體K3加入到微孔板中，加入量為10yL/孔，37°C孵育2h;
b、用1mMPBS,0.1% Tween 20的洗液洗步驟a所得微孔板3次，每次間隔3 min;加入封閉液，即質(zhì)量濃度為0.2%明膠，溶劑為0.0lM碳酸鹽緩沖液，37°C孵育2h;
c、用1mMPBS,0.1% Tween 20的洗液洗步驟b所得微孔板3次，每次間隔3 min;按ΙΟΟμL/孔加入金黃色葡萄球菌腸毒素B樣品到微孔板中，37°C反應(yīng)Ih;所述金黃色葡萄球菌腸毒素B樣品的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為100 pg/mL、50 pg/mL、20 pg/mL、10 pg/mL、5 pg/mL、2 pg/mL及0Pg/mLo
[0024]d、用1mM PBS,0.1% Tween 20的洗液洗步驟c所得微孔板3次，每次間隔3 min;加入步驟(2)制備的金銀核殼納米粒子標(biāo)記的金黃色葡萄球菌腸毒素B單克隆抗體1F6，加入量為10yL/孔，37°C反應(yīng)Ih;
e、用1mM PBS.0.l%Tween 20的洗液洗步驟(1所得微孔板4次，每次間隔3 min;最后一次洗板后用吸水紙排干微孔板，然后用拉曼光譜儀掃描樣品信號(hào)，得到檢測結(jié)果。
[0025]基于金銀核殼納米粒子拉曼增強(qiáng)的金黃色葡萄球菌腸毒素SEB免疫檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示。
[0026]檢測結(jié)果如下:若酶標(biāo)微孔板上有拉曼信號(hào)檢出，并被判定為陽性，SEB濃度多
0.002ng/mL;若酶標(biāo)微孔板上沒有拉曼信號(hào)檢出，判定為陰性，則樣品中SEB濃度<0.002ng/mLo
[0027]步驟(I)中所述聚乙烯吡咯烷酮、AgNO3和檸檬酸三鈉，步驟(2)中所述Na2CO3和BSA的溶劑均為超純水。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種基于金銀核殼結(jié)構(gòu)拉曼增強(qiáng)效應(yīng)的金黃色葡萄球菌腸毒素B的免疫檢測方法，其特征在于:首先以對(duì)硝基苯硫酸4-NTP修飾15 nm金納米粒子，用梓檬酸在金納米粒子表面還原硝酸銀形成9nm的銀殼，從而得到內(nèi)嵌拉曼信標(biāo)4-NTP的金銀核殼結(jié)構(gòu)，其具有強(qiáng)拉曼信號(hào)的、區(qū)別于微孔板本底信號(hào)的金銀核殼納米粒子;金銀核殼納米粒子標(biāo)記腸毒素B單克隆抗體，并應(yīng)用于金黃色葡萄球菌腸毒素B的免疫檢測;具體步驟為: (1)金銀核殼納米粒子的合成:采用梓檬酸還原法合成15nm金納米粒子AuNP，通過金巰鍵與信標(biāo)分子4-NTP進(jìn)行偶聯(lián):取5mL合成的金納米粒子8000rpm離心15min，用ImL 1mM磷酸鹽緩沖液PB重懸；加入25yL 200μΜ的對(duì)硝基苯硫酚4-NTP，室溫避光反應(yīng)6_8h ；然后8000rpm離心15 min，加入600yL超純水和300yL質(zhì)量體積比為10%的聚乙烯吡咯烷酮;再加Al20yL 2mM AgNO3和10yL 0.1M的檸檬酸三鈉，迅速震蕩后室溫靜置10 min;8500rpm離心15 min后，棄去上清，用ImL 1mM PB重懸合成金銀核殼納米粒子； 對(duì)金銀核殼納米粒子的銀殼厚度、拉曼信號(hào)通過投射電鏡和拉曼光譜儀進(jìn)行表征； (2)金銀核殼納米粒子標(biāo)記腸毒素B單克隆抗體: ImL步驟(I)制備的金銀核殼納米粒子中加入終濃度為10yg/mL的金黃色葡萄球菌腸毒素B單克隆抗體1F6，加入8yL 0.2 M Na2CO3調(diào)節(jié)pH到7.5，室溫震蕩反應(yīng)2h;向體系中加入50V-L 20mg/mL的BSA，室溫震蕩反應(yīng)2h;8500rpm離心15min后完成金銀核殼納米粒子的標(biāo)記腸毒素B單克隆抗體； (3)金黃色葡萄球菌腸毒素B免疫檢測: a、將終濃度為5yg/mL、0.0lM碳酸鹽緩沖液為溶劑的金黃色葡萄球菌腸毒素包被抗體K3加入到微孔板中，加入量為10yL/孔，37°C孵育2h; b、用1mMPBS,0.1% Tween 20的洗液洗步驟a所得微孔板3次，每次間隔3min;加入封閉液，即質(zhì)量濃度為0.2%明膠，溶劑為0.0lM碳酸鹽緩沖液，37°C孵育2h; c、用1mMPBS,0.1% Tween 20的洗液洗步驟b所得微孔板3次，每次間隔3min;按100μL/孔加入金黃色葡萄球菌腸毒素B樣品到微孔板中，37°C反應(yīng)Ih; d、用1mMPBS,0.1% Tween 20的洗液洗步驟c所得微孔板3次，每次間隔3min;加入步驟(2)制備的金銀核殼納米粒子標(biāo)記的金黃色葡萄球菌腸毒素B單克隆抗體1F6，加入量為10yL/孔，37°C 反應(yīng) Ih; e、用1mMPBS.0.l%Tween 20的洗液洗步驟d所得微孔板4次，每次間隔3min;最后一次洗板后用吸水紙排干微孔板，然后用拉曼光譜儀掃描樣品信號(hào)，得到檢測結(jié)果。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于金銀核殼結(jié)構(gòu)拉曼增強(qiáng)效應(yīng)的金黃色葡萄球菌腸毒素B的免疫檢測方法，其特征在于:步驟(I)中所述聚乙烯吡咯烷酮、AgNO3和檸檬酸三鈉，步驟(2)中所述Na2CO3和BSA的溶劑均為超純水。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于金銀核殼結(jié)構(gòu)拉曼增強(qiáng)效應(yīng)的金黃色葡萄球菌腸毒素B的免疫檢測方法，其特征在于:步驟(3)c中所述金黃色葡萄球菌腸毒素B樣品的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為100 pg/mL、50 pg/mL、20 pg/mL、10 pg/mL、5 pg/mL、2 pg/mL及0 pg/mL。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于金銀核殼結(jié)構(gòu)拉曼增強(qiáng)效應(yīng)的金黃色葡萄球菌腸毒素B的免疫檢測方法，其特征在于步驟(3)e的檢測結(jié)果如下:若酶標(biāo)微孔板上有拉曼信號(hào)檢出，并被判定為陽性，SEB濃度多0.002ng/mL;若酶標(biāo)微孔板上沒有拉曼信號(hào)檢出，判定為陰性，則樣品中SEB濃度< 0.002ng/mL。
【文檔編號(hào)】G01N21/65GK105929150SQ201610273197
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年4月28日
【發(fā)明人】匡華, 王文彬, 胥傳來, 徐麗廣, 馬偉, 劉麗強(qiáng), 吳曉玲, 宋珊珊, 胡擁明
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)