神經(jīng)學(xué)疾病的診斷的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及與IgLON5、IgLON5片段以及IgLON5和IgLON5?片段的變體相關(guān)或利用其的主題。具體地，本發(fā)明涉及包含IgLON5、IgLON5?片段或其變體的一個或多個序列的多肽用于疾病的診斷的用途、用于診斷此類疾病的體外方法、用于疾病的治療的包含IgLON5、IgLON5?片段或其變體的一個或多個序列的多肽或編碼所述多肽的核酸、包含此類多肽的藥物組合物、用于治療此類疾病的方法、結(jié)合IgLON5、IgLON5?片段或其變體的自身抗體、用于分離此類自身抗體的方法、包含此類自身抗體或此類多肽的醫(yī)療或診斷設(shè)備，以及用于疾病的診斷的測試試劑盒，所述測試試劑盒包含此類自身抗體和/或此類多肽。
【專利說明】神經(jīng)學(xué)疾病的診斷
[0001 ]本申請要求歐洲專利申請EP 1 415 4381的優(yōu)先權(quán)，所述歐洲專利申請的內(nèi)容通 過引用整體并入本申請。
[0002] 本發(fā)明涉及與I gL0N5、I gL0N5片段以及I gL0N5和I gL0N5 -片段的變體相關(guān)或利用 其的主題。具體地，本發(fā)明涉及包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序列的多 肽用于疾病的診斷的用途，用于疾病的治療的包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或 多個序列的多肽或編碼所述多肽的核酸、優(yōu)選用于疾病的診斷的結(jié)合IgL0N5、IgL0N5-片段 或其變體的自身抗體、包含含有IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序列的多肽的 藥物組合物、用于診斷疾病的體外方法(其包括步驟:al)將來自受試者的包含抗體的液體 樣品與包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序列的多肽接觸，或a2)將來自受 試者的包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的組織樣品與結(jié)合IgL0N5、IgL0N5-片段或其變 體的抗體接觸，和在al)或a2)后，b)檢測包含抗體和IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的復(fù)合 物的形成）、用于診斷疾病優(yōu)選自身免疫性疾病的體外方法（其包括檢測包含抗體（結(jié)合 IgL0N5的自身抗體）的液體樣品的步驟）、包含此類自身抗體或此類多肽的醫(yī)療或診斷設(shè) 備、用于疾病診斷的測試試劑盒(該測試試劑盒包含含有IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的 一個或多個序列的自身抗體和/或多肽）、用于分離結(jié)合IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的自 身抗體的方法(所述方法包括步驟a)將包含自身抗體的樣品與包含IgL0N5，、IgL0N5-片段 或其變體的一個或多個序列的多肽接觸，所述多肽優(yōu)選被固定，以便形成復(fù)合物，b)分離步 驟a)中形成的復(fù)合物，c)解離步驟b)中分離的復(fù)合物，和d)將自身抗體與包含IgL0N5、 IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序列的多肽分離），和用于治療與受試者的一個或多個 癥狀(選自深眠狀態(tài)、喘鳴、睡眠呼吸暫停、步態(tài)不穩(wěn)、構(gòu)音障礙、吞咽困難、四肢共濟失調(diào)、 聲帶麻痹、四肢及面部的舞蹈病樣運動、記憶和注意力不足、情感淡漠、情緒抑郁、靜坐不能 和排尿紊亂）相關(guān)的疾病的方法(其包括步驟a)降低受試者血液中的結(jié)合I gL0N5、I gL0N5-片段或其變體的自身抗體的濃度和/或b)施用一種或多種免疫抑制藥物物質(zhì)）。
[0003] 睡眠障礙全科醫(yī)生看到最常見的主訴之一。據(jù)估計，在任一時間，約30%的一般公 眾受到顯著睡眠問題的影響。持續(xù)失眠或睡眠質(zhì)量差會影響情緒狀態(tài)和行為，認知功能和 在?；蚬ぷ鞅憩F(xiàn)，家庭凝聚力和一般生活質(zhì)量，心理健康以及還有身體健康。
[0004] 睡眠障礙與廣泛的病癥例如失能、精神病、神經(jīng)學(xué)疾病、內(nèi)分泌學(xué)病癥或其他醫(yī)學(xué) 病癥相關(guān)。因此，具有一個或多個此類癥狀和就醫(yī)的患者處于被誤診的風險中。如果睡眠障 礙可能與神經(jīng)退行性疾病諸如阿爾茨海默氏病或帕金森氏病相關(guān)，則更是如此，因為臨床 醫(yī)生仍然必須依賴于(特別是在疾病的早期階段)檢查患者的認知能力，這是很難以客觀和 確鑿的方式來評估。診斷的最終確認只有通過死后尸檢才可能。
[0005] 雖然可用于在早期階段診斷或證實鑒別診斷的可靠生物標志可用于其它類型的 病癥，諸如自身免疫性代謝紊亂(特別是糖尿病中的自身免疫），它們?nèi)匀挥写淮_立為被 廣泛接受的用于神經(jīng)退行性疾病或相關(guān)病癥的診斷工具。
[0006] 早期診斷的重要性怎么強調(diào)也不過分。許多神經(jīng)退行性疾病，最顯著的阿爾茨海 默氏病和帕金森氏病，不能治愈，但可用于減緩它們的進展的藥物都是可獲得的。診斷越 早，越有機會利用可獲得的藥物獲得患者的全部利益。
[0007] 盡管需要在疾病的早期階段診斷，但重要的是要記住，結(jié)果需要是可靠的，但這并 非總是如此。例如，患者在文獻報道的病例中被診斷為患有阿爾茨海默氏病，盡管他實際上 患有稱為橋本腦炎的自身免疫性病癥。盡管施用商購可得的藥物(諸如橋本腦炎的情況下 可的松)可能改善他們的癥狀，但是此類患者可能會得不到充分的治療并且他們繼續(xù)遭受 痛苦。
[0008] 因此，本發(fā)明內(nèi)在的問題是提供用于診斷與一種或多種來自包含如下癥狀的組的 癥狀相關(guān)的病癥的試劑和方法:深眠狀態(tài)、喘鳴、睡眠呼吸暫停、步態(tài)不穩(wěn)、構(gòu)音障礙、吞咽 困難、四肢共濟失調(diào)、聲帶麻痹、四肢及面部的舞蹈病樣運動、記憶和注意力不足、情感淡 漠、情緒抑郁、靜坐不能和排尿紊亂。
[0009] 另一個本發(fā)明內(nèi)在的問題是提供用于診斷與這些癥狀的一種或多種相關(guān)聯(lián)的神 經(jīng)退行性疾病的方法(其中該方法不需要臨床主治醫(yī)生依靠患者的認知能力的檢查），優(yōu)選 涉及血清學(xué)測定的方法。
[0010] 另一個本發(fā)明內(nèi)在的問題是提供用于診斷由本發(fā)明人鑒定的新型T病變(所述病 變?nèi)杂写┑姆椒?，并與一種或多種選自如下癥狀的癥狀相關(guān):深眠狀態(tài)、喘鳴、睡眠呼 吸暫停、步態(tài)不穩(wěn)、構(gòu)音障礙、吞咽困難、四肢共濟失調(diào)、聲帶麻痹、四肢及面部的舞蹈病樣 運動、記憶和注意力不足、情感淡漠、情緒抑郁、靜坐不能和排尿紊亂。
[0011]另一個本發(fā)明內(nèi)在的問題是提供自身抗體，當在從患者獲取的液體樣品中發(fā)現(xiàn) 時，所述抗體指示所述患者患有神經(jīng)退行性疾病，優(yōu)選地T病變，更優(yōu)選由本發(fā)明人鑒定的 新型T病變。
[0012] 本發(fā)明內(nèi)在的問題由所附獨立和從屬權(quán)利要求的主題來解決。
[0013] 在第一方面，本發(fā)明內(nèi)在的問題通過包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或 多個序列的多肽用于診斷疾病的用途來解決。
[0014] 在第二方面，本發(fā)明內(nèi)在的問題通過用于治療疾病的包含IgL0N5、IgL0N5-片段或 其變體的一個或多個序列的多肽或編碼所述多肽的核酸來解決。
[0015] 在第三方面，本發(fā)明內(nèi)在的問題通過優(yōu)選用于疾病診斷的結(jié)合IgL0N5、IgL0N5-片 段或其變體的自身抗體來解決。
[0016] 在第四方面，本發(fā)明內(nèi)在的問題通過包含含有IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一 個或多個序列的多肽的藥物組合物來解決。
[0017]在第五方面，本發(fā)明內(nèi)在的問題通過用于診斷疾病的體外方法來解決，所述方法 包括步驟al)將包含來自受試者的抗體的液體樣品與包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的 一個或多個序列的多肽接觸，或a2)將來自受試者的包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的 組織樣品與結(jié)合I gL0N5、I gL0N5-片段或其變體的抗體(優(yōu)選根據(jù)第三方面的自身抗體)接 觸，和在步驟al)或a2)之后，b)檢測包含抗體和IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的復(fù)合物的 形成，和/或除了步驟al)/a2)和b)以外，c)檢查受試者的人白細胞抗原(HLA)類型。
[0018]在第五方面的第一實施方案中，使用免疫熒光顯微鏡術(shù)或光譜法、匪R波譜法、免 疫擴散、質(zhì)譜法、放射性、化學(xué)交聯(lián)、表面等離子體共振、非變性凝膠電泳、層析法和/或酶促 活性來檢測復(fù)合物。
[0019]在第六方面，本發(fā)明內(nèi)在的問題通過用于診斷疾病(優(yōu)選自身免疫疾?。┑捏w外方 法來解決，所述方法包括檢測包含抗體(結(jié)合IgL0N5的自身抗體)的液體樣品的步驟。
[0020] 在第七方面，本發(fā)明內(nèi)在的問題通過包含根據(jù)本發(fā)明的第三方面的自身抗體或包 含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序列的多肽的醫(yī)療或診斷設(shè)備來解決。
[0021] 在第八方面，本發(fā)明內(nèi)在的問題通過用于診斷疾病的測試試劑盒來解決，所述測 試試劑盒包含根據(jù)本發(fā)明的第三方面的自身抗體或包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的 一個或多個序列的多肽。
[0022] 在第七和第八方面的第一實施方案中，所述問題通過提供以固定形式存在的包含 IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序列的多肽來解決。
[0023] 在第八方面的第二實施方案(其也是第八方面的第一實施方案的實施方案）中，所 述測試試劑盒包含用于檢測包含抗體和含有IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或多個 序列的多肽的復(fù)合物的手段(means)，優(yōu)選地，其中所述抗體是根據(jù)本發(fā)明第三方面的自身 抗體。
[0024] 在本發(fā)明的任何方面的優(yōu)選實施方案中，疾病選自睡眠障礙、神經(jīng)退行性疾病和 通氣不足，優(yōu)選神經(jīng)退行性疾病，更優(yōu)選t病變。
[0025] 在本發(fā)明的任何方面的優(yōu)選實施方案中，疾病與選自深眠狀態(tài)、喘鳴、睡眠呼吸暫 停、步態(tài)不穩(wěn)、構(gòu)音障礙、吞咽困難、四肢共濟失調(diào)、聲帶麻痹、四肢及面部的舞蹈病樣運動、 記憶和注意力不足、情感淡漠、情緒抑郁、靜坐不能和排尿紊亂的1個或多個癥狀，優(yōu)選2個 或更多個癥狀，更優(yōu)選3個或更多個癥狀，更優(yōu)選4個或更多個癥狀相關(guān)，所述癥狀，最優(yōu)選 地，包括一個或多個睡眠問題、吞咽困難和至少一種記憶問題和情緒抑郁。
[0026]在第九方面，本發(fā)明內(nèi)在的問題通過用于分離結(jié)合IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體 的自身抗體的方法來解決，所述方法包括步驟a)將包含自身抗體的樣品與包含IgL0N5、 IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序列的多肽接觸，所述多肽優(yōu)選被固定，以便形成復(fù)合 物，b)分離步驟a)中形成的復(fù)合物，c)解離步驟b)中分離的復(fù)合物，和d)將所述自身抗體與 包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序列的多肽分離。
[0027]在第十方面，本發(fā)明內(nèi)在的問題通過用于治療受試者中與選自如下癥狀的一個或 多個癥狀相關(guān)的神經(jīng)學(xué)疾病的方法來解決:深眠狀態(tài)、喘鳴、睡眠呼吸暫停、步態(tài)不穩(wěn)、構(gòu)音 障礙、吞咽困難、四肢共濟失調(diào)、聲帶麻痹、四肢及面部的舞蹈病樣運動、記憶和注意力不 足、情感淡漠、情緒抑郁、靜坐不能和排尿紊亂，所述方法包括步驟a)降低受試者血液中的 結(jié)合IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的自身抗體的濃度和/或b)施用一種或多種免疫抑制性 藥物物質(zhì)，其優(yōu)選選自利妥昔單抗、潑尼松、甲潑尼龍、環(huán)磷酰胺、霉酚酸酯、靜脈注射免疫 球蛋白、他克莫司、環(huán)孢霉素、氨甲蝶呤、硫唑嘌呤和/或根據(jù)本發(fā)明的第四方面的藥物組合 物。
[0028]在本發(fā)明的任何方面的優(yōu)選實施方案中，IgL0N5的序列是根據(jù)SEQ ID NO 1的序 列，并且IgL0N5-片段的序列是選自 SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10的序列，優(yōu)選，所 述多肽包含所有序列SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 10。
[0029]在本發(fā)明的任何方面的另一個優(yōu)選實施方案中，以包含編碼所述多肽的核酸的細 胞的形式或以包含所述多肽或其變體的組織的形式提供包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變 體的一個或多個序列的多肽。
[0030] 本發(fā)明基于本發(fā)明人令人驚訝的發(fā)現(xiàn)：存在神經(jīng)退行性疾病，尤其是可與結(jié)合 IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的自身抗體的出現(xiàn)相關(guān)的t病變。
[0031] 此外，本發(fā)明人已驚奇地發(fā)現(xiàn)，存在與選自如下癥狀的一個或多個癥狀相關(guān)的新 型t病變:深眠狀態(tài)、喘鳴、睡眠呼吸暫停、步態(tài)不穩(wěn)、構(gòu)音障礙、吞咽困難、四肢共濟失調(diào)、聲 帶麻痹、四肢及面部的舞蹈病樣運動、記憶和注意力不足、情感淡漠、情緒抑郁、靜坐不能和 排尿紊亂。本發(fā)明人已驚奇地發(fā)現(xiàn)，結(jié)合IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的自身抗體可被用 于診斷所述病癥。
[0032]此外，本發(fā)明人已驚奇地發(fā)現(xiàn)，結(jié)合IgL0N5的自身抗體、IgL0N5-片段或其變體可 以用于疾病的鑒別診斷，所述疾病特征在于以下癥狀中的一個或多個:深眠狀態(tài)、喘鳴、睡 眠呼吸暫停、步態(tài)不穩(wěn)、構(gòu)音障礙、吞咽困難、四肢共濟失調(diào)、聲帶麻痹、四肢及面部的舞蹈 病樣運動、記憶和注意力不足、情感淡漠、情緒抑郁、靜坐不能和排尿紊亂，特別是神經(jīng)退行 性疾病，優(yōu)選地用于將由本發(fā)明人鑒定的新型T病變與其他類型的神經(jīng)退行性疾病區(qū)分開， 更優(yōu)選地是與類似癥狀相關(guān)的T病變。
[0033]本發(fā)明集中在用于診斷和治療的包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或多 個序列的多肽和抗體，特別是結(jié)合IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的自身抗體。IgL0N5是參 與控制神經(jīng)元尋路化&1：11；^11(1；[1^)和突觸發(fā)生的細胞粘附分子家族成員（他811；[1]1〇1：0，1'.， Yamada,M.,Maekawa,S.,Nakashima,T.,Miyata,S.(2008)IgL0N cell adhesion molecule Kilon is a crucial modulator for synapse number in hippocampal neurons，Brain Res 2008; 1224:1-11)。已顯示IgLON家族成員的表達影響1型星形膠質(zhì)細胞的增殖和細胞 Rj(Sugimoto，C.，Morita，S.，Miyata，S.(2012)0verexpressionofIgL0Ncell adhesion molecules changes proliferation and cell size of cortical astrocytes,Cell Biochem Funct.，2012Jul ;30(5) :400_5)，但其確切作用和內(nèi)在作用機 制仍有待闡明。
[0034] IgL0N5和結(jié)合IgLON 5的自身抗體均未在現(xiàn)有技術(shù)中被描述為與神經(jīng)學(xué)疾病(諸 如T病變)相關(guān)，更不用說與其因果相關(guān)，更不用說用于診斷它們。
[0035]在優(yōu)選實施方案中，稱為"IgL0N5"的多肽具有由NP_001094842.1所示的序列，如 同在整個本申請中提及的所有序列登錄號，其是指保存在NCBI數(shù)據(jù)庫(更具體地2013年12 月4日的在線版）中的序列。然而，不僅可以使用多肽，特別是包含IgL0N5的全長序列，具有 在本申請中明確提及(例如明確地按照名稱、序列或登錄號）的確切的氨基酸序列的多肽來 實現(xiàn)本發(fā)明的教導(dǎo)，而且還可使用此類多肽的片段或變體來實現(xiàn)本發(fā)明的教導(dǎo)。
[0036]關(guān)于IgL0N5,術(shù)語"片段"是指小于所述蛋白質(zhì)的全長序列，包含例如在一端或兩 端被截短一個或多個氨基酸的氨基酸序列。或者或另外，此類肽序列可包含一個或多個氨 基酸的內(nèi)部缺失。由此，片段的剩余長度等于或超過一個或多個連續(xù)或構(gòu)象表位的長度，例 如6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、20個、25個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90 個、100個或更多個氨基酸。
[0037]術(shù)語IgL0N5或其片段的"變體"涉及包含與參照氨基酸（即IgL0N5或其片段)具有 至少70、75、80、85、90、92、94、95、96、97、98或99%同一性的氨基酸序列的多肽，其中，更優(yōu) 選，除生物學(xué)活性(例如抗原特異性結(jié)合抗體(優(yōu)選自身抗體），更優(yōu)選自身抗體結(jié)合來自患 有由本發(fā)明人鑒定的新型t病變的患者的IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的能力或多肽的折 疊或結(jié)構(gòu))所必需的那些氨基酸外的氨基酸被缺失或取代，其中可任選以保守方式取代一 個或多個此類必需氨基酸，或可插入另外的氨基酸以便多肽的生物學(xué)活性得以保留?，F(xiàn)有 技術(shù)包括可用于比對兩個給定的核酸或氨基酸序列并計算同一性程度的各種方法，參見， 例如Arthur Lesk(2008), Introduction to bioinformatics,Oxford University Press, 2008，第3版。在優(yōu)選實施方案中，使用(]1118七31￥軟件（1^^;[11，]\1.厶.，1313〇1^11161(18,6.， Brown,N.P.,Chenna,R.,McGettigan,P.A.,Mcffilliam,H.,Valentin,F.,ffallace,I.M., ffilm,A.,Lopez,R.,Thompson,J.D.,Gibson,T.J.,Higgins,D.G.(2007).Clustal ff and Clustal X version 2.0.Bioinformatics，23,2947-2948)〇
[0038] IgL0N5和IgL0N5-片段的此類變體可以例如通過在編碼它們的核酸序列中引入缺 失、插入或取代，或通過化學(xué)合成或修飾來制備。此外，IgL0N5和IgL0N5-片段的變體還可通 過與其它已知的多肽或其變體融合來產(chǎn)生，并且包括活性部位或活性域，優(yōu)選地當與參照 序列的活性部位比對時具有至少70、75、80、85、90、92、94、95、96、97、98或99%序列同一性， 其中如本文中所用，術(shù)語"活性部位"是指小于全長氨基酸序列但保留至少一些生物學(xué)活性 的氨基酸序列，或者，在核酸序列的情況下，編碼小于全長氨基酸序列，但保留至少一些生 物學(xué)活性。例如，蛋白酶的活性部位能夠水解多肽中的肽鍵，并且免疫原性多肽保留結(jié)合抗 體或自身抗體的能力和優(yōu)選當向哺乳動物施用時，引起免疫應(yīng)答發(fā)生，更優(yōu)選自身抗體的 產(chǎn)生。
[0039]術(shù)語核酸的"變體"包含其互補鏈(優(yōu)選在嚴格條件下）與參照核酸或野生型核酸 雜交的核酸。雜交反應(yīng)的嚴格度可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來容易地測定，并且一般取決于 探針長度、洗滌溫度和鹽濃度來經(jīng)驗地計算。一般地，較長的探針需要較高的溫度以進行正 確退火，而較短的探針則需要較低溫度。雜交一般依賴于變性DNA在低于它們的解鏈溫度下 與存在于環(huán)境中的互補鏈退火的能力。探針與可雜交的序列之間的所需同源性的程度越 高，可使用的相對溫度越高。結(jié)果就是較高的相對溫度預(yù)期使反應(yīng)條件更嚴格，而較低溫度 則使反應(yīng)條件不太嚴格。關(guān)于雜交反應(yīng)的嚴格度的其它詳細內(nèi)容和解釋，參見Ausubel， F.M.(1995), Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley&Sons, Inc。此外，本 領(lǐng)域技術(shù)人員可遵照手冊Boehringer Mannheim GmbH(1993)The DIG System Users Guide for Filter Hybridization,Boehringer Mannheim GmbH,Mannheim,Germany and in Liebl,W.,Ehrmann,M.,Ludwig,W?和Schleifer,K.H.(1991)International Journal of Systematic Bacteriology 41:255-260中給出的關(guān)于如何通過雜交鑒定DNA序列的說 明書。在優(yōu)選實施方案中，將嚴格條件用于任何雜交，即，僅當探針與靶序列具有70%或更 高同一性時，雜交才發(fā)生。相對于靶序列具有較低程度的同一性的探針可雜交，但此類雜交 是不穩(wěn)定的并且在嚴格條件下在洗滌步驟中將被除去，例如降低鹽的濃度至2XSSC或，任 選和隨后，降至0.5 X SSC，而以逐漸升高的偏好順序，溫度為約50 °C-68 °C、約52 % -68 °C、約 54 °C-68 °C、約56 °C-68 °C、約58 °C-68 °C、約60 °C -68 °C、約62 °C -68 °C、約64 °C -68 °C、約66 °C -68°C。在特別優(yōu)選實施方案中，溫度為約64°C_68°C或約66°C_68°C?？赡軐Ⅺ}濃度調(diào)整至 0.2\33(：或甚至0.1\33(：?？煞蛛x相對于參照或野生型序列具有至少70、80、90、91、92、93、 94、95、96、97、98、99 %的同一性程度的核酸序列。在優(yōu)選實施方案中，如本文中所用，術(shù)語 核酸序列的變體是指按照遺傳密碼的簡并性，編碼與參照核酸序列編碼的相同的氨基酸序 列及其變體的任何核酸序列。編碼IgL0N5的核酸已在登錄號NM_001101372下保存在NCBI數(shù) 據(jù)庫中。
[0040]包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序列的多肽，當用于實現(xiàn)本發(fā)明 的教導(dǎo)時，可以任何形式和以任何純化程度(從以內(nèi)源形式包含所述多肽的組織或細胞，更 優(yōu)選過表達所述多肽的細胞，此類細胞的粗制或富集的裂解物至為純化的多肽和/或基本 上純的分離的多肽)提供。在優(yōu)選實施方案中，所述多肽是天然多肽，其中如本文中所用，術(shù) 語"天然"、"天然多肽"是指折疊的多肽，更優(yōu)選從組織或細胞、更優(yōu)選從哺乳動物細胞或組 織、任選從非重組組織或細胞純化的折疊的多肽。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述多肽是重 組蛋白，其中如本文中所用，術(shù)語"重組體"是指在產(chǎn)生過程的任何階段使用遺傳工程方法， 例如通過將編碼多肽的核酸融合于用于在細胞或組織中過表達的強啟動子，或通過工程化 多肽本身的序列來產(chǎn)生的多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知用于工程化核酸和編碼的多肽(例如， 于Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F?和Maniatis，T.(1989)，Molecular Cloning，CSH或in Brown T.A. (1986)，Gene Cloning-an introduction，Chapman&Hall)和用于產(chǎn)生純化天然或重組 多肽（例如，手冊 "Strategies for Protein Purification"/'Antibody Purification"， "Purifying Challenging Proteins"，"Recombinant Protein Purification"，"Affinity Chromatography"，"Ion Exchange Chromatography"，"Gel Filtration(Size Exclusion Chromatography)''，"Hydrophobic Interaction Chromatography"，"Multimodal Chromatography"（2009/2010)(由GE Healthcare Life Sciences出版的）中以及Burgess, R.R.，Deutscher，M.P.(2009),Guide to Protein Purification中描述的）的方法。在優(yōu)選 實施方案中，如果各自樣品中至少60、70、80、90、95或99%的多肽由所述多肽組成（如通過 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后考馬斯藍染色和目測觀察判斷的），則多肽是純的。
[0041 ]如果以組織的形式提供包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序列的 多肽，則優(yōu)選所述組織來自哺乳動物大腦，例如人、大鼠、靈長類動物、驢、小鼠、山羊、馬、綿 羊或牛的大腦。如果以非重組細胞的形式提供包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或 多個序列的多肽，則優(yōu)選所述細胞是神經(jīng)元，優(yōu)選海馬神經(jīng)元或來自哺乳動物例如大鼠、 人、靈長類動物、驢、小鼠、山羊、馬、綿羊或牛的神經(jīng)氈的細胞。如果使用細胞裂解物，優(yōu)選 所述細胞裂解物包含與細胞表面相關(guān)的膜。如果以重組細胞的形式提供包含IgL0N5、 IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序列的多肽，則優(yōu)選所述重組細胞是真核生物細胞，諸 如酵母細胞，更優(yōu)選來自多細胞真核生物例如植物、哺乳動物、蛙或昆蟲，最優(yōu)選來自哺乳 動物例如大鼠、人、靈長類動物、驢、小鼠、山羊、馬、綿羊或牛的細胞。例如，可使用利用功能 上編碼包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序列的多肽的核酸轉(zhuǎn)染的HEK293 細胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知用于制備、轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)此類細胞的方法，例如Phe lan，M. C. (2001),Basic Techniques in Mammalian Cell Tissue Culture,John Wiley中描述的那 些方法。
[0042]可以任何類型的構(gòu)象提供根據(jù)本發(fā)明使用的包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體 的一個或多個序列的多肽。例如包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序列的多 肽可以是基本上未折疊的，部分或完全折疊的多肽。在優(yōu)選實施方案中，包含IgL0N5、 IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序列的多肽在如下意義上是折疊的：所包含的IgL0N5 表位為折疊域的一部分和，在更優(yōu)選的實施方案中，基本上采用由天然蛋白質(zhì)在其天然環(huán) 境中采用的折疊。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知適合于確定多肽是否是折疊的以及如果其是折疊 的，則其具有哪種結(jié)構(gòu)的方法，例如限制性蛋白水解、NMR波譜法、CD波譜法或X-射線晶體學(xué) (參見例如Banaszak L.J. (2008) foundations of Structural Biology,Academics Press,或Teng Q.(2013),Structural Biology:Practical Applications,Springer)，優(yōu) 選使用多維NMR波譜法。在更優(yōu)選的實施方案中，包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個 或多個序列的多肽是折疊的，以便其采用天然蛋白在其天然環(huán)境中的折疊，并且包含選自 SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID N04、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10或其變體的一個或多個序列，優(yōu)選它們中的全部。包含 IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序列的多肽可以是融合蛋白，其包含除 IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體外的氨基酸序列，特別是C-末端或N-末端標簽，優(yōu)選C-末端 標簽，如本文中所用，所述標簽，在優(yōu)選實施方案中，是具有功能的另外的序列基序或多肽， 其有一些生物學(xué)功能或物理功能，并且可以例如用于純化、固定、沉淀或鑒定包含IgL0N5、 IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序列的多肽。在更優(yōu)選的實施方案中，所述標簽是能夠 特異性結(jié)合配體的序列或域，例如選自His標簽、硫氧還蛋白、麥芽糖結(jié)合蛋白、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、熒光標簽的標簽，例如選自綠色熒光蛋白（NCBI登錄號:AAB51348.1)、紅色熒光 蛋白（AB038175.1)、黃色熒光蛋白（AAA27544.1)、橙色熒光蛋白（AAP55761.1)、藍色熒光蛋 白（YP_008577.1)或其變體或具有其它一級序列的已知功能性熒光同源物以及它們的變體 和/或表位標簽的標簽，例如選自1^〇41 &8、撤和￥5的標簽。在優(yōu)選實施方案中，所述多肽具 有共價修飾諸如生物素標簽。
[0043]根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，可將抗體、優(yōu)選結(jié)合IgL0N5_片段或其變體的自身抗體用于診 斷疾病。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉用于純化抗體的方法，例如Herman son, G.T.，Ma Ilia, A.K., Smith,P.K.(1992),Immobilized Affinity Ligand Techniques,San Diego:Academic Press中描述的那些方法。簡言之，固定特異性結(jié)合目標抗體的抗原(所述抗原為IgL0N5、 IgL0N5-片段或其變體)并將其用于從充足的來源純化(通過親和層析）目標抗體。來自患有 由本發(fā)明人鑒定的新型t病變的患者的包含抗體的液體樣品可用作來源。
[0044]包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序列的多肽，在本發(fā)明內(nèi)使用 時，可以是固定的多肽。在優(yōu)選實施方案中，如本文中所用，術(shù)語"固定的"是指結(jié)合于(更優(yōu) 選經(jīng)由共價鍵、靜電相互作用、封裝或包封，例如通過在凝膠中使球狀多肽變性，或經(jīng)由疏 水相互作用，最優(yōu)選經(jīng)由一個或多個共價鍵)不溶于水性溶液的固體載體的分子。各種合適 的載體，例如紙、金屬、硅或玻璃表面、微流體通道、膜、珠例如磁珠、柱層析介質(zhì)、生物芯片、 聚丙稀酰胺凝膠等已在文獻例如Kim，D.，Herr，A.E. (2013)，Protein immobilizsation techniques for microfluidic assays，Biomicrofluidics 7(4) ,041501 中進行了描述。 這樣，可以例如通過過濾、離心或傾析以直接的方式將固定的分子連同不溶性載體與水性 溶液分離。可以可逆或不可逆方式固定分子。例如，如果分子通過離子相互作用（其可通過 添加高濃度的鹽來掩蔽)與載體相互作用，或如果通過可切割的共價鍵諸如可通過添加含 硫醇試劑來切割的二硫橋結(jié)合分子，則固定是可逆的。相反，如果分子經(jīng)由在水性溶液中不 能被切割的共價鍵，例如通過環(huán)氧化物基團與胺基團反應(yīng)形成的鍵(如常用于將賴氨酸側(cè) 鏈耦聯(lián)于親和柱的)拴系至載體，則固定是不可逆的。所述蛋白質(zhì)可以例如通過固定具有對 于所述分子的親和力的抗體或其它實體，隨后形成復(fù)合物使得分子_抗體復(fù)合物被固定來 進行間接固定。各種固定分子的方式描述于文獻中，例如在Kim, D.，Herr，A.E. (2013)， Protein immobilizsation techniques for microfluidic assays，Biomicrofluidics 7 (4) ,041501中。另外，用于固定反應(yīng)的各種試劑和試劑盒是商購可得的，例如來自Pierce Biotechnology。
[0045]優(yōu)選設(shè)計用于實現(xiàn)本發(fā)明教導(dǎo)的多肽，以便其具有免疫原性，更優(yōu)選以便其結(jié)合 來自患有由本發(fā)明人鑒定的新型t病變的患者的結(jié)合IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的自身 抗體。在一個實施方案中，此類多肽包含具有6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、20個、25 個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個或更多個，優(yōu)選至少9個但不超過16個來 自NP_001094842.1(IgL0N5)或其變體的連續(xù)氨基酸的一段序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉用于 設(shè)計具有足夠免疫源性的肽的指導(dǎo)方針，例如Jackson，D.C.，F(xiàn)itzmaurice，C.J.，Brown, L.E.,Zeng,ff.(1999),Preparation and properties of totally synthetic immunogenes ,Vaccine第 18卷，Issues 3-4, September 1999，第355-361頁；和Black ,M., Trent,A?，Tirrell,M?和Olive,C?(2010),Advances in the design and delivery of peptide subunit vaccines with a focus on Toll-like receptor agonists,Expert Rev Vaccines,20lOFebruary;9(2): 157-173中描述的那些指導(dǎo)方針。簡言之，期望肽盡可 能多地滿足以下要求：（a)其具有高度的親水性，（b)其包含選自天冬氨酸、脯氨酸、酪氨酸 和苯丙氨酸的一個或多個殘基，（c)其具有較高的特異性，與其它已知的肽或多肽不具有或 幾乎不具有同源性，（d)其需要是充分可溶的以及(e)除非因特殊原因而要求，否則其不包 含糖基化或磷酸化位點。或者，可按照生物信息學(xué)方法，例如由Moreau，V.，F(xiàn)leury，C.， Piquer，D?，Nguyen，C?，Novali，N?，Vi 1lard，S?，Laune，D?，Granier，C?和Molina，F(xiàn)? (2008) ,PEP0P:Computational design of immunogenic peptides,BMC Bioinformat ics2008,9:71中描述的那些方法。
[0046]在優(yōu)選實施方案中，如本文中所用，術(shù)語"診斷"是指目的在于查明患者在過去、診 斷時或?qū)硎欠窕加屑膊』虿“Y或者將來是否比一般受試者可能或更可能患有疾病或病 癥，以查明疾病是如何進展的或?qū)砜赡苋绾芜M展，或評估患者對于某一治療(例如免疫抑 制藥或減緩神經(jīng)退行性疾病的藥物的施用）的反應(yīng)性的任何類型的方法。換句話說，術(shù)語診 斷不僅包括診斷，而且還包括預(yù)測和/或監(jiān)測疾病或病癥的過程。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的 是，臨床醫(yī)生只基于單一診斷參數(shù)通常不能得出患者患有或可能患有疾病、病況或病癥的 結(jié)論，而是需要考慮其它方面，例如其它自身抗體、標志物、血液參數(shù)、患者癥狀的臨床評估 或醫(yī)學(xué)成像或其它無創(chuàng)方法諸如多導(dǎo)睡眠圖的結(jié)果來獲得結(jié)論性診斷。參見Baenkler H.ff.(2012),General aspects of autoimmune diagnostics,in Renz,H.,Autoimmune diagnostics,2012,de Gruyter，第3頁。診斷劑或方法的值還可存在排除一種疾病的可能 性，從而允許另一種疾病的間接診斷。因此，術(shù)語"診斷"優(yōu)選不暗示根據(jù)本發(fā)明的診斷方法 或試劑將足以完成診斷。替代地或除了本發(fā)明的診斷方法以外，可進行通過多導(dǎo)睡眠圖或 人白細胞抗原分型的一個或多個步驟檢查來診斷疾病，優(yōu)選由本發(fā)明人鑒定的新型t病變。 本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉這些方法，所述方法也在現(xiàn)有技術(shù)中，例如在Kryger，M. H，Roth T， Dement WC(2005)，Principles and Practice of Sleep Medicine(第4版） .Philadelphia:Elsevier Saunders中和Zane，H.D ? (2001) Immunology_Theoretical& Practical Concepts in Laboratory Medicine,ff.B.Saunders Company中（特別在第14章 中）進行了描述。
[0047]包含來自IgL0N5、IgL0N5_片段或其變體的一個或多個序列的本發(fā)明的多肽和/或 編碼所述多肽的核酸可用于治療疾病，用于制造用于治療疾病的藥物等。所述疾病優(yōu)選選 自睡眠障礙、神經(jīng)退行性疾病和通氣不足，優(yōu)選為神經(jīng)退行性疾病，更優(yōu)選為T病變，最優(yōu)選 為由本發(fā)明人鑒定的新型T病變。
[0048]包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序列的多肽可以包含和/或表達 編碼所述多肽的核酸的細胞的形式來提供。如果使用包含編碼本發(fā)明的多肽或其變體的序 列的核酸，則這樣的核酸可以是未經(jīng)修飾的核酸。在優(yōu)選實施方案中，所述核酸是本身非天 然存在的并且相較于天然核酸包含至少一個修飾，例如同位素成分或化學(xué)修飾，例如甲基 化、序列修飾、標記等(表示合成來源）的核酸。在優(yōu)選實施方案中，所述核酸是重組核酸或 部分或核酸，并且，在更優(yōu)選的實施方案中，為載體的一部分，其中其可功能性地與允許所 述核酸表達、優(yōu)選過表達的啟動子連接。在優(yōu)選實施方案中，所述核酸存在于能夠表達其的 細胞中，使得產(chǎn)生本發(fā)明的多肽或其變體和更優(yōu)選地，將所述多肽或其變體引導(dǎo)至細胞表 面。可按照本發(fā)明使用包含編碼包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序列的多 肽的核酸的所述細胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉用于合成、修飾和擴增這樣的核酸和使用這樣 的核酸(優(yōu)選在允許所述核酸在細胞中瞬時或永久維持或表達的載體中）轉(zhuǎn)染細胞的方法。 本領(lǐng)域技術(shù)人員還熟悉合適的載體，其中有許多是商購可得的，例如來自O(shè)rigene。例如，可 使用編碼具有C-末端GFP的融合構(gòu)建體的載體。所述細胞可以是真核生物或原核生物來源 的，優(yōu)選為哺乳動物細胞，例如J1EK293細胞。包含編碼包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的 一個或多個序列的多肽的核酸的細胞可以是重組細胞或分離的細胞，其中術(shù)語"分離的"意 指富集細胞，以便相較于所述細胞的野生型的環(huán)境，存在較少的其它分化或物種的細胞或 實際上無此類其它細胞。
[0049]根據(jù)本發(fā)明，提供了能夠特異性結(jié)合IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的抗體，例如 自身抗體。在優(yōu)選實施方案中，如本文中所用，術(shù)語"抗體"是指任何基于免疫球蛋白的結(jié)合 部分，更優(yōu)選包含至少一個免疫球蛋白重鏈和一個免疫球蛋白輕鏈的結(jié)合部分，包括、但不 限于單克隆或多克隆抗體以及抗體的變體，特別是片段，所述結(jié)合部分能夠與抗原形成復(fù) 合物。在優(yōu)選實施方案中，如本文中所用，術(shù)語"特異性結(jié)合"意指所述結(jié)合強于特征在于1 X 1 (T5M，更優(yōu)選1 X 1 (T7M，更優(yōu)選1 X 1 (T8M，更優(yōu)選1 X 1 (T9M，更優(yōu)選1 X 1 ，更優(yōu)選1 X 10 ~M，更優(yōu)選1X1(T12M的解離常數(shù)的結(jié)合反應(yīng)，如使用Biacore設(shè)備通過表面等離子體共振 技術(shù)測定的。所述抗體可以是分離的或存在于包含其它抗體、多肽、代謝物、細胞等的混合 物中。如果抗體是自身抗體，則其可以是作為異質(zhì)的自身抗體制劑的一部分或可以是均一 的自身抗體，其中異質(zhì)制劑包含多種不同的自身抗體種類(如可通過從人供體的血清制備 獲得的，例如使用固定的抗原通過親和層析純化能夠結(jié)合于所述抗原的任何自身抗體）。優(yōu) 選地所述抗體是自身抗體，更優(yōu)選來自IgG類別的自身抗體，最優(yōu)選來自包含IgGl、IgG2和 IgG4的亞類的組，尤其是IgG4?？商腔蚍翘腔贵w。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉可用于鑒 定、產(chǎn)生和純化抗體及其變體的方法，例如EP 2 423226A2和其中的參考文獻中描述的那些 方法。所述抗體可以本身或與包含I gL0N5、I gL0N5-片段或其變體的多肽的組合(例如作為 復(fù)合物)用作診斷劑。
[0050]本發(fā)明提供了包含含有IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序列的多肽 的藥物組合物，所述組合物優(yōu)選適合用于向受試者，優(yōu)選哺乳動物受試者，更優(yōu)選向人施 用。這樣的藥物組合物可包含藥學(xué)上可接受的載體。所述藥物組合物可以例如口服、腸胃 外、通過吸入噴霧、經(jīng)局部、通過滴眼劑、經(jīng)直腸、經(jīng)鼻、經(jīng)頰、經(jīng)陰道或經(jīng)由植入式貯器施 用，其中如本文中所用，術(shù)語"腸胃外"包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨 內(nèi)（instrasternal)、鞘內(nèi)、病灶內(nèi)和顏內(nèi)注射或輸注技術(shù)。藥物組合物可以合適的劑型(例 如膠囊、片劑和水性懸浮液和溶液)提供，優(yōu)選以無菌形式提供。它可用于治療疾病的方法， 該方法包括向受試者施用有效量的包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的多肽。
[00511本發(fā)明涉及包含結(jié)合IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的抗體的復(fù)合物。這樣的復(fù)合 物可用作用于診斷疾病的方法的一部分或被作為所述方法的一部分來進行檢測?？蓪碜?受試者的包含抗體的液體樣品用于實踐所述方法。這樣的液體樣品可以是來自受試者的包 含一組代表性抗體的任何體液，優(yōu)選包含來自受試者的IgG免疫球蛋白類別，更優(yōu)選來自包 含IgG 1、IgG2和IgG4亞類的組，最優(yōu)選來自IgG4亞類的抗體的樣品。例如，樣品可為腦脊液 (CSF)、血液或血清、淋巴、組織間隙液，優(yōu)選為血清或CSF，更優(yōu)選血清。
[0052]另外，本發(fā)明的方法還可包括檢查受試者的人白細胞抗原(HLA)類型的步驟，優(yōu)選 通過將取自患者的血液樣品經(jīng)歷HLA分型。檢測到來自包含HLA-DQB1*0501，HLA-DRB1*1001 和HLA-B27的組的任何等位基因，優(yōu)選HLA-DQB1*0501與HLA-DRB1*1001的組合，表示患者患 有或?qū)⒒加屑膊?、更?yōu)選神經(jīng)學(xué)疾病、更優(yōu)選t病變、最優(yōu)選由本發(fā)明人鑒定的新型t病變的 風險增加。
[0053]將包含抗體的液體樣品與包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序列 的多肽接觸的步驟，可通過在與包含所述多肽和結(jié)合IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的抗 體，優(yōu)選自身抗體的復(fù)合物的形成相容的條件下，在包含抗體的樣品存在的情況下溫育所 述多肽的固定形式來進行。任選地，隨后可除去隨后耗盡結(jié)合IgL0N5、IgL0N5-片段或其變 體的抗體的液體樣品以促進復(fù)合物的檢測。任選地，可考慮一個或多個洗滌步驟。
[0054]或者，可使用包含含有IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的組織的樣品而非液體樣 品。組織樣品優(yōu)選是神經(jīng)元來源的，可以是腦組織的樣品（優(yōu)選從選自下丘腦、下丘腦前區(qū) 和腦干的被蓋，更優(yōu)選小腦、例如大鼠小腦的腦切片獲取的）。隨后可將這樣的樣品（其可呈 現(xiàn)固定在載體例如載玻片上（以用于顯微鏡分析）的組織切片的形式）與本發(fā)明的結(jié)合于 IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的抗體，優(yōu)選自身抗體接觸。優(yōu)選標記該抗體以允許與結(jié)合 IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的內(nèi)源性抗體相區(qū)別，以便新形成的復(fù)合物可被檢測和任選 被定量。如果所形成的復(fù)合物的量低于在獲自健康受試者的樣品中發(fā)現(xiàn)的量，則從其已從 其獲取檢查的樣品的受試者可能患有疾病。
[0055]證實包含抗體和IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的復(fù)合物的存在或不存在的任何 數(shù)據(jù)可與參照數(shù)據(jù)相關(guān)。例如，檢測到所述復(fù)合物表明提供所分析的樣品的患者已經(jīng)患有、 患有、或?qū)砜赡芑加杏杀景l(fā)明人鑒定的新型T病變。如果患者先前已被診斷，則可使在兩 個運行中檢測到的復(fù)合物的量與查明疾病的進展和/或治療的成功相關(guān)。例如，如果發(fā)現(xiàn)復(fù) 合物的量增加，則可得出疾病正在進展和/或任何嘗試的治療是不成功的結(jié)論。
[0056]可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法檢測包含抗體和IgL0N5、IgL0N5-片段或 其變體的復(fù)合物，所述方法是例如免疫熒光顯微鏡術(shù)或波譜法、發(fā)光法、NMR波譜法、免疫擴 散、放射性、化學(xué)交聯(lián)、表面等離子體共振、非變性凝膠電泳或酶促活性。雖然這些方法中的 一些允許直接檢測到復(fù)合物，但優(yōu)選標記結(jié)合伴侶之一，優(yōu)選地抗體或，更優(yōu)選結(jié)合抗體 (其結(jié)合IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體或包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或多個 序列的多肽）的第二抗體，以便可由于標記的固有性質(zhì)例如熒光、放射性、酶促活性、NMR或 MRI波譜中的可見性等而特異性檢測復(fù)合物。在優(yōu)選實施方案中，使用選自免疫印跡、斑點 印跡、蛋白質(zhì)微陣列、ELISA、細線印跡放射免疫測定(line blot radioimmune assay)和間 接免疫熒光顯微鏡術(shù)的方法進行診斷或預(yù)后?；蛘?，可以互補方式使用這些方法中的不止 一種方法以獲得更可靠的結(jié)果。
[0057] 在優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的預(yù)后、診斷、方法或測試試劑盒涉及診斷方法， 其選自免疫擴散技術(shù)、免疫電泳技術(shù)、光散射免疫分析、光散射免疫測定、凝集技術(shù)、標記免 疫測定法諸如來自包含放射性標記免疫測定法、酶免疫測定、化學(xué)發(fā)光免疫測定和免疫熒 光技術(shù)的組的那些測定法。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉這些方法，所述方法也在現(xiàn)有技術(shù)中，例如 在Zane，H.D?(2001)，Immunology-Theoretical&Practical Concepts in Laboratory MedicineSaunders Company中（特別在第 14章中）進行了描述。
[0058] 在優(yōu)選實施方案中，細線印跡用于進行根據(jù)本發(fā)明的診斷方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員 熟悉實驗設(shè)置，其已在現(xiàn)有技術(shù)中進行了描述(1^〇1111:，0.和〇38(311，6.4.(1989)，1'116 1;[116 blot:an immunoassay for monoclonal and other antibodies.Its application to the serotyping of gram-negative bacteria.J.Immunol.Methods,125(1-2),57-65； W02013041540)。簡言之，可將一種或多種目標抗原（在本發(fā)明的情況下，包含IgL0N5、 IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序列的多肽)附接于通常與另外的抗原和對照組合的 載體，例如硝酸纖維素膜。隨后將硝酸纖維素載體暴露于包含抗體的樣品（諸如稀釋的血 清）。如果樣品包含結(jié)合于抗原的抗體，則形成可被檢測（優(yōu)選通過與結(jié)合于第一抗體的恒 定區(qū)的第二抗體溫育）的復(fù)合物，所述第二抗體包含可檢測的標記，例如放射性同位素、熒 光染料或，在優(yōu)選實施方案中，與第二抗體融合或連接的活性酶，諸如堿性磷酸酶，所述酶 可使用生色底物接著簡單的目視檢查來容易地測定。合適的試劑、裝置和軟件包是商購可 得的，例如來自 EUROIMMUN，Liibeck，Germany 0
[0059] 在另一個優(yōu)選實施方案中，與本發(fā)明的教導(dǎo)相符的預(yù)后、診斷、方法或測試試劑盒 設(shè)想了間接免疫熒光的使用。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉此類技術(shù)和合適的樣品的制備，這在現(xiàn) 有技術(shù)中進行 了描述（US4647543, Voigt，J.，Krause，C.，RollW^dte:!*，E， Saschenbrecker,S.,Hahn,M.,Danckwardt,M.,Feirer,C.,Ens,K,Fechner,K,Barth,E, Martinetz,T .和 Stacker, W.(2012)，Automated Indirect Immunofluorescence Evaluation of Antinuclear Autoantibodies on HEp_2Cel Is，'，Cl inical and Developmental Immunology，第2012卷，doi:10.1155/2012/65105;Bonilla，E.，F(xiàn)rancis， L.，Allam，F(xiàn)?等，"Immunofluorescence microscopy is superior to fluorescent beads for detection of antinuclear antibody reactivity in systemic lupus erythematosus patients，" Cl inical Immunology，第124卷，第1期，第18-21 頁，2007) 〇簡 言之，用包含抗原(在本發(fā)明的情況下，包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序 列的多肽)的細胞或組織切片包被載體，諸如用于顯微鏡術(shù)的蓋玻片。將包含抗原的載體暴 露于包含抗體的患者樣品（諸如稀釋的血清）。如果樣品包含結(jié)合所述抗原的抗體，則可優(yōu) 選地通過用包含熒光染料(諸如熒光素）的第二抗體溫育，隨后使用熒光顯微鏡術(shù)目視檢查 來檢測所得的復(fù)合物。合適的試劑、裝置和軟件包是商購可得的，例如來自EUR0MMUN，Lti beck，Germany〇
[0060]在本發(fā)明的范圍內(nèi)，提供了醫(yī)療或診斷設(shè)備，其包含自身抗體或含有根據(jù)本發(fā)明 的IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序列的多肽。優(yōu)選地，此類醫(yī)療或診斷設(shè)備 包含呈允許以直接方式將其與水性溶液、更優(yōu)選液體人樣品接觸的形式的含有IgL0N5、 IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序列的多肽。具體地，可將包含IgL0N5、IgL0N5-片段或 其變體的一個或多個序列的多肽固定在載體表面上，所述載體包含、但不限于玻璃板或載 片、生物芯片、微量滴定板、珠例如磁珠、層析柱、膜等。示例性醫(yī)療設(shè)備包括細線印跡、微量 滴定板和生物芯片。除了本發(fā)明的包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序列的 多肽以外，醫(yī)療或診斷設(shè)備可包括另外的多肽，例如陽性或陰性對照或已知具有診斷價值 的結(jié)合自身抗體的其它抗原，特別是和與選自深眠狀態(tài)、喘鳴、睡眠呼吸暫停、步態(tài)不穩(wěn)、構(gòu) 音障礙、吞咽困難、四肢共濟失調(diào)、聲帶麻痹、四肢及面部的舞蹈病樣運動、記憶和注意力不 足、情感淡漠、情緒抑郁、靜坐不能和排尿紊亂的一個或多個癥狀相關(guān)的其它疾病相關(guān)的那 些抗原，所述疾病優(yōu)選選自睡眠障礙、神經(jīng)退行性疾病和通氣不足。
[0061]本發(fā)明的教導(dǎo)提供了用于診斷與選自如下癥狀的一種或多種癥狀相關(guān)的疾病的 試劑盒:喘鳴、睡眠呼吸暫停、步態(tài)不穩(wěn)、構(gòu)音障礙，吞咽困難、四肢共濟失調(diào)、聲帶麻痹、四 肢及面部的舞蹈病樣運動、記憶和注意力不足、情感淡漠、情緒抑郁、靜坐不能和排尿紊亂。 優(yōu)選所述疾病選自睡眠障礙、神經(jīng)退行性疾病和通氣不足。這樣的試劑盒可包括詳述如何 使用該試劑盒和用于將包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序列的多肽與來 自受試者、優(yōu)選人受試者的體液樣品接觸的裝置（例如細線印跡）的說明書，其中將包含 IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序列的多肽固定在細線印跡上。此外，該試劑 盒可包括陽性對照，例如一個批次的已知結(jié)合IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的自身抗體或 重組抗體和陰性對照，例如對于IgL0N5蛋白質(zhì)、IgL0N5-片段或其變體具有不可檢測的親和 力的蛋白質(zhì)（諸如牛血清白蛋白）。最后，這樣的試劑盒可包含用于制備校準曲線的標準溶 液。
[0062]在優(yōu)選實施方案中，所述試劑盒包含用于檢測包含含有IgL0N5、IgL0N5-片段或其 變體的一個或多個序列的多肽和結(jié)合IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的抗體的復(fù)合物的手 段。此類手段優(yōu)選為結(jié)合所述復(fù)合物和修飾所述復(fù)合物或具有標記以便使復(fù)合物可檢測的 試劑。例如，所述手段可以是標記的第二抗體，其在除被一抗識別的結(jié)合位點外的結(jié)合位點 上結(jié)合所述多肽，或結(jié)合一抗的恒定區(qū)?；蛘?，所述手段可以是化學(xué)連接抗體與包含 IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序列的多肽的交聯(lián)劑，這樣可基于其增加的分 子量，例如通過凝膠電泳或尺寸排阻層析來鑒定所述復(fù)合物。
[0063]本發(fā)明提供了用于分離結(jié)合包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序 列的多肽的抗體、優(yōu)選自身抗體的方法，其包括步驟a)將包含抗體的樣品與包含IgL0N5、 IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序列的多肽接觸，以便形成復(fù)合物，b)分離步驟a)中形 成的復(fù)合物，c)解離步驟b)中分離的復(fù)合物，和d)將抗體與包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其 變體的一個或多個序列的多肽分離。來自患有由本發(fā)明人鑒定的新型t病變的患者的樣品 可用作抗體的來源?；蛘?，抗體可以是重組抗體。優(yōu)選將多肽固定例如在適合用于親和層析 的柱子的基質(zhì)上或在磁珠上，因為如果是這種情況，其在步驟b)中直接分離包含多肽和抗 體的復(fù)合物。隨后，可在步驟c)將抗體與固定的抗原分離，例如通過添加過量的非固定化抗 原，或通過添加例如高濃度鹽酸胍(guanidinium chloride)或氯化鈉的干擾分子內(nèi)相互作 用的試劑洗脫抗體，如果靜電相互作用是維持復(fù)合物所必需的，則使用后者。本領(lǐng)域技術(shù)人 員熟悉進行這些步驟的每一個步驟的方法。合適的方法在現(xiàn)有技術(shù)中，例如手冊"Affinity chromatography"，"Strategies for Protein Purification"和"Antibody Purification"（2009/2010)(由GE Healthcare Life Sciences出版的）中進行了描述。
[0064] 本發(fā)明提供了用于治療受試者中由本發(fā)明人鑒定的新型t病變的方法，其包括步 驟a)降低受試者血液中的結(jié)合IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的自身抗體的濃度和/或b)施 用一種或多種免疫抑制性藥物物質(zhì)(優(yōu)選選自利妥昔單抗、潑尼松、甲潑尼龍、環(huán)磷酰胺、霉 酚酸酯、靜脈注射免疫球蛋白、他克莫司、環(huán)孢霉素、氨甲蝶呤、硫唑嘌呤)和/或根據(jù)本發(fā)明 的藥物組合物，其中可替代上文明確提及的物質(zhì)或除所述物質(zhì)外，還可使用可在將來成為 可獲得的任何其它免疫抑制性藥物物質(zhì)?？赏ㄟ^從患者獲得血液，將其與包含IgL0N5、 IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序列的多肽接觸，隨后將耗盡結(jié)合IgL0N5、IgL0N5-片 段或其變體的自身抗體的血液分離并將其重新施用至患者來降低結(jié)合IgL0N5、IgL0N5-片 段或其變體的自身抗體的濃度。優(yōu)選固定包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或多個 序列的多肽，將從患者取出的血液與所述固定的多肽接觸，并以連續(xù)的方式將血液重新施 用至患者?；蛘撸上蚧颊呤┯冒琁gL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序列的多 肽或根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，使得在患者的身體中循環(huán)的自身抗體與施用的復(fù)合物形成 復(fù)合物，而非靶向內(nèi)源性IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體。
[0065] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的是，可將整個本申請中討論的任何優(yōu)選實施方案應(yīng)用于 本發(fā)明的任何方面。
[0066] 本發(fā)明通過以下附圖和的非限制性序列和實施例來進一步舉例說明，可從其獲得 本發(fā)明的進一步特征、實施方案、方面和有利方面。
[0067]圖1顯示患者的睡眠記錄。A.睡眠結(jié)構(gòu)圖；B.覺醒、分離和周期性運動;C.密度譜陣 列(DSA)顯示參考了電極02的電極C3中腦電圖頻率(0-17HZ)的功率譜。較暖的色調(diào)顯示更 占優(yōu)勢的頻率，較冷的色調(diào)表示不占優(yōu)勢的頻率?？s寫:Rems，快速眼球運動;RBD: REM酬民 行為障礙;PLM:周期性四肢運動;RPLM;快速周期性腿運動。
[0068] 圖2顯示舉例說明每個睡眠狀態(tài)的多導(dǎo)睡眠圖時間段（polysomnograhic epochs )，也參見圖1。A:睡眠開始，其特征在于具有彌散性0活動和在左AT EMG通道上特別 顯著的快速周期性腿運動的無差別的（undifferentiated)NREM睡眠;B:N2睡眠，其具有一 連串四聯(lián)體(箭頭)形式的K復(fù)合波，具有與姿勢和發(fā)聲相關(guān)的四肢的EMG表面中頻繁的非周 期肌階段活動;C:REM睡眠，其具有典型的快速眼球運動和EEG特征(具有過度的階段性和強 直性肌肉活動和對于REM睡眠行為障礙是典型的身體抽搐）;D:N3睡眠，其具有彌散性S活動 和13Hz的良好確定的睡眠紡錘波(箭頭）而無身體/四肢運動?？s寫:EEG:腦電圖；EMG:肌電 圖；E0G:眼電圖；Chin:頦肌的肌電圖；EKG:心電圖；FDS:指淺屈肌左（L)和右(R);EDB:趾短 伸肌左(L)和右(R):AT:脛骨前肌左(L)和右(R);NAS:鼻氣流;TH0:胸部呼吸運動;ABD:腹部 呼吸運動;注意，時間/EEG電壓的標定標志。
[0069] 圖3顯示患者的抗體與大鼠腦和海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)物的反應(yīng)性。（A)利用患者的 CSF免疫染色的大鼠腦的矢狀切面:在神經(jīng)氈中存在當用對照CSF溫育大鼠腦切片時未看到 的彌散性染色(B)。免疫反應(yīng)性在小腦(C)中是特別強勁的，其中存在分子層和顆粒細胞層 的突觸小球(D)的彌散性染色。(E)利用患者的血清溫育(非透化的）的大鼠海馬神經(jīng)元的培 養(yǎng)物顯示與細胞表面抗原的強烈反應(yīng)性。（D)利用蘇木精復(fù)染色。A和B中的比例尺=1000y m，C = 200iim，D = 50iim和E = 20 □ ym。
[0070]圖4顯示針對IgL0N5的抗體的IgG同種型分析。在用特異于人IgGl(A)、IgG2(B)、 IgG3(C)和IgG4的抗體溫育后患者的血清與大鼠海馬的反應(yīng)性(D)。只有用IgG4的觀察到強 勁的神經(jīng)毯免疫染色。比例尺= 200IZIiim。
[0071] 圖5顯示使用基于HEK293細胞的測定檢測IgL0N5抗體。轉(zhuǎn)染HEK293細胞以表達 EGFP標記的I gL0N5，并利用患者(A-C)或?qū)φ?D-F)血清溫育活的未透化的所述細胞?；颊?血清而非對照血清使特異性表達IgL0N5的細胞（紅色）的細胞表面染色，如通過EGFP熒光 (綠色）顯示的。將兩個反應(yīng)性合并示于C中。利用DAPI復(fù)染細胞核。比例尺= 20mi。
[0072] 圖6顯示t病變的分布。圖A1-F1對應(yīng)于患者2,圖A2-F2對應(yīng)于患者5。適度量的AT8 免疫反應(yīng)性神經(jīng)氈線和神經(jīng)原纖維纏結(jié)在下丘腦核群(B1，A2.下丘腦后核;評分++的實例） 和丘腦前部(A1，B2:左圖）中被檢測到，但在兩種病例的側(cè)和后丘腦神經(jīng)元中完全不存在 (A1，B2,右圖；評分0的實例）。雖然在病例5和病例2中，橋腦被蓋分別受到輕度(D2;評分+的 實例）和適度(C1)影響，但腦橋基底部(basis pontis)的n.propii的神經(jīng)元顯示廣泛的t-病變(D1;評分+++的實例），這在病例5中未觀察到(C2)。相反地，在病例5 (F2;評分+++的實 例）中檢測到疑核(n. ambi guus)中的顯著病變，在病例2 (E1)中檢測到不太顯著的病變并在 兩個病例(FI，E2)中的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(formatio reticularis)的大細胞(magnocellular)核中 檢測到較低程度的病變。
[0073]圖7顯示通過質(zhì)譜法鑒定IgL0N5蛋白。利用大鼠海馬神經(jīng)元的兩個獨立免疫沉淀 實驗的蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果。上圖：該表含有匹配質(zhì)譜分析后的碎片譜的預(yù)測肽的序列(A中3 個，實驗1，和B中7個，實驗2)。也包括通過Sequest程序計算的肽鑒定的概率、XCorr評分和 DCn評分。下圖：鑒定的肽在完整的大鼠 IGL0N5蛋白內(nèi)以紅色顯示（Swiss Prot登錄號， IPI00367494)(A中14%的蛋白質(zhì)覆蓋以及B中29%的蛋白質(zhì)覆蓋）。
[0074]圖8顯示利用I gL0N5的免疫吸附法。被利用或不用I gL0N5轉(zhuǎn)染的HEK細胞吸附的 I gL0N5抗體-陽性血清。只有被用I gL0N5轉(zhuǎn)染的HEK細胞吸附的血清才不與大鼠腦的神經(jīng)氈 (B)和大鼠海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)物(D)反應(yīng)。當用非轉(zhuǎn)染的HEK細胞吸附血清時，IgL0N5反應(yīng)性 得以保留(A，C)。比例尺A和B = 1 OOOwn，C和D = □ 20wii。
[0075] 在整個本申請中，公開了許多序列，其被稱為：
[0076] SEQ ID NO 1:人IgL0N5
[0077] SEQ ID NO 2:嚙齒類動物/人IgL0N5片段，見圖7
[0078] SEQ ID NO 3:人IgL0N5片段
[0079] SEQ ID NO 4:嚙齒類動物/人IgL0N5片段，見圖7 [0080] SEQ ID NO 5:嚙齒類動物/人IgL0N5片段，見圖7 [0081 ] SEQ ID NO 6:嚙齒類動物/人IgL0N5片段，見圖7
[0082] SEQ ID N0 7:嚙齒類動物/人IgL0N5片段，見圖7
[0083] SEQ ID N0 8:嚙齒類動物/人IgL0N5片段，見圖7
[0084] SEQ ID N0 9:嚙齒類動物/人IgL0N5片段，見圖7
[0085] SEQ ID N0 10:嚙齒類動物/人IgL0N5片段，見圖7
[0086] SEQ ID NO 11:嚙齒類動物IgL0N5片段，見圖7
[0087] SEQ ID NO 12:人工IgL0N5構(gòu)建體，見圖7
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[0134] 患者和方法
[0135] 納入標準、患者和對照
[0136] 本研究8個患者中有3個（患者1-3,表1)來自Hospital Clinic,Barcelona,Spain 的多學(xué)科睡眠障礙單位中研究的患者組群。其余5個患者是在被送至我們實驗室的具有類 似免疫組織化學(xué)反應(yīng)性的樣品中鑒定的。將251個患者的血清或CSF用作對照，包括45個患 有病理學(xué)上確認為阿爾茨海默氏病的患者，28個臨床診斷為進行性核上麻痹的患者，21個 患有DNA-結(jié)合蛋白43(TDP-43)額顳癡呆的患者，18個患有多系統(tǒng)萎縮的患者，25個患有特 發(fā)性RBD的患者，28個患有下視丘分泌素缺乏發(fā)作性睡病的患者，54個患有多發(fā)性硬化癥的 患者和32個患有抗-Lgil腦炎的患者。在研究中使用的腦組織、血清和CSF樣品保藏在 Institut d'Investigacions Biomediques August Pi i Sunyer，Barcelona，Spain的神 經(jīng)組織庫和生物庫。
[0137] 多道睡眠圖（PSG)研究
[0138] 夜間視頻-多導(dǎo)睡眠圖包括眼電圖、腦電圖$3、？4工3、04、01和02，參考兩耳組合 電極(combined ears))、頦下EMG、右和左脛骨前肌、上肢中指淺屈肌以及下肢中趾短伸肌 的表面EMG。還記錄心電圖、鼻和口的氣流、胸部和腹部運動以及血氧飽和度。
[0139]我們對"無差別的NREM睡眠"時間段進行評分，其具有不規(guī)則的EEG0慢波，與清醒a 節(jié)律明顯不同，并且缺乏頂尖波、K復(fù)合波、睡眠紡錘波或S慢波，以及無明確的和再發(fā)生的 快速眼球運動，諸如在REM睡眠后期中常見的那些快速眼球運動。我們對"N2期"時間段進行 評分，其具有明確的K復(fù)合波或12-14Hz的紡錘波，即使與過度EMG活動和運動或偶爾的快速 眼球運動相關(guān)，所述偶爾的快速眼球運動具有比同一患者中的REM睡眠的典型的那些運動 的振幅低的振幅。當NREM睡眠的時間段內(nèi)持續(xù)數(shù)秒的事件(ep i sode)含有快速眼球運動、過 度EMG顫搐和典型RBD抽搐連同REM睡眠的EEG特征，則"NREM睡眠過程的封閉快速眼動期睡 眠行為障礙(RBD)"發(fā)生。發(fā)聲在每一個時間段中被評分為簡單和復(fù)雜，并且取決于它們的 視頻特征將身體/四肢運動評分為抽搐運動、簡單運動或終極(f inal i stic)運動(抽搐運動 為單個或數(shù)個肌群的突然收縮;終極運動為遵照明確地使人想起可辨認的白天活動-例如 吃、喝、操作物體等的模式的運動；以及簡單運動為比抽搐運動復(fù)雜但不如終極運動精細的 運動）。我們將快速周期性腿運動定義為以短于5秒的運動之間的間隔發(fā)生的那些周期性腿 運動。
[0140] 在Hospital Clinic of Barcelona的睡眠實驗室，在他們的整個臨床過程中的數(shù) 個晚上利用視頻-PSG記錄4個患者（患者1 -3和5 )，并且1個患者在Ulm，Germany的睡眠實驗 (患者7)?？偣灿涗浟?19個視頻-PSG。記錄頦下肌和上下肢中的EMG。按照2007年美國睡眠醫(yī) 學(xué)學(xué)會準則（Iber C.，Ancoli_Israel S.，Chesson A?和Quan S.F.(2007)，The AASM manual for the scoring of sleep and associated events:rules,terminology and technical specifications，第1片反?Westchester,IL:American Academy of Sleep Medicine)或當該標準準則不能被遵照時按照先前提出的修改(Santamaria J. , HGglB., Trenkwalder C.,Bliwise D.(2011),Scoring sleep in neurological patients:the need for specific considerations,Sleep 2011;34:1283-4)來對睡眠期和相關(guān)事件進 行評分。
[0141] 用于IgL0N5抗體的檢測和抗原的表征的方法
[0142] 無痛處死雌性Wistar大鼠，取出大腦，進行矢狀切片，將其于4°C在4%多聚甲醛中 浸沒1小時，利用40%蔗糖冷凍保護24小時，隨后在冷凍的異戊烷中快速冷凍。如所報道的 (Lancaster E.,Dalmau J.(2012),Neuronal autoantigens-pathogenesis,associated disorders and antibody testing,Nat.Rev.Neurol .2012;8:380-90)，使用患者的血清 (以1:200稀釋的）或CSF(1:5)，隨后使用適當?shù)牡诙贵w應(yīng)用使用標準抗生物素蛋白-生物 素過氧化物酶法的免疫組織化學(xué)。如所描述的(Cornelius J.R.，Pittock S.J.，McKeon A. 等（2011)，Sleep manifestations of voltage-gated potassium channel complex autoimmunity，Arch .Neurol ? 2011; 68:733-8)，為了研究抗體的IgG亞類的分布，使用相同 的免疫組織化學(xué)技術(shù)，將第二抗體改變成針對人IgG 1-4亞類(Sigma，St. Louis，M0)(稀釋 物：抗-IgGl 1:100,抗 IgG21:200,抗-IgG3 1:200 和抗-IgG4 1:200)或針對人 IgM (Southern Biotechnology Associates, Inc.，Birmingham，AL,USA)的生物素化的小鼠單 克隆抗體。
[0143] 為了顯示不同患者的抗-IgL0N5抗體是否識別相似的表位，用未稀釋的抗-IgL0N5-陽性血清預(yù)溫育大鼠腦切片3小時，隨后用10%正常人血清中的獲自另一陽性抗-IgL0N5血清的生物素化的IgG在4°C溫育過夜，隨后用Vectastain Elite ABC復(fù)合物 (乂6(^(^1^&8，1^4)溫育40分鐘。用0.05%二氨基聯(lián)苯胺和具有0.5%1^1切11乂-100的磷酸 緩沖鹽溶液(PBS)中的0.01%過氧化氫對反應(yīng)進行顯色。用來自正常人血清的生物素化的 IgG溫育切片作為對照。
[0144] 如所報道的（Iranzo A.，Graus F?，Clover L?等（2006)，Rapid eye movement sleep behavior disorder and potassium channel antibody-associated limbic encephalitis，Ann Neurol 2006;59:178-81)制備大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)物。用患者或?qū)φ?血清（最終稀釋度1:750)或CSF(1:30)在37°C處理生長在蓋玻片上的14天的活神經(jīng)元1小 時。在除去培養(yǎng)基和用PBS充分洗滌后，用4%PFA固定神經(jīng)元，隨后用1:1000稀釋的抗人IgG Alexa Fluor第二抗體（Molecular Probes,OR)進行溫育。使用Zeiss Axiovision軟件 (Zeiss，Thornwood,NY)在焚光顯微鏡下對結(jié)果進行照相（Montagna P.，Lugaresi E. (2002),Agrypnia Excitata:a generalized overactivity syndrome and a useful concept in the neurophysiopathology of sleep,ClinNeurophysio12002；113:552-60)〇
[0145] 利用在100mm孔中生長的海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)物進行免疫沉淀實驗，在37°C用患者 血清或?qū)φ昭澹ㄒ?:100稀釋的)溫育所述培養(yǎng)物1小時。隨后用PBS洗滌神經(jīng)元，用含有蛋 白酶抑制劑(P8340; Sigma Labs，St. Louis，M0，USA)的緩沖液進行裂解，并在4°C離心20分 鐘。保留上清液，用蛋白A/G瓊脂糖珠(20423;?1虹(^，1? 〇(31^(^(1，1〇在4°(：下溫育過夜，并離 心。將沉淀重懸浮于Laemmli緩沖液中，煮沸10分鐘，于10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝 膠電泳中進行分離，并利用EZBlue凝膠染色(G1041 ;Sigma Labs)顯現(xiàn)蛋白質(zhì)。因為EZBlue 凝膠染色不鑒定特定的蛋白質(zhì)條帶，因此將凝膠切成10片，并送至University of Pennsylvania的蛋白組學(xué)核心設(shè)施進行質(zhì)譜法。如所報道的（Irani S.R.，Pettingi 11 P.， Kleopa K.A?等（2012)，Morvan syndrome:clinical and serological observations in 29cases,Ann Neurol 2012;72:241-55)，對蛋白質(zhì)條帶進行胰蛋白酶消化，利用納米液相 層析(nano LC)/納米噴霧/線性離子講（LTQ)質(zhì)譜儀（Thermo Electron Corporation,San Jose，CA)進行分析。將 Xcalibur 軟件（Thermo Scientific，Waltham，MA)用于獲得原始數(shù) 據(jù)，將Sequest程序（ThermoFinnigan，San Jose，CA; SRF v ? 5版）用于使結(jié)果與UniProtKB/ Swiss-Prot蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫匹配。將Scaffold 3.3程序用于分析產(chǎn)生的文件。如果它們 可在大于95.0 %的概率上被確定并且含有至少3個鑒定的肽，則蛋白質(zhì)鑒定可被接受。
[0146] 如所描述的（Dalmau J?，Gleichman A. J?，Hughes E.G?等（2008)，Anti-MWDA-receptor encephalitis:case series and analysis of the effects of antibodies, Lancet Neurol .2008;7:1091-8)，為了進一步確認抗原的特異性，用含有IgL0Nl、2、3、4和5 (來自 Origene 的 GFP-標記的克?。篟G213594、RG226879、RG207618、RG216034、RG225495W9 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞。轉(zhuǎn)染后將細胞生長24小時，在37°C用患者的血清或?qū)φ昭?最終稀 釋度1:40)或CSF(1:2)溫育1小時，以及用4%多聚甲醛固定，并用0.2%Triton X-100 (Sigma, Saint Louis, M0)進行透化。使用1:1000稀釋的適當?shù)腁lexa-Fluor第二抗體 (Molecular Probes,OR)進行免疫標記（Dalmau J.，Gleichman A.J.,Hughes E.G?等 (2008),Anti-NMDA-receptor encephalitis:case series and analysis of the effects of antibodies,Lancet Neurol.2008;7:1091-8)。
[0147] 為了排除另外的神經(jīng)元抗體的可能性，用含有表達IgL0N5的活HEK293細胞或用無 插入物的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞的6個孔系列溫育1:200稀釋的血清。在每次一小時的連續(xù)通過 后，將血清用于大鼠腦的切片和活的海馬神經(jīng)元，并使用上述方法建立反應(yīng)性。
[0148] 神經(jīng)病理學(xué)研究
[0149] 按照Neurological Tissue Bank of the IDIBAPS Biobank的標準化方案在兩個 患者（患者2和5,表1)中進行神經(jīng)病理學(xué)檢查(Gelpi E.，Llad6A.，Clarim6n J?等（2012)， Phenotypic variability within the inclusion body spectrum of basophilic inclusion body disease and neuronal intermediate filament inclusion disease in frontotemporal lobar degenerations with FUS-positive inclusions, J Neuropathol Exp Neurol 2012;71:795-805)。如所描述的（Gelpi E.，Llad6A.,Clarim6n J?等（2012),Phenotypic variability within the inclusion body spectrum of basophilic inclusion body disease and neuronal intermediate filament inclusion disease in frontotemporal lobar degenerations with FUS-positive inclusions,】 Neuropathol Exp Neurol 2012;71:795_805)，使用一組的一抗（表1S)進行 免疫組織化學(xué)。為了評估IgL0N5在更受t病變影響的區(qū)域中的表達，用針對IgL0N5的商業(yè)抗 體(AbeamCambridge，UK)溫育來自尸檢病例之一和來自阿爾茨海默氏病患者的相似區(qū)域 的切片，并用抗生物素蛋白-生物素免疫過氧化物酶法顯現(xiàn)免疫反應(yīng)性。
[0150] 結(jié)果
[0151] 臨床發(fā)現(xiàn)
[0152] 8個患者(5個婦女;年齡范圍：52至76歲）具有特征在于異常睡眠運動和行為和具 有喘鳴的睡眠呼吸暫停的顯著睡眠障礙。5個患者（患者1-4和8,表1)最初被診斷為孤立的 阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征。然而，持續(xù)氣道正壓(CPAP)療法改善了喘鳴和阻塞性睡眠呼 吸暫停但未改善其他睡眠癥狀。在4個患者(患者1至4,表1)，睡眠障礙是在整個疾病過程中 呈現(xiàn)的最突出的主訴。除了睡眠障礙以外，兩個患者（患者5和6)還發(fā)生了伴隨平衡喪失和 步態(tài)失敗的嚴重步履艱難、構(gòu)音困難、吞咽困難、聲帶麻痹和中樞性通氣不足(其為6個月以 內(nèi)死亡的原因）。最后兩個患者（患者7和8)具有始于頻繁跌倒和步態(tài)不穩(wěn)，隨后構(gòu)音困難、 吞咽困難、四肢共濟失調(diào)和四肢及面部的舞蹈病樣運動的慢性進行性演化。另外，大多數(shù)患 者發(fā)展了輕度記憶和注意力不足和情感淡漠、情緒抑郁、靜坐不能或排尿紊亂。沒有一個患 者發(fā)生與進行性核上麻痹診斷相符的帕金森氏病或眼球運動體征。臨床特征和結(jié)果詳細描 述于表1中。
[0153] 腦MRI、常規(guī)腦電圖和CSF分析是不顯著的。在7個患者中完成的神經(jīng)傳導(dǎo)研究和 EMG排除了神經(jīng)性肌強直。在3個患者中獲得的CSF下視丘分泌素水平是正常的。在4個患者 中進行人白細胞抗原(HLA)分型，所有患者均顯示HLA-DQB1 *0501和HLA-DRB1 * 1001等位基 因。它們中的3個(患者1-3)也是HLA-B27陽性的。所有患者接受一些類型的免疫療法而無顯 著改善。6個患者死亡，并且全部為突然死亡或呈現(xiàn)嚴重中樞性通氣不足(表1)。
[0154] 多導(dǎo)睡眠圖研究
[0155] PSG研究的最顯著的特征概述于圖1和表2中。總的睡眠時間略微減少（睡眠效率 68-88% ;正常>85%)。在4個患者中，睡眠起始伴隨快速周期性腿運動（圖2A，視頻段1)。睡 眠的起始以及半夜覺醒后重新進入睡眠在所有5個患者中是異常的，要么為無差別的NREM 睡眠(在4個患者中），要么為結(jié)構(gòu)不良的N2睡眠(在一個患者中）。存在頻繁發(fā)聲、簡單的無 目的性運動或終極運動(具有與白天活動諸如吃、喝或操作物體相似的模式（圖2B，視頻段 2-5)。不存在正常N1睡眠，并且罕見具有K復(fù)合波和紡錘波的結(jié)構(gòu)良好的N2睡眠。在19個PSG 記錄中有16個被記錄了REM睡眠，并且總是呈現(xiàn)輕度至中等嚴重程度的RBD形式（圖2C)。在 所有患者中，記錄了具有頻繁的紡錘波而無發(fā)聲或運動的N3睡眠的典型的明確的S慢波周 期。最后，所有患者呈現(xiàn)在安靜的N3睡眠中惡化的具有喘鳴和中等嚴重程度的阻塞性呼吸 暫停(無 CPAP的呼吸暫停-呼吸不足(hypoapnea)指數(shù)，范圍為20至84次呼吸暫停-呼吸不足 (hypoapneas)/小時；正常<5)的睡眠呼吸障礙。
[0156] 存在這些睡眠異常在整個晚上的特征性分布(在19個PSG記錄中有14個存在）。具 有終極運動的無差別的NR E M和結(jié)構(gòu)不良的N 2的時期占優(yōu)勢并且在夜間睡眠開始后或在前 半夜中覺醒后具有更長的持續(xù)時間。正常N3睡眠和RBD在后半夜更頻繁并且持續(xù)更長時間 (圖 2D)。
[0157] 抗體表征
[0158] 8個患者的血清以及5個可得的CSF顯示相同模式的與大鼠腦的神經(jīng)氈的反應(yīng)性。 免疫反應(yīng)性在小腦的分子層和顆粒層的突觸終扣中更強（圖3)。所有血清和CSF標記培養(yǎng)物 中活神經(jīng)元的膜，這表明抗原被暴露在細胞表面上（圖3)。免疫沉淀測定顯示所有樣品阻斷 從患者1的血清獲得的生物素化I g G的反應(yīng)性，從而強烈地暗示8個患者的抗體與相同表位 反應(yīng)。
[0159] 最初的血清抗體滴度在1/5000至1/40000的范圍內(nèi)。在4個患者中，滴度在于免疫 療法后獲得的隨訪樣品中下降至不足1/2(表1)。相反地，在另一個患者的在他未被治療的 年份中的隨訪中未觀察到抗體滴度的變化。IgG亞類的分析顯示在所有患者中新型神經(jīng)氈-反應(yīng)抗體為IgG4(圖4); 一個患者具有另外的IgG2,4個具有非常輕度的IgGl反應(yīng)性。沒有患 者具有IgM抗體反應(yīng)性。
[0160] IgLON家族成員5被鑒定為靶向抗原
[0161]質(zhì)譜分析在兩個使用兩個患者的血清的獨立免疫沉淀實驗中揭示了 IgL0N5。在每 一個實驗中，我們包括正常人血清作為陰性對照。使用兩個患者的抗體分離7種含有29%的 IGL0N5蛋白質(zhì)序列的肽和3種含有14%的IGL0N5蛋白質(zhì)序列的肽（圖7)。為了進一步確認患 者的抗體對于I gL0N5的特異性，在基于細胞的測定(CBA)中使用利用編碼I gLON家族的5個 成員的每一個的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的J1EK293細胞。8個患者的血清和CSF僅與用GFP-標記的IgL0N5轉(zhuǎn) 染的細胞反應(yīng)（圖5)。血清不與用GFP-標記的IgL0Nl、2、3或4轉(zhuǎn)染的HEK細胞反應(yīng)，從而確認 抗體反應(yīng)性是特異于IgL0N5的并且不針對GFP標簽(未顯示）。使用IgL0N5CBA進行的251個 對照的血清或CSF的分析鑒定了在血清而非CSF中具有抗體的患者，所述患者在臨床上已被 診斷患有進行性核上麻痹。其余對照是陰性的。
[0162] 為了確定患者的血清是否含有可解釋一些病例的另外的癥狀(例如，共濟失調(diào)、通 氣不足）的另外的抗體，我們用表達IgL0N5的HEK293細胞或用無插入物的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞 免疫吸附3個具有不同臨床過程的患者（患者1、5、7)的血清。具有I gL0N5的吸附完全消除3 種血清與小鼠大腦和海馬神經(jīng)元的反應(yīng)性，這表明患者的抗體只針對IgL0N5 (圖8)。
[0163] 神經(jīng)病理學(xué)檢查
[0164] 兩個患者的尸檢顯示主要累及下丘腦、下丘腦前區(qū)和腦干的被蓋(包括背外側(cè)被 蓋區(qū)、導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)、腳橋核、大細胞核和疑核的區(qū)域）的神經(jīng)元t病變(表3,圖6) ^聚集 物是神經(jīng)元專一,性的，呈現(xiàn)預(yù)纏結(jié)(pretangles)、纏結(jié)和神經(jīng)毯線的形式，在患者5中存在 3-重復(fù)和4-重復(fù) T同種型，在患者2中4-重復(fù)t同種型占優(yōu)勢。神經(jīng)原纖維病變顯示對于磷酸 特異性_抗了抗體11^181、36"62、36"96、36422的強免疫原性（未顯示）。在星形膠質(zhì)細胞 (簇生的或刺狀星形膠質(zhì)細胞、灌木樣或特殊星形膠質(zhì)細胞或星形膠質(zhì)細胞斑)和少突膠質(zhì) 細胞(螺旋小體、球狀膠質(zhì)包涵體）中都不存在t-陽性顆粒和神經(jīng)膠質(zhì)t病變。未檢測到淀 粉樣蛋白、a-突觸核蛋白和TDP43的炎癥性浸潤或伴隨的異常蛋白質(zhì)沉積。IgL0N5免疫反應(yīng) 性在患者5的受影響的腦干區(qū)域中相較于用作對照的阿爾茨海默氏病患者的那些區(qū)域未得 到下降。
[0169] RBD: REM睡眠行為障礙
[0170] 表3.神經(jīng)缺失和t病變的地形分布
[0173] 評分:〇 =不存在(例如圖5D1，對于t免疫反應(yīng)性），+ =輕度(例如圖5Al)，++=中度 (例如圖D2)和+++ =嚴重(例如圖502 41)。0* = 200倍或400倍放大的分離的神經(jīng)氈線。
【主權(quán)項】
1. 包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序列的多肽用于疾病的診斷的用 途。2. -種包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序列的多肽或編碼所述多肽 的核酸，其用于疾病的治療。3. -種結(jié)合IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的自身抗體，其優(yōu)選用于疾病的診斷。4. 一種包含多肽的藥物組合物，所述多肽含有IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或 多個序列。5. -種用于診斷疾病的體外方法，其包括步驟： al)將來自受試者的包含抗體的液體樣品與包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個 或多個序列的多肽接觸， 或 a2)將來自受試者的包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的組織樣品與結(jié)合IgL0N5、 IgL0N5-片段或其變體的抗體接觸，優(yōu)選地，其中所述抗體是根據(jù)權(quán)利要求3的自身抗體， 以及，在步驟al)或a2)后， b) 檢測包含抗體和I gL0N5、I gL0N5-片段或其變體的復(fù)合物的形成， 和任選地進行所有先前的步驟之外或代替所有先前的步驟的以下步驟 c) 檢查所述受試者的人白細胞抗原(HLA)類型， 其中優(yōu)選使用免疫熒光顯微鏡術(shù)或波譜法、匪R波譜法、免疫擴散、質(zhì)譜法、放射性、化 學(xué)交聯(lián)、表面等離子體共振、非變性凝膠電泳、層析法和/或酶促活性來檢測所述復(fù)合物。6. -種用于診斷疾病、優(yōu)選自身免疫性疾病的體外方法，其包括在包含抗體的液體樣 品中檢測結(jié)合IgL0N5的自身抗體的步驟。7. -種醫(yī)療或診斷設(shè)備，其包含根據(jù)權(quán)利要求3的自身抗體或包含IgL0N5、IgL0N5-片 段或其變體的一個或多個序列的多肽。8. -種用于疾病的診斷的測試試劑盒，所述測試試劑盒包含根據(jù)權(quán)利要求3的抗體和/ 或包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序列的多肽。9. 權(quán)利要求7的醫(yī)療或診斷設(shè)備或權(quán)利要求8的測試試劑盒，其中以固定化的形式提供 包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序列的多肽。10. 權(quán)利要求8或9的任一項的測試試劑盒，其中所述測試試劑盒包含用于檢測包含抗 體和IgLON5、IgLON5-片段或其變體的復(fù)合物的手段，優(yōu)選地，其中所述抗體是根據(jù)權(quán)利要 求3的自身抗體。11. 權(quán)利要求1至10的任一項的用途、多肽、自身抗體、藥物組合物、方法、設(shè)備或測試試 劑盒， 其中所述疾病選自睡眠障礙、神經(jīng)退行性疾病和通氣不足，優(yōu)選神經(jīng)退行性疾病，更優(yōu) 選τ病變。12. 權(quán)利要求1至10的任一項的用途、多肽、自身抗體、藥物組合物、方法、設(shè)備或測試試 劑盒，其中所述疾病與選自深眠狀態(tài)、喘鳴、睡眠呼吸暫停、步態(tài)不穩(wěn)、構(gòu)音障礙、吞咽困難、 四肢共濟失調(diào)、聲帶麻痹、四肢及面部的舞蹈病樣運動、記憶和注意力不足、情感淡漠、情緒 抑郁、靜坐不能和排尿紊亂的一個或多個癥狀相關(guān)。13. -種用于分離結(jié)合I gLON5、I gLON5-片段或其變體的自身抗體的方法，其包括步驟： a) 將包含自身抗體的樣品與包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序列的 多肽接觸，所述多肽優(yōu)選是固定化的，使得形成復(fù)合物， b) 分離步驟a)中所形成的復(fù)合物 c) 解離步驟b)中所分離的復(fù)合物，以及 d) 將所述自身抗體與包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序列的多肽分 離。14. 一種用于治療受試者中與選自如下癥狀的一個或多個癥狀相關(guān)的疾病的方法:深 眠狀態(tài)、喘鳴、睡眠呼吸暫停、步態(tài)不穩(wěn)、構(gòu)音障礙、吞咽困難、四肢共濟失調(diào)、聲帶麻痹、四 肢及面部的舞蹈病樣運動、記憶和注意力不足、情感淡漠、情緒抑郁、靜坐不能和排尿紊亂， 所述方法包括步驟 a) 降低所述受試者的血液中結(jié)合IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的自身抗體的濃度 和/或 b) 施用一種或多種免疫抑制性藥物物質(zhì)， 所述藥物物質(zhì)優(yōu)選選自利妥昔單抗、潑尼松、甲潑尼龍、環(huán)磷酰胺、霉酚酸酯、靜脈注射 免疫球蛋白、他克莫司、環(huán)孢霉素、氨甲蝶呤、硫唑嘌呤和/或根據(jù)權(quán)利要求4的藥物組合物。15. 權(quán)利要求1至13的任一項的用途、多肽、自身抗體、藥物組合物、方法、設(shè)備或測試試 劑盒，其中IgL0N5的序列是根據(jù)SEQ ID NO 1的序列，并且IgL0N5-片段的序列是選自SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10的序列，并且其中優(yōu)選所述多肽包含SEQ ID NO 2至SEQ ID NO 10的所有序列。16. 權(quán)利要求1至15的任一項的用途、多肽、自身抗體、藥物組合物、方法、設(shè)備或測試試 劑盒，其中以包含編碼所述多肽的核酸的細胞的形式或以包含所述多肽的組織的形式提供 所述包含IgL0N5、IgL0N5-片段或其變體的一個或多個序列的多肽。
【文檔編號】G01N33/564GK105934673SQ201580002912
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2015年2月6日
【發(fā)明人】J·達爾摩, F·格勞斯
【申請人】奧古斯特·皮·松耶爾生物醫(yī)學(xué)研究所, 卡塔蘭研究和高級研究院, 巴塞羅納大學(xué), 巴塞羅納醫(yī)院門診部