一種基于CeO₂@Cu₂O/Au@Pt的夾心型免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬于納米功能材料、免疫分析以及生物傳感技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種基于CeO2@Cu2O/Au@Pt的夾心型免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用。采用CeO2@Cu2O/Au@Pt作為檢測抗體標記物制備的電化學(xué)免疫傳感器具有特異性強，靈敏度高和檢出限低等優(yōu)點，對肝癌腫瘤標志物的檢測具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價值。
【專利說明】
一種基于Ce02@CU20/AU@Pt的夾心型免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于納米功能材料、免疫分析以及生物傳感技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種基于Ce02@Cu20/Au@Pt的夾心型免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤的發(fā)病率高，生長和轉(zhuǎn)移速度快，對人類的健康有極大的危害。腫瘤標記物是腫瘤細胞產(chǎn)生和釋放的以抗原、酶、激素等形式的代謝產(chǎn)物存在于腫瘤細胞內(nèi)或宿主體液中，其在臨床上對于隨原發(fā)腫瘤的發(fā)現(xiàn)，腫瘤高危人群的篩選、良性和惡性腫瘤的鑒別診斷、腫瘤發(fā)展程度的判斷，腫瘤的治療效果的觀察和評價及腫瘤復(fù)發(fā)和預(yù)后的預(yù)測產(chǎn)生極大的影響，引起人們的廣泛關(guān)注。
[0003]CA15_3、CEA等常見的腫瘤標志物，對于肝癌的診斷都能起到一定的作用。對于腫瘤標記物的檢測方法很多，如放射免疫分析法、免疫放射分析法、酶標記免疫分析法、化學(xué)免疫發(fā)光分析法、時間分辨熒光免疫分析法等，但多數(shù)檢測方法繁瑣，操作復(fù)雜，費用昂貴，檢出限高，因此，建立一種快速、簡便、靈敏的檢測方法有重要意義。
[0004]夾心型電化學(xué)免疫傳感器結(jié)合了高特異性的免疫分析技術(shù)和高靈敏的電化學(xué)分析技術(shù)，具有靈敏度高、制備簡單、檢測快速、成本低、等優(yōu)點，在臨床檢驗、環(huán)境監(jiān)測、食品安全控制、生物監(jiān)測等領(lǐng)域都有重要的應(yīng)用價值。而構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器的關(guān)鍵有兩點:其一是采用簡單、快速、有效的方法將抗原抗體等生物分子固定在電極表面;其二是開發(fā)傳感器的信號放大技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種基于Ce02@Cu20/Au@Pt的夾心型免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用，實現(xiàn)了對肝癌腫瘤標志物的高靈敏檢測。
[0006]本發(fā)明的目的之一是提供一種基于Ce02@Cu20/Au@Pt的夾心型免疫傳感器的制備方法。
[0007]本發(fā)明的目的之二是將所制備的Ce02@Cu20/Au@Pt的夾心型免疫傳感器，用于檢測腫瘤標志物。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案，包括以下步驟。
[0009]1.一種基于Ce02@Cu20/Au@Pt的夾心型免疫傳感器的制備方法，其特征在于，步驟如下:
(1)將直徑為4mm的玻碳電極用Al2O3拋光粉打磨，超純水清洗干凈；
(2)以質(zhì)量濃度為1%的HAuCl4溶液為底液，在-0.2 V電壓下掃描30 s，將金電沉積到電極表面，用超純水沖洗，晾干；
(3)繼續(xù)將6汕、8?12ug/mL的腫瘤標志物捕獲抗體Ab1溶液孵化到電極表面，超純水沖洗，4 °C冰箱中晾干； (4)繼續(xù)將3uL、質(zhì)量分數(shù)為0.5?2.0%的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；
(5)滴加6yL、0.1 pg/mL?80 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標志物抗原Ag標準溶液到電極表面，超純水沖洗，4 V冰箱中干燥；
(6)將6tiL、l?3 mg/mL的Ce02@Cu20/Au@Pt-Ab2檢測抗體孵化物溶液孵化于電極表面上，置于4°C冰箱中晾干，制得一種基于Ce02@Cu20/Au@Pt的夾心型免疫傳感器。
[0010]2.所述Ce02@Cu20/Au@Pt-Ab2檢測抗體孵化物溶液的制備，步驟如下:
(1)CeO2OCu2O的制備
將8?12 mL、2.0 mol/L的NaOH溶液逐滴加入到100mL、0.01 mol/L的CuCl2溶液，充分攪拌0.5 h;繼續(xù)將8?12 mL、0.6 mol/L的抗壞血酸溶液逐滴加入到上述混合液中，550C下充分攪拌5h;離心分離，所得沉淀用超純水和無水乙醇依次洗滌三次;室溫下真空干燥12h，制得Cu2O立方納米晶體；
I?3 mL、0.855 mol/L的NaCl水溶液與80 mL、0.25 mg/mL Cu2O立方納米晶體乙醇溶液混合，超聲30 min;轉(zhuǎn)移到40°C油浴，逐滴加入18?22 mL、0.1 mmol/L的(NH4)2Ce(NO3)6乙醇溶液，反應(yīng)I?2 h;離心分離，用超純水和無水乙醇分別洗滌三次，室溫下真空干燥12 h，得到CeO2OCu2O;
(2)NH2-Ce02@Cu20的制備
0.03 -0.07 g的CeO2OCu2O加入至Ij 10 mL的無水甲苯中，加入0.2?0.4 mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，70°(:回流1.5?2.5 h，離心分離，超純水洗滌，80°C干燥12 h，得到NH2-
Ce〇2@Cu20;
(3)Au@Pt核殼納米粒子的制備
金納米粒子溶液是用10mU質(zhì)量分數(shù)為0.01%的HAuCl4溶液加熱至沸騰，加入2.51^、濃度為1011^/1^的檸檬酸鈉溶液，回流1.5 h，冷卻至室溫，得到酒紅色的金納米粒子溶液；
75 mL金納米粒子溶液與等體積超純水混合加熱到100°C，磁力攪拌下加入7.5 mL、質(zhì)量分數(shù)為1%的H2PtCl6，反應(yīng)20min，制成AuOPt核殼納米粒子；
(4)Ce02@Cu20/Au@Pt檢測抗體標記物溶液的制備
將4 ~ 8 mg的NH2_Ce02@Cu20加入到25 mLAuOPt核殼納米粒子溶液中，振蕩24 h，離心分離，得到Ce02@Cu20/Au@Pt，分散到2 mL的pH為7.4的磷酸緩沖溶液中，制得Ce02@Cu20/Au@Pt檢測抗體標記物溶液；
(5 )Ce02@Cu20/Au@Pt-Ab2檢測抗體孵化物溶液的制備
在2 mL、2?4 mg/mL的Ce02@Cu20/Au@Pt檢測抗體標記物溶液中，加入2 mL、8 ~ 12 μg/mL的腫瘤標志物檢測抗體Ab2溶液，4°C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩孵化12h;離心分離后，加入2 mL的pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液，得到Ce02@Cu20/Au@Pt-Ab2檢測抗體孵化物溶液，4 °C下保存?zhèn)溆谩?br>[0011 ]腫瘤標志物的檢測，檢測步驟如下:
(I)使用電化學(xué)工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，所制備的傳感器為工作電極，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.1?8.6磷酸鹽緩沖溶液中進行測試； (2)用計時電流法對腫瘤標志物進行檢測，輸入電壓為-0.4V，取樣間隔0.1 S，運行時間400 s；
(3)當(dāng)背景電流趨于穩(wěn)定后，每隔50s向10 mL、50 mmol/L的pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液中注入10 yL、5 mol/L的雙氧水溶液，記錄電流變化。
[0012]所述腫瘤標志物選自下列之一:CA15_3、CEA。
[0013]本發(fā)明所用原材料均可在化學(xué)試劑公司或生物制藥公司購買。
[0014]本發(fā)明的有益成果
(I)本發(fā)明使用了電沉積金作為基底材料，電沉積金具有大的比表面積，以及良好的導(dǎo)電能力，能夠很好的固載捕獲抗體，并能加速電子的傳遞，對于實現(xiàn)傳感器的高靈敏度以及低檢測限具有重要意義。
[0015](2)采用Ce02@Cu20/Au@Pt作為檢測抗體標記物，Ce02、Cu20、Au和Pt具有良好的導(dǎo)電能力以及對過氧化氫有催化作用，Ce02@CU20/AU@Pt實現(xiàn)了信號的多重協(xié)同放大，因此提高了傳感器的靈敏度，降低了檢測限；
(3)—種基于0602@(:1120/^11_^的夾心型免疫傳感器對0415-3的檢測，其線性范圍0.1pg/mL?80 ng/mL，檢測限最低0.03 pg/mL;對CEA進行檢測，其線性范圍為0.1 pg/mL?50呢/1]11^，檢測限為0.03 pg/mL。表明基于Ce02@Cu20/Au@Pt的夾心型免疫傳感器可以達到準確測定的目的。
【具體實施方式】
[0016]現(xiàn)將本發(fā)明通過【具體實施方式】進一步說明，但不限于此
實施例1 一種基于Ce02@Cu20/Au@Pt的夾心型免疫傳感器的制備方法，其特征在于，步驟如下:
(1)將直徑為4mm的玻碳電極用Al2O3拋光粉打磨，超純水清洗干凈；
(2)以質(zhì)量濃度為1%的HAuCl4溶液為底液，在-0.2 V電壓下掃描30 s，將金電沉積到電極表面，用超純水沖洗，晾干；
(3)繼續(xù)將6tiL、8 ug/mL的腫瘤標志物捕獲抗體Ab1溶液孵化到電極表面，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；
(4)繼續(xù)將3uL、質(zhì)量分數(shù)為0.5%的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；
(5)滴加6yL、0.1 pg/mL?80 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標志物抗原Ag標準溶液到電極表面，超純水沖洗，4 V冰箱中干燥；
(6)將6yL、I mg/mL的Ce02@Cu20/Au@Pt-Ab2檢測抗體孵化物溶液孵化于電極表面上，置于4°C冰箱中晾干，制得一種基于Ce02@Cu20/Au@Pt的夾心型免疫傳感器。
[0017]實施例2—種基于Ce02@Cu20/Au@Pt的夾心型免疫傳感器的制備方法，其特征在于，步驟如下:
(1)將直徑為4mm的玻碳電極用Al2O3拋光粉打磨，超純水清洗干凈；
(2)以質(zhì)量濃度為1%的HAuCl4溶液為底液，在-0.2 V電壓下掃描30 s，將金電沉積到電極表面，用超純水沖洗，晾干；
(3)繼續(xù)將6uL、10 ug/mL的腫瘤標志物捕獲抗體Ab1溶液孵化到電極表面，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；
(4)繼續(xù)將3uL、質(zhì)量分數(shù)為1.0%的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；
(5)滴加6yL、0.1 pg/mL?80 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標志物抗原Ag標準溶液到電極表面，超純水沖洗，4 V冰箱中干燥；
(6)將6uL、2 mg/mL的Ce02@Cu20/Au@Pt-Ab2檢測抗體孵化物溶液孵化于電極表面上，置于4°C冰箱中晾干，制得一種基于Ce02@Cu20/Au@Pt的夾心型免疫傳感器。
[0018]實施例3
一種基于Ce02@Cu20/Au@Pt的夾心型免疫傳感器的制備方法，其特征在于，步驟如下:
(1)將直徑為4mm的玻碳電極用Al2O3拋光粉打磨，超純水清洗干凈；
(2)以質(zhì)量濃度為1%的HAuCl4溶液為底液，在-0.2 V電壓下掃描30 s，將金電沉積到電極表面，用超純水沖洗，晾干；
(3)繼續(xù)將6uL、12 ug/mL的腫瘤標志物捕獲抗體Ab1溶液孵化到電極表面，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；
(4)繼續(xù)將3uL、質(zhì)量分數(shù)為2.0%的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；
(5)滴加6yL、0.1 pg/mL?80 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標志物抗原Ag標準溶液到電極表面，超純水沖洗，4 V冰箱中干燥；
(6)將6uL、3 mg/mL的Ce02@Cu20/Au@Pt-Ab2檢測抗體孵化物溶液孵化于電極表面上，置于4°C冰箱中晾干，制得一種基于Ce02@Cu20/Au@Pt的夾心型免疫傳感器。
[0019]實施例4所述Ce02@Cu20/Au@Pt-Ab2檢測抗體孵化物溶液的制備，步驟如下:
(1)CeO2OCu2O的制備
將8 mL ,2.0 mol/L的NaOH溶液逐滴加入到100 mL、0.01 mol/L的CuCl2溶液，充分攪拌0.5 h;繼續(xù)將8 mL、0.6 mol/L的抗壞血酸溶液逐滴加入到上述混合液中，55°C下充分攪拌5 h;離心分離，所得沉淀用超純水和無水乙醇依次洗滌三次;室溫下真空干燥12 h，制得Cu2O立方納米晶體；
ImL、0.855 mol/L的NaCl水溶液與80 mL、0.25 mg/mL C112O立方納米晶體乙醇溶液混合，超聲30 min;轉(zhuǎn)移到40°C油浴，逐滴加入18 mL、0.1 mmol/L的(NH4)2Ce(NO3)6乙醇溶液，反應(yīng)I h;離心分離，用超純水和無水乙醇分別洗滌三次，室溫下真空干燥12 h，得到
Ce〇2@Cu20;
(2)NH2-Ce02@Cu20的制備
0.03 g的Ce02@Cu20加入到10 mL的無水甲苯中，加入0.2 mL的3-氨丙基三乙氧基娃烷，70°C回流1.5 h，離心分離，超純水洗滌，800C干燥12 h，得到NH2-CeO2OCu2O ；
(3)Au@Pt核殼納米粒子的制備
金納米粒子溶液是用10mL、質(zhì)量分數(shù)為0.01%的HAuCl4溶液加熱至沸騰，加入2.5mL、濃度為10mg/mL的檸檬酸鈉溶液，回流1.5h，冷卻至室溫，得到酒紅色的金納米粒子溶液；
75 mL金納米粒子溶液與等體積超純水混合加熱到100°C，磁力攪拌下加入7.5 mL、質(zhì)量分數(shù)為1%的H2PtCl6，反應(yīng)20 min，制成AuOPt核殼納米粒子； (4)Ce02@Cu20/Au@Pt檢測抗體標記物溶液的制備
將4 mg的NH2_Ce02@Cu20加入到25 mLAuOPt核殼納米粒子溶液中，振蕩24 h，離心分離，得到Ce02@Cu20/Au@Pt，分散到2 mL的pH為7.4的磷酸緩沖溶液中，制得Ce02@Cu20/Au@Pt檢測抗體標記物溶液；
(5 )Ce02@Cu20/Au@Pt-Ab2檢測抗體孵化物溶液的制備
在2 mL、2 mg/mL的Ce02@Cu20/Au@Pt檢測抗體標記物溶液中，加入2 mL、8 yg/mL的腫瘤標志物檢測抗體Ab2溶液，4°C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩孵化12 h;離心分離后，加入2 mL的pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液，得到Ce02@Cu20/Au@Pt-Ab2檢測抗體孵化物溶液，4°C下保存?zhèn)溆谩?br>[0020]實施例5所述Ce02@Cu20/Au@Pt-Ab2檢測抗體孵化物溶液的制備，其特征在于，步驟如下:
(1)CeO2OCu2O的制備
將10 mL、2.0 mol/L的NaOH溶液逐滴加入到100 mL、0.01 mol/L的CuCl2溶液，充分攪拌0.5 h;繼續(xù)將10 mL、0.6 mol/L的抗壞血酸溶液逐滴加入到上述混合液中，55°C下充分攪拌5 h;離心分離，所得沉淀用超純水和無水乙醇依次洗滌三次;室溫下真空干燥12 h，制得Cu2O立方納米晶體；
2mL、0.855 mol/L的NaCl水溶液與80 mL、0.25mg/mL Cu2O立方納米晶體乙醇溶液混合，超聲30 min;轉(zhuǎn)移到40°C油浴，逐滴加入20 mL、0.1 mmol/L的(NH4)2Ce(NO3)6乙醇溶液，反應(yīng)1.5 h;離心分離，用超純水和無水乙醇分別洗滌三次，室溫下真空干燥12 h，得到
Ce〇2@Cu20;
(2)NH2-Ce02@Cu20的制備
0.05 g的CeO2OCu2O加入到1mL的無水甲苯中，加入0.3mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，70°C回流2 h，離心分離，超純水洗滌，80°C干燥12 h，得到NH2-CeO2OCu2O;
(3)Au@Pt核殼納米粒子的制備
金納米粒子溶液是用100 mL、質(zhì)量分數(shù)為0.01%的HAuCl4溶液加熱至沸騰，加入2.5!!^濃度為^^^/^的檸檬酸鈉溶液’回流丨^ h，冷卻至室溫，得到酒紅色的金納米粒子溶液；
75 mL金納米粒子溶液與等體積超純水混合加熱到100°C，磁力攪拌下加入7.5 mL、質(zhì)量分數(shù)為1%的H2PtCl6，反應(yīng)20 min，制成AuOPt核殼納米粒子；
(4)Ce02@Cu20/Au@Pt檢測抗體標記物溶液的制備
將6 mg的NH2_Ce02@Cu20加入到25 mLAuOPt核殼納米粒子溶液中，振蕩24 h，離心分離，得到Ce02@Cu20/Au@Pt，分散到2 mL的pH為7.4的磷酸緩沖溶液中，制得Ce02@Cu20/Au@Pt檢測抗體標記物溶液；
(5 )Ce02@Cu20/Au@Pt-Ab2檢測抗體孵化物溶液的制備
在2 mL、3 mg/mL的Ce02@Cu20/Au@Pt檢測抗體標記物溶液中，加入2 mL、10 yg/mL的腫瘤標志物檢測抗體Ab2溶液，4°C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩孵化12 h;離心分離后，加入2 mL的pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液，得到Ce02@Cu20/Au@Pt-Ab2檢測抗體孵化物溶液，4°C下保存?zhèn)溆?。[0021 ]實施例6所述Ce02@Cu20/Au@Pt-Ab2檢測抗體孵化物溶液的制備，其特征在于，步驟如下:
(I)CeO2OCu2O 的制備將12 mL、2.0 mol/L的NaOH溶液逐滴加入到100 mL、0.01 mol/L的CuCl2溶液，充分攪拌0.5 h;繼續(xù)將12 mL、0.6 mol/L的抗壞血酸溶液逐滴加入到上述混合液中，55°C下充分攪拌5 h;離心分離，所得沉淀用超純水和無水乙醇依次洗滌三次;室溫下真空干燥12 h，制得Cu2O立方納米晶體；
3 mL、0.855 mol/L的NaCl水溶液與80 mL、0.25 mg/mL C112O立方納米晶體乙醇溶液混合，超聲30 min;轉(zhuǎn)移到40°C油浴，逐滴加入22 mL、0.1 mmol/L的(NH4)2Ce(NO3)6乙醇溶液，反應(yīng)2 h;離心分離，用超純水和無水乙醇分別洗滌三次，室溫下真空干燥12 h，得到
Ce〇2@Cu20;
(2)NH2-Ce02@Cu20的制備
0.07 g的Ce02@Cu20加入到10 mL的無水甲苯中，加入0.4 mL的3-氨丙基三乙氧基娃烷，70 °C回流2.5 h，離心分離，超純水洗滌，80 0C干燥12 h，得到NH2-CeO2OCu2O ；
(3)Au@Pt核殼納米粒子的制備
金納米粒子溶液是用100 mL、質(zhì)量分數(shù)為0.01%的HAuCl4溶液加熱至沸騰，加入2.5mL、濃度為10 mg/mL的檸檬酸鈉溶液，回流1.5 h，冷卻至室溫，得到酒紅色的金納米粒子溶液；
75 mL金納米粒子溶液與等體積超純水混合加熱到100°C，磁力攪拌下加入7.5 mL、質(zhì)量分數(shù)為1%的H2PtCl6，反應(yīng)20min，制成AuOPt核殼納米粒子；
(4)Ce02@Cu20/Au@Pt檢測抗體標記物溶液的制備
將8 mg的NH2_Ce02@Cu20加入到25 mLAuOPt核殼納米粒子溶液中，振蕩24 h，離心分離，得到Ce02@Cu20/Au@Pt，分散到2 mL的pH為7.4的磷酸緩沖溶液中，制得Ce02@Cu20/Au@Pt檢測抗體標記物溶液；
(5 )Ce02@Cu20/Au@Pt-Ab2檢測抗體孵化物溶液的制備
在2 mL、4 mg/mL的Ce02@Cu20/Au@Pt檢測抗體標記物溶液中，加入2 mL、12 yg/mL的腫瘤標志物檢測抗體Ab2溶液，4°C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩孵化12 h;離心分離后，加入2 mL的pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液，得到Ce02@Cu20/Au@Pt-Ab2檢測抗體孵化物溶液，4°C下保存?zhèn)溆谩?br>[0022]實施例7腫瘤標志物CA15-3的檢測
(1)使用電化學(xué)工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，所制備的傳感器為工作電極，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.1?8.6磷酸鹽緩沖溶液中進行測試；
(2)用計時電流法對腫瘤標志物進行檢測，輸入電壓為-0.4V，取樣間隔0.1 S，運行時間400 s；
(3)當(dāng)背景電流趨于穩(wěn)定后，每隔50s向10 mL、50 mmol/L的pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液中注入10 yL、5 mol/L的雙氧水溶液，記錄電流變化；
(4)測定樣品中CA15-3的線性范圍為0.1pg/mL?80 ng/mL，檢測限為0.03 pg/mL。
[0023]實施例8腫瘤標志物CEA的檢測
按照實施例7的方法對樣品中CEA進行檢測，其線性范圍為0.1pg/mL?50ng/mL，檢測限為0.03 pg/mLο
【主權(quán)項】
1.一種基于Ce02@Cu20/Au@Pt的夾心型免疫傳感器的制備方法，其特征在于，步驟如下: (1)將直徑為4mm的玻碳電極用Al2O3拋光粉打磨，超純水清洗干凈； (2)以質(zhì)量濃度為1%的HAuCl4溶液為底液，在-0.2V電壓下掃描30s，將金電沉積到電極表面，用超純水沖洗，晾干； (3)繼續(xù)將6tiL、8?12 ug/mL的腫瘤標志物捕獲抗體Ab1溶液孵化到電極表面，超純水沖洗，4 °C冰箱中晾干； (4)繼續(xù)將3uL、質(zhì)量分數(shù)為0.5?2.0%的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干； (5)滴加6yL、0.1 pg/mL?80 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標志物抗原Ag標準溶液到電極表面，超純水沖洗，4 V冰箱中干燥； (6)將6仙、1?3mg/mL的Ce02@Cu20/Au@Pt-Ab2檢測抗體孵化物溶液孵化于電極表面上，置于4°C冰箱中晾干，制得一種基于Ce02@Cu20/Au@Pt的夾心型免疫傳感器。2.如權(quán)利要求1所述的一種基于Ce02@Cu20/Au@Pt的夾心型免疫傳感器的制備方法，所述Ce02@Cu20/Au@Pt-Ab2檢測抗體孵化物溶液的制備，其特征在于，步驟如下: (1)CeO2OCu2O的制備 將8?12 mL ,2.0 mol/L的NaOH溶液逐滴加入到100mL、0.01 mol/L的CuCl2溶液，充分攪拌0.5 h;繼續(xù)將8?12 mL、0.6 mol/L的抗壞血酸溶液逐滴加入到上述混合液中，55°C下充分攪拌5h;離心分離，所得沉淀用超純水和無水乙醇依次洗滌三次；室溫下真空干燥12h，制得Cu2O立方納米晶體； I?3 mL、0.855 mol/L的NaCl水溶液與80 mL、0.25 mg/mL Cu2O立方納米晶體乙醇溶液混合，超聲30min;轉(zhuǎn)移到40°C油浴，逐滴加入18?22 mL、0.1 mmol/L的(NH4)2Ce(NO3)6乙醇溶液，反應(yīng)I?2 h;離心分離，用超純水和無水乙醇分別洗滌三次，室溫下真空干燥12h，得到CeO2OCu2O; (2)NH2-Ce02@Cu20的制備 0.03 -0.07 g的CeO2OCu2O加入至IJlO mL的無水甲苯中，加入0.2?0.4 mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，70°(:回流1.5?2.5 h，離心分離，超純水洗滌，80°C干燥12h，得到NH2-CeO2OCu2O; (3)Au@Pt核殼納米粒子的制備 金納米粒子溶液是用10mU質(zhì)量分數(shù)為0.01%的HAuCU溶液加熱至沸騰，加入2.5mL、濃度為10 mg/mL的檸檬酸鈉溶液，回流1.5h，冷卻至室溫，得到酒紅色的金納米粒子溶液； 75 mL金納米粒子溶液與等體積超純水混合加熱到100°C，磁力攪拌下加入7.5 mL、質(zhì)量分數(shù)為1%的H2PtCl6，反應(yīng)20min，制成AuOPt核殼納米粒子； (4)Ce02@Cu20/Au@Pt檢測抗體標記物溶液的制備 將4 ~ 8 mg的NH2_Ce02@Cu20加入到25mLAu@Pt核殼納米粒子溶液中，振蕩24h，離心分離，得到Ce02@Cu20/Au@Pt，分散到2mL的pH為7.4的磷酸緩沖溶液中，制得Ce02@Cu20/Au@Pt檢測抗體標記物溶液； (5 )Ce02@Cu20/Au@Pt-Ab2檢測抗體孵化物溶液的制備 在2 mL、2?4 mg/mL的Ce02@Cu20/Au@Pt檢測抗體標記物溶液中，加入2 mL、8 ~ 12 μg/mL的腫瘤標志物檢測抗體Ab2溶液，4°C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩孵化12 h;離心分離后，加入2 mL的pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液，得到Ce02@Cu20/Au@Pt-Ab2檢測抗體孵化物溶液，4 °C下保存?zhèn)溆谩?.如權(quán)利要求1所述一種基于Ce02@Cu20/Au@Pt的夾心型免疫傳感器的制備方法制備的免疫傳感器，用于腫瘤標志物的檢測，檢測步驟如下: (1)使用電化學(xué)工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，所制備的傳感器為工作電極，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.1?8.6磷酸鹽緩沖溶液中進行測試； (2)用計時電流法對腫瘤標志物進行檢測，輸入電壓為-0.4V，取樣間隔0.1 S，運行時間400 s； (3)當(dāng)背景電流趨于穩(wěn)定后，每隔50s向10 mL、50 mmol/L的pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液中注入10 yL、5 mol/L的雙氧水溶液，記錄電流變化。4.如權(quán)利要求1、2、3所述的腫瘤標志物，其特征在于，所述腫瘤標志物選自CA15-3或CEA0
【文檔編號】G01N27/416GK105954339SQ201610259323
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年4月25日
【發(fā)明人】李月云, 董云會, 王平, 李法瀛, 劉會, 劉青, 陳磊
【申請人】山東理工大學(xué)