一種從禽和豬組織中提取哌嗪殘留并衍生化的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種禽和豬組織中哌嗪殘留的提取、凈化和衍生化的方法。該方法是以純乙腈為提取劑，正己烷為去脂劑，使用加速溶劑萃取儀(ASE)處理組織樣品，在線去脂與哌嗪提取連續(xù)進(jìn)行，所得提取液經(jīng)固相萃取法凈化、真空離心濃縮儀濃縮以及乙酸酐法柱前衍生。經(jīng)提取、凈化和衍生化的樣品通過(guò)氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(GC?MS/MS)進(jìn)行確證分析。本發(fā)明哌嗪的提取回收率均達(dá)到90％以上。
【專利說(shuō)明】
-種從禽和豬組織中提取脈瞎殘留并衍生化的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種禽和豬組織中贓嗦殘留的加速溶劑 萃取法提取、固相萃取法凈化和乙酸酢法柱前衍生化的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在對(duì)動(dòng)物源性食品中的獸藥進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，只有將藥物從樣本中提取出來(lái)，才可能 建立起高效的檢測(cè)方法。無(wú)水贓嗦為透明針狀或葉狀結(jié)晶，無(wú)臭，具有吸濕性和典型的氨臭 味，在空氣中吸收水分和二氧化碳，易溶于水和甘油，微溶于乙醇，不溶于乙酸。國(guó)內(nèi)外關(guān)于 贓嗦的提取方法有許多報(bào)道，提取劑一般為甲醇、乙臘、=氯乙酸溶液和高氯酸溶液等，且 提取方法W傳統(tǒng)常溫、常壓下液-液萃取為主。近年來(lái)，前處理方法的優(yōu)化W萃取溶劑及其 比例的優(yōu)化為主，尚未有加速溶劑萃取法(高溫、高壓條件下)應(yīng)用于禽和豬組織中贓嗦殘 留提取的相關(guān)報(bào)道。由于贓嗦分子結(jié)構(gòu)中具有兩個(gè)亞氨基，極性較強(qiáng)，在氣相色譜分離中峰 形較差，有嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象，故直接將贓嗦分子應(yīng)用于氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜確證分析的研究與 應(yīng)用尚未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了對(duì)禽和豬組織中贓嗦殘留的傳統(tǒng)提取方法進(jìn)行改進(jìn)，提高效率，提升自動(dòng)化 水平，并適應(yīng)氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)的需求，本試驗(yàn)建立了一種加速溶劑萃取法提取、 固相萃取法凈化和乙酸酢法衍生化的前處理方法體系，該方法簡(jiǎn)單、方便、快速，有機(jī)試劑 用量少，提取回收率高。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)方案是:該方法是W純乙臘為提取劑，正己燒為去脂劑，使用加速溶 劑萃取儀(ASE)處理組織樣品，在線去脂與贓嗦提取連續(xù)進(jìn)行，所得提取液經(jīng)固相萃取法凈 化、真空離屯、濃縮儀濃縮W及乙酸酢法柱前衍生。
[0005] -種從禽和豬組織中提取贓嗦殘留并衍生化的方法，包括加速溶劑萃取儀提取、 固相萃取凈化、柱前乙酸酢法衍生化的步驟。即使用加速溶劑萃取儀在80°C和ISOOpsi壓力 條件下分兩步操作，第一步正己燒去脂，第二步純乙臘萃取贓嗦;萃取液過(guò)S陽(yáng)固相萃取小 柱凈化，收集液經(jīng)真空離屯、濃縮后復(fù)溶并轉(zhuǎn)入玻璃小瓶進(jìn)行衍生化反應(yīng)(乙酸酢法）。
[0006] 加速溶劑萃取儀提取的步驟是:純乙臘作為提取溶劑，樣品依次與無(wú)水硫酸鋼、娃 藻±混勻裝填入萃取池，在80°C和ISOOpsi條件下，在線正己燒去脂與贓嗦萃取連續(xù)進(jìn)行， 自動(dòng)化提取。進(jìn)一步地:將均質(zhì)好的組織樣品，在研鉢中與3.Og無(wú)水硫酸鋼研磨混勻吸收樣 品水分，再加入3.0肖左右娃藻±研磨至粉狀混勻，裝填入221111^不誘鋼萃取池，在80°(：和 150化Si壓力條件下靜態(tài)萃取5min，氮?dú)獯祾?0s，每個(gè)萃取池萃取兩次，第一次使用正己 燒，去脂用，收集液棄掉，第二次萃取液收集于60mL收集瓶，轉(zhuǎn)移至50mL離屯、管，即得提取 液。
[0007] 固相萃取凈化步驟：提取液過(guò)Strata-X-C固相萃取小柱，依次用3mL甲醇、3mL 2.0 %甲酸水溶液將S陽(yáng)小柱活化平衡，上樣后待提取液勻速流干后，再依次用3mL 0.1mol/ L的鹽酸水溶液、3mL 0.1mol/L的鹽酸甲醇淋洗，待小柱干燥后，最終用2mL 5.0%氨水甲醇 分兩次進(jìn)行洗脫，收集洗脫液于2mL具塞離屯、管中。
[0008] 柱前乙酸酢法衍生化的步驟:將上述裝有凈化收集液的具塞離屯、管，置于離屯、濃 縮儀中，40°c真空負(fù)壓濃縮至干，后加入1.OmL二氯甲燒溶解殘?jiān)?，滿旋混勻后，轉(zhuǎn)移至IOmL 玻璃小瓶，并加入50化乙酸酢和10化LS乙胺，梓緊瓶蓋，于50°C溫度下衍生30min后取出， 冷卻至室溫，衍生后液體并洗涂液轉(zhuǎn)移至2血具塞離屯、管，滿旋振蕩使基質(zhì)混勻，12000 X g， 常溫離屯、IOmin，將上層清液過(guò)0.22皿濾膜，濾液供GC-MS/MS測(cè)定分析。
[0009] 與傳統(tǒng)萃取方式不同，本發(fā)明采用加速溶劑萃取技術(shù)，即在高溫、高壓條件下（80 °C，15(K)psi)完成去脂與目標(biāo)物(贓嗦）的提取過(guò)程。高溫條件增加了溶劑對(duì)樣品的溶解能 力，提高了樣品的擴(kuò)散速度，降低了溶劑的粘度，運(yùn)意味著溶劑滲透入基質(zhì)內(nèi)空隙更加容 易。另外，在高壓條件可W加快整體萃取速度，液體累入填充體內(nèi)更加容易，從而更充分接 觸其中的目標(biāo)萃取物?；赪上內(nèi)容，高溫和高壓的結(jié)合使得萃取更加快速和完全。
[0010] 有益效果:對(duì)比了液-液提取W及加速溶劑萃取儀(ASE350)不同提取方式，在純有 機(jī)試劑作為萃取試劑時(shí)的贓嗦的添加回收率，發(fā)現(xiàn)常溫、常壓下，回收率在20~60%左右， 而采用加速溶劑萃取儀在一定的溫度(80°C)和壓力（15(K)psi)條件下，W二氯甲燒為萃取 溶劑時(shí)，回收率在90% W上。表明萃取液極性較大時(shí)，回收率較高，且高溫高壓下，乙臘的萃 取效率高于二氯甲燒。不同的提取方法和提取試劑對(duì)禽（W雞組織為代表)和豬組織中贓嗦 提取回收率的影響（100.0化g/kg贓嗦添加量)見表1。
[0011] 表1不同提取方法巧提取試劑對(duì)脈嗦提取回收率的比較（％)
[0012]
[0013]
【具體實(shí)施方式】
[0014] 1.試驗(yàn)家禽和豬的飼養(yǎng)和樣品采集
[001引分別選取上市日齡立元雜交豬和家禽，即16周齡京海黃雞、10周齡揚(yáng)州碟、8周齡 樓桃谷鴨各12羽W及6月齡杜X長(zhǎng)X大=元雜交豬6頭，公、母各半，單籠(欄)飼養(yǎng)，飼喂不 含任何藥物的全價(jià)飼料，自由飲水。飼養(yǎng)2周后屠宰時(shí)分別取供試動(dòng)物的肌肉、肝臟、腎臟和 皮膚和脂肪組織作為空白組織樣品，-35°C保存，使用時(shí)將該樣品絞碎使之均質(zhì)。
[0016] 2.本發(fā)明提取、凈化與衍生化步驟
[0017]1)準(zhǔn)確稱取(2.0±0.02)旨均質(zhì)好的空白組織樣品，在研鉢中與3.0旨無(wú)水硫酸鋼研 磨混勻吸收樣品水分；
[0018] 2)再加入3. Og左右娃藻±研磨至粉狀混勻后，裝填入22mL不誘鋼萃取池；
[0019] 3)在80°C和ISOOpsi條件下，靜態(tài)萃取5min。每個(gè)萃取池萃取兩次(各5min)，第一 次使用正己燒，去脂用，收集液棄掉，第二次使用純乙臘，萃取用，萃取液收集于60mL收集 瓶，轉(zhuǎn)移至50mL離屯、管使用純乙臘；
[0020] 4)依次分別用3.OmL甲醇和3.OmL 2.0%甲酸水溶液將混合陽(yáng)離子固相萃取小柱 (Stra1:a-X-C)活化；
[0021] 5)向活化后的固相萃取小柱中加入提取液，勻速流干后，依次用3mL O.lmol/L的 鹽酸水溶液和3mL 0.1mol/L的鹽酸甲醇淋洗；
[0022] 6)待固相萃取小柱干燥后，用2mL 5.0%氨水甲醇分兩次進(jìn)行洗脫，將贓嗦洗脫至 2mL離屯、管中；
[0023] 7)將離屯、管置于離屯、濃縮儀中，40°C真空負(fù)壓濃縮至干；
[0024] 8)加入1 .OmL二氯甲燒溶解殘?jiān)?，滿旋混勻后，轉(zhuǎn)移至IOmL玻璃小瓶；
[00巧]9)加入50化乙酸酢和10化LS乙胺，梓緊瓶蓋，于5(TC溫度下衍生30min;
[00%] 10)衍生后液體并洗涂液轉(zhuǎn)移至2mL具塞離屯、管，滿旋振蕩使基質(zhì)混勻，12000 X g， 常溫離屯、IOmin，將上層清液過(guò)0.22皿濾膜，濾液供GC-MS/MS測(cè)定分析。
[0027] 3回收率和精密度的測(cè)定
[0028] 準(zhǔn)確稱取2.Og勻質(zhì)后的空白組織樣品于研鉢中，與無(wú)水硫酸鋼和研磨混勻后，依 次添加10.0 Omg/L濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液1、10、20、100、200和40化L (相當(dāng)于空白組織樣品中贓嗦 添加濃度為 5.00化09)、50.00、100.00、500.00、1000.00和2000.00蛇/1^)，并用二氯甲燒補(bǔ) 足液體至總體積相等，再次與娃藻±研磨混勻裝填入22mL萃取池，每個(gè)添加水平設(shè)置6個(gè)平 行，，經(jīng)提取、凈化和衍生化方法處理后，在W下描述的氣相色譜和質(zhì)譜分析條件(3.1)下， 進(jìn)行氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)分析。
[0029] 日內(nèi)精密度測(cè)定:在同日內(nèi)不同時(shí)間用同一條標(biāo)準(zhǔn)曲線及同一臺(tái)儀器6次重復(fù)測(cè) 定添加濃度分別為5.00 化09)、50.00、100.00、500.00、1000.00和2000.0 Oiig/kg的樣品，求 得日內(nèi)（批內(nèi)）精密度。
[0030] 日間精密度測(cè)定:在一周內(nèi)不同日W不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線及同一臺(tái)儀器6次重復(fù)測(cè)定 上述濃度的樣品，求得日間(批間)精密度。
[0031] 3.1GC-MS/MS 分析條件
[0032] 3.1.1氣相色譜條件
[0033] 色譜柱：色譜柱：TG-SMSAmine (30m X 0.25mm i.d. XO. 25WI1);載氣：高純氮?dú)猓ā?99.999%，60psi)，載氣柱流速：1. OmL/min;程序升溫參數(shù):80°C保持Imin，20°C/min升至 280°C，保持Imin。進(jìn)樣口溫度：280°C ;分流模式:不分流進(jìn)樣，分流流量:50.OmL/min; 2min 后開閥（載氣節(jié)省時(shí)間2min，載氣節(jié)省流量20mL/min);不分流時(shí)間：I .Omin;進(jìn)樣體積：I .Oy L。
[0034] 3.1.2質(zhì)譜條件
[0035] 電離模式：電子轟擊化I);電子束能量（電離能）：70eV;碰撞氣：高純氣氣（〉 99.999%，4化Si);離子源溫度:280°C ;傳輸線溫度:280°C ;溶劑延遲:4.Omin;采集數(shù)據(jù)方 式:全掃描（SCAN)和選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM)方式定性，選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(Auto SRM)方式定量。贓 嗦衍生產(chǎn)物的分子量和質(zhì)譜參數(shù)見表2。
[0036] 表2脈嗦的分子量和質(zhì)譜參數(shù)
[0037]
[003引注:*定量離子對(duì)
[0039] 將添加樣品所得定量子離子(m/z 170.1〉68.1)的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得濃 度，與實(shí)際添加的分析物的濃度相比求得添加回收率。
[0040] 在此條件下，本發(fā)明方法提取禽和豬組織中贓嗦的添加回收率及精密度見表4-7。 [0041 ] 表4雞組織中贓嗦的添加回收率及精密度(n = 6)
[0042]
[0043]
[0044]
[0045]
[0046]
[0047]
[004引
[0049] [(K)加 ]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種從禽和豬組織中提取哌嗪殘留并衍生化的方法，其特征在于，包括（1)加速溶劑 萃取儀提取、（2)固相萃取凈化、（3)柱前乙酸酐法衍生化的步驟。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，是以純乙腈為提取劑，正己烷為去脂劑，使 用加速溶劑萃取儀處理組織樣品，在線去脂與哌嗪提取連續(xù)進(jìn)行，所得提取液經(jīng)固相萃取 法凈化、真空離心濃縮儀濃縮以及乙酸酐法柱前衍生。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)加速溶劑萃取儀提取是:使用 加速溶劑萃取儀在80 °C和1500psi壓力條件下分兩步操作，第一步正己烷去脂，第二步純乙 腈萃取哌嗪。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于;步驟（1)中純乙腈作為提取溶劑，樣品依次 與無(wú)水硫酸鈉、硅藻土混勻裝填入萃取池，在80°C和1500psi條件下，在線正己烷去脂與哌 嗪萃取連續(xù)進(jìn)行，自動(dòng)化提取。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)固相萃取凈化具體是:經(jīng)步驟 (1)所得的萃取液過(guò)Strata-X-C固相萃取小柱，先依次用3mL甲醇、3mL 2.0 %甲酸水溶液將 SPE小柱活化平衡，上樣后待提取液勻速流干后，再依次用3mL 0.1 mo 1/L的鹽酸水溶液、3mL 0. lmol/L的鹽酸甲醇淋洗，最終待小柱干燥后，用2mL 5.0%氨水甲醇分兩次進(jìn)行洗脫。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK105954376SQ201610249079
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年4月20日
【發(fā)明人】謝愷舟, 劉亞楠, 龐茂達(dá), 謝星, 崔璐璐, 王波, 高強(qiáng), 張楊楊, 張跟喜, 戴國(guó)俊, 卜仕金, 王冉, 王金玉
【申請(qǐng)人】揚(yáng)州大學(xué)