鵝卵泡顆粒細(xì)胞多胺含量的hplc檢測(cè)方法及其應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種鵝卵泡顆粒細(xì)胞多胺含量的HPLC檢測(cè)方法及其應(yīng)用。發(fā)明方法包括：①細(xì)胞多胺固相萃取方法：用5%的HClO4收集細(xì)胞，加入1,6?己二胺勻漿提取上清，加入苯甲酰氯衍生，將衍生液置于C18固相萃取柱中，用超純水和甲醇過(guò)柱去除雜質(zhì)，然后再用甲醇洗脫并收集經(jīng)苯甲酰氯衍生的多胺。②細(xì)胞多胺高效液相色譜檢測(cè)方法：色譜分離柱為5 μm，4.6×250 mm的C18色譜柱，流動(dòng)相甲醇:超純水體積比為66:34，流速為0.9 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為229 nm，柱溫為25℃。本方案可有效分離鵝卵泡顆粒細(xì)胞中腐胺、亞精胺和精胺，能快速、準(zhǔn)確檢測(cè)鵝卵泡顆粒細(xì)胞中多胺含量，并具有操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)時(shí)間短，成本低，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好的特點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
鶴卵泡顆粒細(xì)胞多胺含量的HPLC檢測(cè)方法及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域，設(shè)及一種應(yīng)用高效液相色譜（high performance liquid chromatogra地y, HPLC)檢測(cè)碟卵泡顆粒細(xì)胞多胺含量的方法及其 應(yīng)用，具有操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)時(shí)間短，成本低，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好的特點(diǎn)。
【背景技術(shù)】
[0002] 多胺(包括腐胺、亞精胺和精胺)是一類(lèi)帶有兩個(gè)或兩個(gè)W上氨基的低分子脂肪族 化合物。多胺可參與調(diào)控基因表達(dá)和翻譯、細(xì)胞增殖、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞膜穩(wěn)定等生命活 動(dòng)過(guò)程，并且能夠調(diào)節(jié)某些陽(yáng)離子通道的活性。研究表明，細(xì)胞內(nèi)多胺濃度降低時(shí)，細(xì)胞生 長(zhǎng)緩慢甚至停止;而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)多胺過(guò)量時(shí)，可導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增殖。大量研究已證實(shí)，癌細(xì)胞 中多胺含量遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞。因此，探尋一種快速、準(zhǔn)確檢測(cè)細(xì)胞中多胺含量的方法，對(duì)于 闡明多胺在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中所發(fā)揮的生物學(xué)功能及其調(diào)控機(jī)理具有重要的理論意義和實(shí) 際意義。
[0003] 近年來(lái)，隨著碟產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，碟產(chǎn)蛋性能低(年產(chǎn)蛋量50~90枚)已成為制約碟 產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的重要因素，是碟產(chǎn)業(yè)亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題之一。碟產(chǎn)蛋性能主要取決于卵巢 卵泡生長(zhǎng)和發(fā)育水平。碟卵泡發(fā)育是一個(gè)連續(xù)的過(guò)程，性成熟碟卵巢中含有數(shù)W千計(jì)的原 始卵泡。但是，絕大多數(shù)原始卵泡都會(huì)發(fā)生退化或閉鎖，只有少數(shù)卵泡才能進(jìn)一步發(fā)育成為 等級(jí)卵泡，并最終W碟蛋的形式排出。
[0004] 卵泡發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，是卵泡膜細(xì)胞一一顆粒細(xì)胞一一卵母細(xì)胞之間 交互作用的結(jié)果。研究表明，多胺是卵泡膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞復(fù)制、分化的必要物質(zhì)。在原始 卵泡生長(zhǎng)啟動(dòng)過(guò)程中，顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)啟動(dòng)優(yōu)先于卵母細(xì)胞;顆粒細(xì)胞為卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā) 育提供營(yíng)養(yǎng)，并促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟。顆粒細(xì)胞調(diào)亡是導(dǎo)致卵泡閉鎖的重要直接原因，如果發(fā) 育卵泡中10%W上的顆粒細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡則表明該卵泡正在或已經(jīng)閉鎖。研究表明，小鼠體內(nèi) 多胺含量減少時(shí)，小鼠卵泡發(fā)育停滯甚至出現(xiàn)卵泡閉鎖；多胺能夠調(diào)控非洲爪贍卵母細(xì)胞 的形成，并調(diào)控生殖類(lèi)激素合成酶的表達(dá)。適宜濃度的多胺可W促進(jìn)小鼠卵泡發(fā)育，而多胺 過(guò)量將抑制卵泡的發(fā)育，提示多胺可參與調(diào)控小鼠卵泡發(fā)育。因此，卵泡顆粒細(xì)胞的形態(tài)和 功能的變化及其多胺含量在卵泡發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。卵泡顆粒細(xì)胞中多胺濃度對(duì)卵 泡的發(fā)育有重要作用，而產(chǎn)蛋期碟卵巢卵泡的正常連續(xù)發(fā)育是保證繁殖性能的重要因素。 因此，為闡明多胺調(diào)控碟卵巢的功能及其調(diào)控機(jī)理，探尋快速、準(zhǔn)確檢測(cè)碟顆粒細(xì)胞中多胺 含量的方法是亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題，對(duì)碟繁殖相關(guān)研究具有重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。
[0005] 目前多胺檢測(cè)方法主要有高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)和高效液相色譜 法(HPLC)。應(yīng)用運(yùn)些方法可有效檢測(cè)動(dòng)物和植物組織中多胺含量，然而目前尚未見(jiàn)有關(guān)碟 卵泡顆粒細(xì)胞中多胺含量檢測(cè)方法的報(bào)道。另外，HPLC-MS方法需要將HPLC與質(zhì)譜儀聯(lián)合使 用，從而大幅增加了多胺檢測(cè)成本。應(yīng)用現(xiàn)有HPLC方法檢測(cè)組織多胺含量時(shí)，存在諸多不足 之處。如①苯甲酯氯使用量達(dá)到10 yL，其分解產(chǎn)物殘留多，雜峰較多，雜質(zhì)與腐胺的出峰時(shí) 間接近，干擾腐胺的峰型;②采用氯仿萃取，純化程度不足，導(dǎo)致出現(xiàn)大量雙肩峰、干擾峰； ③檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，約為20 min;④檢測(cè)峰型連續(xù)，分離度差，峰與峰之間有效分離間隔較小， 無(wú)法準(zhǔn)確分峰;⑤標(biāo)準(zhǔn)品與樣品出峰時(shí)間變異大，從而干擾腐胺、亞精胺和精胺的分離鑒 定;議現(xiàn)有一些檢測(cè)方法還需要聯(lián)合質(zhì)譜儀，使得檢測(cè)成本大幅提高。綜上所述，現(xiàn)有多胺 檢測(cè)方法只能檢測(cè)組織中多胺含量，而無(wú)法有效檢測(cè)細(xì)胞中多胺含量;而且現(xiàn)有多胺檢測(cè) 方法均存在一定不足，主要表現(xiàn)為需要價(jià)格昂貴的質(zhì)譜儀，多胺檢測(cè)成本高、不適合普遍應(yīng) 用;樣品需要量大;預(yù)處理和純化樣品不充分，干擾雜質(zhì)較多;使用苯和正己燒等有機(jī)試劑， 殘留物出峰干擾;檢測(cè)條件不夠優(yōu)化，分離度不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決現(xiàn)有細(xì)胞多胺檢測(cè)方法匿乏W及上述組織多胺檢測(cè)技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā) 明公開(kāi)了碟卵泡顆粒細(xì)胞中多胺的固相萃取方法及高效液相色譜檢測(cè)方法。該方法具有操 作簡(jiǎn)便，檢測(cè)時(shí)間短，成本低，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好的特點(diǎn)。
[0007] 本發(fā)明的目的之一在于利用固相萃取法從碟卵泡顆粒細(xì)胞中萃取分離腐胺、亞精 胺和精胺。該方法操作簡(jiǎn)單，設(shè)備要求簡(jiǎn)單，干擾成分少，具有較高的重復(fù)性、準(zhǔn)確性。
[000引為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為。
[0009] 用5 %的HC104抽提碟卵泡顆粒細(xì)胞中多胺，堿性條件下與苯甲酯氯發(fā)生衍生反 應(yīng)，使多胺生成強(qiáng)紫外吸收的苯甲酸脂類(lèi)多胺衍生物，經(jīng)過(guò)C18固相萃取柱將衍生液中的苯 甲酸脂類(lèi)多胺衍生物萃取、濃縮、洗去雜質(zhì)、色譜級(jí)甲醇洗脫等步驟，將碟卵泡顆粒細(xì)胞中 的多胺轉(zhuǎn)化為可W應(yīng)用高效液相色譜紫外檢測(cè)器檢測(cè)到的液態(tài)物質(zhì)。
[0010] 本發(fā)明的目的之二在于提供一種高效液相色譜法檢測(cè)碟卵泡顆粒細(xì)胞中多胺色 譜條件，該方法能有效分離腐胺、亞精胺和精胺，多胺保留時(shí)間短，檢測(cè)周期短，可重復(fù)性 強(qiáng)，精密度高。
[0011] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為。
[001リ采用的色譜條件為：（l)色譜柱SWE化Chromstar?cl8巧皿，4.6X250 mm);(2)流 動(dòng)相比例為：甲醇:超純水=66:34(V/V);(3)流速為:0.9 mL/min;(4)紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng) 為229 nm;巧)進(jìn)樣體積為20化；（6)柱溫為25°C。
[0013] 相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為:①苯甲酯氯使用量?jī)H為4 iiL，在確保有效 分離腐胺的前提條件下，緩解了苯甲酯氯殘留所致雜峰多的問(wèn)題;②采用固相萃取技術(shù)提 高了純化程度，降低了雙肩峰和干擾峰的數(shù)量;③檢測(cè)時(shí)間縮短為14 min;④加大了峰與峰 之間的有效分離間隔，提高了色譜峰型的分離度和準(zhǔn)確性;⑤標(biāo)準(zhǔn)品與樣品出峰時(shí)間相對(duì) 穩(wěn)定，便于腐胺、亞精胺和精胺的分離鑒定；窗無(wú)需聯(lián)合質(zhì)譜儀，大幅降低了檢測(cè)成本。因 此，本發(fā)明可準(zhǔn)確分離細(xì)胞中腐胺、亞精胺和精胺，改善和優(yōu)化了現(xiàn)有多胺檢測(cè)技術(shù)的不足 之處，填補(bǔ)了細(xì)胞多胺檢測(cè)方法領(lǐng)域的空白，為多胺功能的深入研究提供技術(shù)保障。本發(fā)明 在檢測(cè)時(shí)間、分離度、抗干擾能力上具有明顯的創(chuàng)新性和先進(jìn)性。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1腐胺標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜峰圖。由圖可W看出腐胺和內(nèi)標(biāo)1,6-己二胺分峰良 好，腐胺在6.181 min,內(nèi)標(biāo)1,6-己二胺在7.893 min。
[001引圖2亞精胺標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜峰圖。由圖可W看出內(nèi)標(biāo)1,6-己二胺和亞精胺分 峰良好，I，6-己二胺在7.891 min,亞精胺在8.678 min。
[0016] 圖3精胺標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜峰圖。由圖可W看出內(nèi)標(biāo)1,6-己二胺和精胺分峰良 好，1,6-己二胺在7.891 min,精胺在 12.387 min。
[0017] 圖4正常碟卵泡顆粒細(xì)胞的色譜峰圖。腐胺，內(nèi)標(biāo)1,6-己二胺，亞精胺和精胺分峰 良好，且各物質(zhì)的出峰時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間一致。
[0018] 圖5干擾表達(dá)0^。的碟卵泡顆粒細(xì)胞中多胺含量檢測(cè)的色譜峰圖。腐胺，內(nèi)標(biāo)1， 6-己二胺，亞精胺和精胺分峰良好，且各物質(zhì)的出峰時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間一致。
[0019] 圖6過(guò)表達(dá)0^。的碟卵泡顆粒細(xì)胞中多胺含量檢測(cè)的色譜峰圖。腐胺，內(nèi)標(biāo)1,6- 己二胺，亞精胺和精胺分峰良好，且各物質(zhì)的出峰時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間一致。
【具體實(shí)施方式】
[0020] W下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明的 范圍僅限于下述實(shí)施例。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件 所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0021] 若未特別指明，實(shí)施例中所用的生化試劑均為市售試劑，實(shí)施例中所用的技術(shù)手 段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0022] 儀器與試劑。
[0023] 安捷倫(美國(guó)加州）高效液相色譜儀;紫外檢測(cè)器;色譜柱SWE化化romstar? C18 巧皿，4.6 X 250 mm);萬(wàn)分之一電子天平;KQ-300DA型數(shù)控超聲波清洗器;Thermo離屯、機(jī)； 水浴鍋;Thermo Hypers巧C18固相萃取柱;超純水儀。色譜甲醇;色譜腐胺;色譜亞精胺;色 譜精胺;色譜1，6-己二胺;超純水;NaOH;肥1;分析純苯甲酯氯;肥1〇4。
[0024] 多胺標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。
[0025] 分別稱取88.15 111旨，145.25 111旨，202.34 111旨的腐胺(相對(duì)分子質(zhì)量88.15)，亞精胺 (相對(duì)分子質(zhì)量145.25)和精胺(相對(duì)分子質(zhì)量202.34)即腐胺、亞精胺和精胺1.0 mmol,用5 %的肥1〇4分別定容至3個(gè)100 mL容量瓶中，配置的巧巾標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液為10皿〇1/血。
[0026] 用梯度稀釋的方法，分別配置50、100、250、500、1000和2000皿〇1/1111的巧巾標(biāo)準(zhǔn)溶 液。用5 %的肥1〇4定容至10 mL。
[0027] 取25 mg的內(nèi)標(biāo)（1，6己二胺），用5 %的HCl化定容至25 mL容量瓶中，配置成1 mg/ mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)存液;取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)存液5 mL用5 %的HC104定容至10 mL，配置成500 iig/mL內(nèi)標(biāo)工 作液。
[002引將巧巾梯度稀釋好的50、100、250、500、1000和2000皿01/1111^標(biāo)準(zhǔn)品各取100化，分 別加到10血棟色試管中，再分別加入10化的500 yg/mL的內(nèi)標(biāo)，2血的5 %肥1化，2 ml的 2.5 mol/L NaOH，4化苯甲酯氯。
[0029] 將試管中的液體縱滿震蕩混勻后，置于40°C水浴鍋中水浴1 h，使多胺衍生。
[0030] 用6 mol/L的肥1調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)品衍生溶液抑值到7.0。
[0031] 將標(biāo)準(zhǔn)品衍生液轉(zhuǎn)移至C18固相萃取柱(先用3 mL甲醇和和3 mL超純水活化），過(guò) 濾衍生液，萃取多胺。
[0032] 過(guò)濾完后用15 mL的超純水和15 mL的15 %的甲醇洗去雜質(zhì)。
[0033] 將殘留的甲醇和水吹干，再用0.5 mL的色譜甲醇將樣品洗脫，4°C保存待檢測(cè)。
[0034] 用0.22皿針頭過(guò)濾器過(guò)濾待檢測(cè)洗脫液，取20化進(jìn)樣檢測(cè)，其色譜條件如下:檢 測(cè)時(shí)間14 min;流動(dòng)相比例為甲醇:超純水=66:34(V/V);流速為0.9血/min;紫外檢測(cè)器檢 測(cè)波長(zhǎng)為229 nm;柱溫為25°C。圖1、圖2和圖3分別為腐胺、亞精胺和精胺標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜 峰圖。
[0035] 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法。
[0036] W標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為橫坐標(biāo)，W對(duì)應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品峰面積與1,6-己二胺的峰面積 (即內(nèi)標(biāo)面積)的比值為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法（1/c2)進(jìn)行回歸，得到腐胺、亞精胺和精 胺的回歸方程。結(jié)果表明：腐胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=〇.〇121x-〇. 0192,相關(guān)系數(shù)R2= 0.9979;亞精胺為 y=0.0 l 16X-0.0201，r2=0.9977;精胺為 y=0.0059X+0.0673，r2=0.9993。3種 多胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值均大于0.99,表明運(yùn)巧中多胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好。
[0037] 碟卵泡顆粒細(xì)胞中多胺的高效液相色譜檢測(cè)。
[0038] 用1 mL的5 %的肥1〇4收集約IO6個(gè)碟卵泡顆粒細(xì)胞。
[0039] 向細(xì)胞中加入10化的500 iig/mL內(nèi)標(biāo)工作液，縱滿震蕩混勻后用超聲波細(xì)胞破碎 儀破碎10 min, 12,000 g離屯、10 min,轉(zhuǎn)移上清液至10 mL棟色試管中。
[0040] 向離屯、沉淀中加入1 ml 5 %的HCl化，縱滿震蕩混勻后用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎 10 min, 12,000 g離屯、10 min,轉(zhuǎn)移上清液至同一棟色試管中，混合均勻后加入等體積的 2.5 mol/L NaOH和4化的苯甲酯氯，縱滿震蕩混勻。
[0041 ] 將試管置于40°C的水浴鍋中衍生1 h后，用6 mol/L的肥1調(diào)節(jié)抑值到7.0。
[0042] 將衍生液轉(zhuǎn)移至C18固相萃取柱(先用3 mL甲醇和和3 mL超純水活化），過(guò)濾衍生 液萃取多胺，過(guò)濾完后用15 mL的超純水和15 mL的15 %的甲醇洗去雜質(zhì)。
[0043] 吹干殘余的甲醇和水，再用0.5 mL的色譜甲醇洗脫，將洗脫液4°C避光保存。
[0044] 用0.22皿針頭過(guò)濾器過(guò)濾待檢測(cè)洗脫液，取20化進(jìn)樣檢測(cè)，其色譜條件如下:檢 測(cè)時(shí)間14 min;流動(dòng)相比例為甲醇:超純水=66:34(V/V);流速為0.9血/min;紫外檢測(cè)器檢 測(cè)波長(zhǎng)為229 nm;柱溫為25 °C。
[0045] 碟卵泡顆粒細(xì)胞中多胺的計(jì)算方法。
[0046] 采用內(nèi)標(biāo)分析法根據(jù)所測(cè)組織樣中的腐胺、亞精胺和精胺的峰面積與1，6-己二胺 的峰面積的比值，利用腐胺、亞精胺和精胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別求出巧巾多胺的含量。
[0047] 實(shí)施例1四川白碟卵泡顆粒細(xì)胞中多胺的固相萃取及其高效液相色譜法檢測(cè)。 [004引用1 mL的5 %的肥104收集約IO6個(gè)碟卵泡顆粒細(xì)胞。
[0049] 向細(xì)胞中加入10化的500 iig/mL的內(nèi)標(biāo)工作液，縱滿震蕩混勻后用超聲波細(xì)胞破 碎儀破碎10 min, 12,000 g離屯、10 min,轉(zhuǎn)移上清液至10 mL棟色試管中。
[0050] 向離屯、沉淀中加入1 ml 5 %的HCl化，縱滿震蕩混勻、破碎細(xì)胞、離屯、，轉(zhuǎn)移上清液 至同一棟色試管中并混勻，加入等體積的2.5 mol/L化OH和4化的苯甲酯氯，縱滿震蕩混 勻。
[0051 ] 置于40°C水浴鍋中衍生1 h后，用6 mol/L的肥1調(diào)節(jié)抑值到7.0。
[0化2] 將衍生液轉(zhuǎn)移至C18固相萃取柱(先用3 mL甲醇和和3 mL超純水活化)過(guò)濾萃取， 用15 mL的超純水和15 mL的15 %的甲醇洗去雜質(zhì)。
[0053] 過(guò)濾完后吹干殘余的甲醇和水，再用0.5 mL的色譜甲醇將樣品洗脫。
[0054] 用0.22皿針頭過(guò)濾器過(guò)濾洗脫液，取20化進(jìn)樣檢測(cè)。其色譜條件如下:流動(dòng)相比 例為甲醇:超純水=66:34( V/V);流速為0.9血/min;紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為229皿;柱溫為 25°C。顆粒細(xì)胞中多胺檢測(cè)結(jié)果表明，腐胺、亞精胺、精胺和內(nèi)標(biāo)分峰良好，且各物質(zhì)的出峰 時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間一致(圖4 )。
[0055] 采用內(nèi)標(biāo)分析法，根據(jù)所測(cè)碟卵泡顆粒細(xì)胞中腐胺、亞精胺和精胺的峰面積與1， 6-己二胺的峰面積的比值，利用腐胺、亞精胺和精胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別求出3種物質(zhì)的含量 表 1)。
[0056] 親1聰頗綺細(xì)胸《膀的含畳。
LUUb/」買(mǎi)施例2應(yīng)用局效徽相巧諧法粒測(cè)十猶口心化哀邁后凹川日獨(dú)卯煙微粒細(xì)胞甲多 胺含量。
[0化引用1 mL的5 %的肥104收集約IO6個(gè)干擾表達(dá)后的碟卵泡顆粒細(xì)胞。
[0059] 向細(xì)胞中加入10化的500 iig/mL的內(nèi)標(biāo)工作液，縱滿震蕩混勻后用超聲波細(xì)胞破 碎儀破碎10 min, 12,000 g離屯、10 min,轉(zhuǎn)移上清液至10 mL棟色試管中。
[0060] 向離屯、沉淀中加入1 ml 5 %的HCl化，縱滿震蕩混勻、破碎細(xì)胞、離屯、，轉(zhuǎn)移上清液 至同一棟色試管中并混勻，加入等體積的2.5 mol/L化OH和4化的苯甲酯氯，縱滿震蕩混 勻。
[0061 ] 置于40°C水浴鍋中衍生1 h后，用6 mol/L的肥1調(diào)節(jié)抑值到7.0。
[0062] 將衍生液轉(zhuǎn)移至C18固相萃取柱(先用3 mL甲醇和和3 mL超純水活化)過(guò)濾萃取， 用15 mL的超純水和15 mL的15 %的甲醇洗去雜質(zhì)。
[0063] 過(guò)濾完后吹干殘余的甲醇和水，再用0.5 mL的色譜甲醇將樣品洗脫。
[0064] 用0.22皿針頭過(guò)濾器過(guò)濾洗脫液，取20化進(jìn)樣檢測(cè)。其色譜條件如下:流動(dòng)相比 例為甲醇:超純水=66:34( V/V);流速為0.9血/min;紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為229皿;柱溫為 25°C。干擾0^。表達(dá)后顆粒細(xì)胞中多胺檢測(cè)結(jié)果表明，腐胺、亞精胺、精胺和內(nèi)標(biāo)分峰良好， 且各物質(zhì)的出峰時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間一致(圖5 )。
[0065] 采用內(nèi)標(biāo)分析法，根據(jù)所測(cè)細(xì)胞中腐胺、亞精胺和精胺的峰面積與1,6-己二胺的 峰面積的比值，利用腐胺、亞精胺和精胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別求出巧中物質(zhì)的含量(表1)。
[0066] 實(shí)施例3應(yīng)用高效液相色譜檢測(cè)過(guò)表達(dá)0^。后四川白碟卵泡顆粒細(xì)胞中多胺含 量。
[0067] 用1 mL的5 %的肥1〇4收集約IO6個(gè)過(guò)表達(dá)后的碟卵泡顆粒細(xì)胞。
[006引向細(xì)胞中加入10化的500 iig/mL的內(nèi)標(biāo)工作液，縱滿震蕩混勻后用超聲波細(xì)胞破 碎儀破碎10 min, 12,000 g離屯、10 min,轉(zhuǎn)移上清液至10 mL棟色試管中。
[0069] 向離屯、沉淀中加入1 ml 5 %的HCl化，縱滿震蕩混勻、破碎細(xì)胞、離屯、，轉(zhuǎn)移上清液 至同一棟色試管中并混勻，加入等體積的2.5 mol/L化OH和4化的苯甲酯氯，縱滿震蕩混 勻。
[0070] 置于40°C水浴鍋中衍生1 h后，用6 mol/L的肥1調(diào)節(jié)抑值到7.0。
[0071] 將衍生液轉(zhuǎn)移至C18固相萃取柱(先用3 mL甲醇和和3 mL超純水活化)過(guò)濾萃取， 用15 mL的超純水和15 mL的15 %的甲醇洗去雜質(zhì)。
[0072]過(guò)濾完后吹干殘余的甲醇和水，再用0.5 mL的色譜甲醇將樣品洗脫。
[007引用0.22皿針頭過(guò)濾器過(guò)濾洗脫液，取20化進(jìn)樣檢測(cè)。其色譜條件如下:流動(dòng)相比 例為甲醇:超純水=66:34( V/V);流速為0.9血/min;紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為229皿;柱溫為 25°C。過(guò)表達(dá)0^。后顆粒細(xì)胞中多胺檢測(cè)結(jié)果表明，腐胺、亞精胺、精胺和內(nèi)標(biāo)分峰良好，且 各物質(zhì)的出峰時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間一致(圖6 )。
[0074]采用內(nèi)標(biāo)分析法，根據(jù)所測(cè)細(xì)胞中腐胺、亞精胺和精胺的峰面積與1,6-己二胺的 峰面積的比值，利用腐胺、亞精胺和精胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別求出巧中物質(zhì)的含量(表1)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種鵝卵泡顆粒細(xì)胞多胺固相萃取的方法，操作方法為： 用5 %的HClO4抽提鵝卵泡顆粒細(xì)胞中多胺，堿性條件下與苯甲酰氯發(fā)生衍生反應(yīng)，生成 強(qiáng)紫外吸收的苯甲酸脂類(lèi)多胺衍生物，經(jīng)過(guò)C18固相萃取柱將衍生液中的苯甲酸脂類(lèi)多胺 衍生物萃取、濃縮、洗去雜質(zhì)、色譜級(jí)甲醇洗脫等步驟，將鵝卵泡顆粒細(xì)胞中多胺轉(zhuǎn)化為可 利用高效液相色譜檢測(cè)的液態(tài)物質(zhì)； 其特征在于該方法的操作步驟為： (1) 用I mL的5 %的HC104收集約IO6個(gè)鵝卵泡顆粒細(xì)胞； (2) 向細(xì)胞中加入10 yL的500 yg/mL的內(nèi)標(biāo)工作液，漩渦震蕩混勻后用超聲波細(xì)胞破 碎儀破碎10 min，12,000 g離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至10 mL棕色試管中； (3) 向離心沉淀中加入I mL 5 %的HC104,漩渦震蕩混勻后用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎10 11^11，12,00〇8離心1〇1^11，轉(zhuǎn)移上清液至同一棕色試管中，混合均勻后加入等體積的2.5 mol/L NaOH和4 yL的苯甲酰氯，漩渦震蕩混勻； (4) 將試管置于40°C的水浴鍋中衍生I h; (5) 用6 mol/L的HCl調(diào)節(jié)衍生液pH值到7.0后，轉(zhuǎn)移衍生液至C18固相萃取柱(先用3 mL 甲醇和3 mL超純水活化），萃取過(guò)濾衍生液； (6) 分別用15 mL的超純水和15 mL的15 %的甲醇洗去雜質(zhì)； (7) 吹干殘余的甲醇和水，再用0.5 mL的色譜甲醇洗脫，洗脫液4°C避光保存。2. -種應(yīng)用高效液相色譜檢測(cè)鵝卵泡顆粒細(xì)胞中多胺含量的方法，色譜條件為： 流動(dòng)相比例為：甲醇：超純水=66 : 34( V/V);流速為：0.9 mL/min;色譜分離柱SWEEL Chromstar?C18(5 μπι，4·6Χ250 mm);紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為229 nm，柱溫為25°C; 其特征在于該方法的色譜條件為： (1) 檢測(cè)時(shí)間為14 min; (2) 流動(dòng)相比例為：甲醇:超純水=66:34(V/V); (3) 流速為:0.9 mL/min; (4) 色譜分離柱SWEEL Chromstar?C18(5 μηι，4·6Χ250 mm); (5) 紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為229 nm，柱溫為25°C。3. 根據(jù)權(quán)利要求1中（1)所述的鵝卵泡顆粒細(xì)胞中多胺固相萃取的步驟，其特征在于： 樣品細(xì)胞量約為IO6個(gè)/mL。4. 根據(jù)權(quán)利要求1中（3)所述的鵝卵泡顆粒細(xì)胞中多胺固相萃取的步驟，其特征在于： 衍生試劑為4 yL的苯甲酰氯，衍生條件為40°C水浴衍生I h，多胺衍生效果好，多胺衍生物 洗脫成分純度高，干擾成分少。5. 根據(jù)權(quán)利要求2中（1)所述的應(yīng)用高效液相色譜法檢測(cè)鵝卵泡顆粒細(xì)胞中多胺含量 的方法，其特征在于:檢測(cè)時(shí)間為14 min，檢測(cè)時(shí)間短。6. 根據(jù)權(quán)利要求2中（2)-(3)任意一項(xiàng)所述的應(yīng)用高效液相色譜法檢測(cè)鵝卵泡顆粒細(xì) 胞中多胺含量的方法，其特征在于:所用最佳條件是流動(dòng)相比例為甲醇:超純水=66:34(V/ V)，流速為0.9 mL/min，分離效果良好。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK105954427SQ201610504124
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年7月1日
【發(fā)明人】不公告發(fā)明人
【申請(qǐng)人】四川農(nóng)業(yè)大學(xué)