一種桂枝茯苓膠囊中三萜類成分指紋圖譜的建立方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于中藥檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種桂枝茯苓膠囊中三萜類成分指紋圖譜的建立方法，該方法包括以下步驟：a)、桂枝茯苓膠囊內(nèi)容物依次經(jīng)過提取劑提取和除提取劑后，與溶劑混合，得到供試品溶液；將茯苓酸與溶劑混合，得到對照品溶液；b)、分別將照品溶液與供試品溶液注入超高效液相色譜儀中進(jìn)行檢測，得到桂枝茯苓膠囊中三萜類成分指紋圖譜。通過此方法可建立桂枝茯苓膠囊中三萜類成分指紋圖譜，用于對桂枝茯苓膠囊的質(zhì)量進(jìn)行控制和評價(jià)。對本發(fā)明提供的方法進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性測試，測試結(jié)果表明，本發(fā)明提供方法的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性良好。
【專利說明】
一種桂枝茯苓膠囊中三萜類成分指紋圖譜的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于中藥檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種桂枝茯苓膠囊中三萜類成分指紋圖譜的 建立方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 中藥指紋圖譜是指某種中藥材或中成藥中所共有的、具有特征性的某類或數(shù)類成 分的色譜或光譜的圖譜。在現(xiàn)階段，中藥的有效成分絕大多數(shù)沒有明確的情況下，中藥指紋 圖譜對于有效控制和評價(jià)中藥材或中成藥的質(zhì)量具有重要的意義。
[0003 ]桂枝茯苓膠囊由桂枝、茯苓、牡丹皮、赤芍和桃仁共5味中藥組成，具有活血、化瘀、 消癥之功效，主治婦人瘀血阻絡(luò)所致癥塊、經(jīng)閉、痛經(jīng)、產(chǎn)后惡露不盡;子宮肌瘤，慢性盆腔 炎包塊，痛經(jīng)，子宮內(nèi)膜異位癥，卵巢囊腫見上述證候者；也可用于女性乳腺香囊性增生病 屬瘀血阻絡(luò)癥，癥見乳房疼痛、乳房腫塊、胸肋脹悶；或用于前列腺增生屬瘀阻膀胱證，癥見 小便不爽、小腹脹痛。
[0004] 茯苓三萜是桂枝茯苓膠囊的有效成分之一，具有抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用， 如果能夠?qū)鹬蜍吣z囊中茯苓三萜類成分的種類及其含量進(jìn)行檢測，那么對控制和評價(jià) 桂枝茯苓膠囊的質(zhì)量具有十分重要的意義。因此，為了更好地反映桂枝茯苓膠囊的內(nèi)在質(zhì) 量，建立桂枝茯苓膠囊中三萜類成分的指紋圖譜是非常必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種桂枝茯苓膠囊中三萜類成分指紋圖譜的建 立方法，通過此方法能夠建立桂枝茯苓膠囊中三萜類成分指紋圖譜，用于對桂枝茯苓膠囊 的質(zhì)量進(jìn)行控制和評價(jià)。
[0006] 本發(fā)明提供了一種桂枝茯苓膠囊中三萜類成分指紋圖譜的建立方法，包括以下步 驟：
[0007] a)、桂枝茯苓膠囊內(nèi)容物依次經(jīng)過提取劑提取和除提取劑后，與溶劑混合，得到供 試品溶液;將茯苓酸與溶劑混合，得到對照品溶液；
[0008] b)、分別將照品溶液與供試品溶液注入超高效液相色譜儀中進(jìn)行檢測，得到桂枝 茯苓膠囊中三萜類成分指紋圖譜。
[0009] 優(yōu)選的，檢測的過程中，以乙腈為流動相的A相，以0.00~0.5vol %酸的水溶液為 流動相的B相，所述酸包括磷酸、甲酸和冰醋酸中的一種或多種。
[0010]優(yōu)選的，檢測的過程中，洗脫方式為梯度洗脫，洗脫程序設(shè)置為：
[0011] 起始時(shí)，A相與B相的體積比為50:50; 12min時(shí)，A相與B相的體積比為55:45; 16min 時(shí)，A相與B相的體積比為60:40; 20min時(shí)，A相與B相的體積比為65:35; 24min時(shí)，A相與B相的 體積比為70:30 ; 28min時(shí)，A相與B相的體積比為75: 25; 32min時(shí)，A相與B相的體積比為85: 15; 34~60min時(shí)，A相與B相的體積比為90:10。
[0012]優(yōu)選的，檢測的過程中，檢測的波長200~220nm〇
[0013] 優(yōu)選的，檢測的過程中，流動相的流速為0.18~0.22mL/min。
[0014] 優(yōu)選的，檢測的過程中，超高效液相色譜儀中色譜柱的柱溫為20~30°C。
[0015]優(yōu)選的，檢測的過程中，理論塔板數(shù)按茯苓酸峰計(jì)算不低于40000。
[0016]優(yōu)選的，步驟a)中，所述提取的方式為加熱回流提取。
[0017]優(yōu)選的，以茯苓酸作為內(nèi)參物，其相對保留時(shí)間為1.00,所述指紋圖譜中其它共有 峰的相對保留時(shí)間分別為：0·375±20%、0·461±20%、0·519±20%、0·645±20%、0·662 ±20%、0.707±20%、0.903±20%、0.923±20%、0.937±20%、0.952±20%、0.969 土 20%、1.085±20%、1.109±20%、1.151±20%、1.210±20%、1.439±20%、1.478±20%、 1.656±20% 和 1.735±20%。
[0018] 優(yōu)選的，所述指紋圖譜中，相對保留時(shí)間分別為0.375 ± 20 %、0.461 ± 20 %、0.519 ±20%、0.645±20%、0.707±20%、0.903±20%、0.937±20%、0.952±20%、0.969 土 20%、1.085±20%、1.151±20%、1.210±20%、1.439±20%、1.478±20%和1.735± 20%，對應(yīng)的化合物依次為:常春藤皂苷、去氫土莫酸、土莫酸、豬苓酸C、3-表去氫土莫酸、 茯苓酸D、a_亞麻酸、去氫茯苓酸、齊墩果酸、亞油酸、棕櫚油酸甲酯、棕櫚酸、棕櫚酸乙酯、 胡蘿卜苷和阿福豆苷。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種桂枝茯苓膠囊中三萜類成分指紋圖譜的建立 方法，該方法包括以下步驟:a)、桂枝茯苓膠囊內(nèi)容物依次經(jīng)過提取劑提取和除提取劑后， 與溶劑混合，得到供試品溶液;將茯苓酸與溶劑混合，得到對照品溶液;b)、分別將照品溶液 與供試品溶液注入超高效液相色譜儀中進(jìn)行檢測，得到桂枝茯苓膠囊中三萜類成分指紋圖 譜。通過此方法可建立桂枝茯苓膠囊中三萜類成分指紋圖譜，用于對桂枝茯苓膠囊的質(zhì)量 進(jìn)行控制和評價(jià)。對本發(fā)明提供的方法進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性測試，測試結(jié)果表明， 本發(fā)明提供方法的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性良好。
【附圖說明】
[0020] 為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù) 提供的附圖獲得其他的附圖。
[0021] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例1提供的桂枝茯苓膠囊中三萜類成分的指紋圖譜；
[0022] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例2提供的桂枝茯苓膠囊中三萜類成分的對照指紋圖譜；
[0023] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例2提供的10個批次的桂枝茯苓膠囊供試品色譜圖與對照指紋 圖譜的對比圖；
[0024] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例3提供的桂枝茯苓膠囊中三萜類成分的色譜圖；
[0025] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例7提供的桂枝茯苓膠囊中三萜類成分指紋圖譜中各共有峰歸 屬色譜圖；
[0026] 圖6是本發(fā)明實(shí)施例8提供的桂枝茯苓膠囊中三萜類成分的色譜圖；
[0027] 圖7是本發(fā)明實(shí)施例9提供的桂枝茯苓膠囊中三萜類成分的色譜圖；
[0028] 圖8是本發(fā)明實(shí)施例10提供的桂枝茯苓膠囊中三萜類成分的色譜圖；
[0029] 圖9是本發(fā)明實(shí)施例11提供的桂枝茯苓膠囊中三萜類成分的色譜圖；
[0030] 圖10是本發(fā)明實(shí)施例12提供的桂枝茯苓膠囊中三萜類成分的色譜圖；
[0031] 圖11是本發(fā)明實(shí)施例13提供的桂枝茯苓膠囊中三萜類成分的色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 下面對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例 僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技 術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范 圍。
[0033]本發(fā)明提供了一種桂枝茯苓膠囊中三萜類成分指紋圖譜的建立方法，包括以下步 驟：
[0034] a)、桂枝茯苓膠囊內(nèi)容物依次經(jīng)過提取劑提取和除提取劑后，與溶劑混合，得到供 試品溶液;將茯苓酸與溶劑混合，得到對照品溶液；
[0035] b)、分別將照品溶液與供試品溶液注入超高效液相色譜儀中進(jìn)行檢測，記錄色譜 圖，用指紋圖譜軟件對圖譜進(jìn)行處理，得到桂枝茯苓膠囊中三萜類成分指紋圖譜。
[0036] 在本發(fā)明中，首先配制供試品溶液和對照品溶液。其中，供試品溶液按照以下方法 配制：
[0037] 桂枝茯苓膠囊內(nèi)容物依次經(jīng)過提取劑提取和除提取劑后，與溶劑混合，得到供試 品溶液。
[0038] 在本發(fā)明提供的上述配制供試品溶液的方法中，所述提取的方式優(yōu)選為加熱回流 提取;所述提取劑優(yōu)選為乙醚;所述桂枝茯苓膠囊內(nèi)容物與提取劑的用量比優(yōu)選為（1~10) g: (10~100)mL，更優(yōu)選為5g: (30~80)mL，最優(yōu)選為5g: 50mL;所述除提取劑的方式優(yōu)選為 蒸發(fā);所述溶劑優(yōu)選為甲醇。
[0039] 在本發(fā)明提供的一個實(shí)施例中，具體按照以下方式配制供試品溶液：
[0040] 1)、將桂枝茯苓膠囊內(nèi)容物在提取劑中浸潤后加熱回流，然后過濾加熱回流產(chǎn)物， 得到提取液和濾渣；
[0041 ] 2)、所述提取液除提取劑后與溶劑混合，得到供試品溶液。
[0042] 在本發(fā)明上述實(shí)施例提供的配置方法中，所述浸潤的時(shí)間優(yōu)選為10~60min，更優(yōu) 選為30~40min;所述加熱回流的時(shí)間優(yōu)選為10~60min，更優(yōu)選為30~40min。在本發(fā)明中， 優(yōu)選對所述濾渣進(jìn)行二次提取，所述二次提取的方式優(yōu)選為:使用提取劑潤洗所述濾渣， 得到洗液。得到洗液后，所述洗液與所述提取液合并后進(jìn)行后續(xù)工藝處理。
[0043] 在本發(fā)明中，為保護(hù)后續(xù)檢測過程中使用的超高效液相色譜儀，得到所述供試品 溶液后，優(yōu)選對所述供試品溶液進(jìn)行過濾，以濾除供試品溶液中可能含有的雜質(zhì)。所述過濾 的濾膜孔徑優(yōu)選為〇. 1~〇. 4μL?，更優(yōu)選為0.2~0.3μL?，最優(yōu)選為0.22μηι。
[0044] 在本發(fā)明中，對照品溶液按照以下方法配制:將茯苓酸與溶劑混合，得到對照品溶 液。在本發(fā)明中，以茯苓酸作為參照物，將其配制成對照品溶液。其中，所述溶劑優(yōu)選為甲 醇;所述對照品溶液中茯苓酸的含量優(yōu)選為50~200yg/mL，更優(yōu)選為100~150yg/mL。
[0045] 配制好供試品溶液和對照品溶液后，分別將照品溶液與供試品溶液注入超高效液 相色譜儀中進(jìn)行檢測。檢測過程中，使用的色譜柱優(yōu)選為C 18柱，更優(yōu)選為Agilent Z0RBAX Eclipse HD C18柱;檢測的波長優(yōu)選為200~220nm，更優(yōu)選為210min;色譜柱的柱溫優(yōu)選為 20~30°C，更優(yōu)選為25°C ;流動相的流速優(yōu)選為0.18~0.22mL/min，更優(yōu)選為0.2mL/min;理 論塔板數(shù)按茯苓酸峰計(jì)算優(yōu)選不低于40000。
[0046] 檢測過程中，優(yōu)選以乙腈為流動相的A相，以0.00~0.5vol %酸的水溶液為流動相 的B相，所述酸包括磷酸、甲酸和冰醋酸中的一種或多種，更優(yōu)選以0.05~0.2vol %磷酸水 溶液為流動相的B相。檢測過程中，洗脫方式優(yōu)選為梯度洗脫，洗脫程序設(shè)置為:起始時(shí)，A相 與B相的體積比為50:50; 12min時(shí)，A相與B相的體積比為55:45; 16min時(shí)，A相與B相的體積比 為60:40; 20min時(shí)，A相與B相的體積比為65:35; 24min時(shí)，A相與B相的體積比為70:30; 28min 時(shí)，A相與B相的體積比為75:25;3211^11時(shí)4相與財(cái)目的體積比為85:15 ;34~6〇1^11時(shí)4相與8 相的體積比為90:10。
[0047] 檢測結(jié)束后，得到色譜圖，所述色譜圖即可作為桂枝茯苓膠囊中三萜類成分指紋 圖譜。在本發(fā)明提供的一個實(shí)施例中，也可采用指紋圖譜軟件對所述色譜圖進(jìn)行處理，得到 軟件處理的桂枝茯苓膠囊中三萜類成分指紋圖譜。所述指紋圖譜軟件優(yōu)選為國家藥典頒布 的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》。
[0048] 在本發(fā)明提供的一個實(shí)施例中，采用以下方法建立指紋圖譜，該過程具體為：
[0049] A)、將多批次桂枝茯苓膠囊內(nèi)容物依次經(jīng)過提取劑提取和除提取劑后，與溶劑混 合，得到多個供試品溶液;將茯苓酸與溶劑混合，得到對照品溶液；
[0050] B)、分別將照品溶液與多個所述供試品溶液注入超高效液相色譜儀中進(jìn)行檢測， 得到多張桂枝茯苓膠囊內(nèi)容物的色譜圖；
[0051] C)、標(biāo)定多張所述色譜圖的共有峰，用指紋圖譜軟件對色譜圖進(jìn)行處理，得到桂枝 茯苓膠囊中三萜類成分指紋圖譜。
[0052]在本發(fā)明上述實(shí)施例提供的方法中，所述共有峰的個數(shù)優(yōu)選為16~25個，更優(yōu)選 為20個;所述指紋圖譜軟件優(yōu)選為國家藥典頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》； 所述處理方法優(yōu)選為中位數(shù)法。
[0053] 在本發(fā)明提供的一個實(shí)施例中，以茯苓酸作為內(nèi)參物，其相對保留時(shí)間為1.00,所 述指紋圖譜中其它共有峰的相對保留時(shí)間分別為：0.375 ±20 %、0.461 ±20 %、0.519 土 20%、0.645±20%、0.662±20%、0.707±20%、0.903±20%、0.923±20%、0.937±20%、 0.952±20%、0.969±20%、1.085±20%、1.109±20%、1.151±20%、1.210±20%、1.439 ±20%、1.478±20%、1.656±20%和1.735±20%。
[0054] 在本發(fā)明提供的一個指紋圖譜共有峰的相對保留時(shí)間為上述數(shù)值的實(shí)施例中，所 述指紋圖譜中，相對保留時(shí)間為0.461 ± 20%時(shí)對應(yīng)的相對峰面積為0.323 ± 20% ;相對保 留時(shí)間為〇. 519 ± 20%時(shí)對應(yīng)的相對峰面積為0.485± 20% ;相對保留時(shí)間為0.662± 20% 時(shí)對應(yīng)的相對峰面積為1.233±20% ;相對保留時(shí)間為0.937± 20%時(shí)對應(yīng)的相對峰面積為 0.359 ± 20 % ;相對保留時(shí)間為1時(shí)對應(yīng)的相對峰面積為1;相對保留時(shí)間為1.085 ± 20 %時(shí) 對應(yīng)的相對峰面積為1.584± 20 % ;相對保留時(shí)間為1.210 ± 20 %時(shí)對應(yīng)的相對峰面積為 0.207 ± 25% ;相對保留時(shí)間為1.735 ± 20%時(shí)對應(yīng)的相對峰面積為0.498 ± 20%。
[0055] 在本發(fā)明提供的一個指紋圖譜共有峰的相對保留時(shí)間為上述數(shù)值的實(shí)施例中，所 述指紋圖譜中，相對保留時(shí)間為0.375± 20%時(shí)對應(yīng)的化合物為常春藤皂苷;相對保留時(shí)間 為0.461 ± 20 %時(shí)對應(yīng)的化合物為去氫土莫酸;相對保留時(shí)間為0.519 ± 20 %時(shí)對應(yīng)的化合 物為土莫酸；相對保留時(shí)間為0.645±20%時(shí)對應(yīng)的化合物為豬苓酸C;相對保留時(shí)間為 0.707 ± 20 %時(shí)對應(yīng)的化合物為3-表去氫土莫酸;相對保留時(shí)間為0.903 ± 20%時(shí)對應(yīng)的 化合物為茯苓酸D;相對保留時(shí)間為0.937 ± 20 %時(shí)對應(yīng)的化合物為α-亞麻酸;相對保留時(shí) 間為0.952 ± 20 %時(shí)對應(yīng)的化合物為去氫茯苓酸;相對保留時(shí)間為0.969 ± 20 %時(shí)對應(yīng)的化 合物為齊墩果酸；相對保留時(shí)間為1時(shí)對應(yīng)的化合物為茯苓酸；相對保留時(shí)間為1.085 ± 20 %時(shí)對應(yīng)的化合物為亞油酸；相對保留時(shí)間為1.151 ± 20 %時(shí)對應(yīng)的化合物為棕櫚油酸 甲酯；相對保留時(shí)間為1.210±20%時(shí)對應(yīng)的化合物為棕櫚酸；相對保留時(shí)間為1.439土 20 %時(shí)對應(yīng)的化合物為棕櫚酸乙酯；相對保留時(shí)間為1.478 ± 20 %時(shí)對應(yīng)的化合物為胡蘿卜 苷;相對保留時(shí)間為1.735 ± 20 %時(shí)對應(yīng)的化合物為阿福豆苷。
[0056]采用本發(fā)明提供的方法可建立桂枝茯苓膠囊中三萜類成分指紋圖譜，用于對桂枝 茯苓膠囊的質(zhì)量進(jìn)行控制和評價(jià)。對本發(fā)明提供的方法進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性測試， 試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的方法精密度和重復(fù)性良好，供試品12小時(shí)內(nèi)成分穩(wěn)定。
[0057]為更清楚起見，下面通過以下實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0058]本發(fā)明實(shí)施例中涉及的儀器與試藥如下：
[0059] 儀器:Agilent 1290超高壓液相色譜儀，DAD紫外檢測器;Mettler ΑΕ240電子分析 天平;BSA224S-CW型電子分析天平;Centrifuge 541 f5D高速離心機(jī);Milli_Q Academic純水 機(jī)。
[0060] 試劑：桂枝茯苓膠囊（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號：130501、140301、 140401、140701、140801、140901、141001、141002、141101、150701;對照品：去氫茯苓酸、茯 苓酸、去氫土莫酸;乙腈(色譜純，美國天地公司），水為超純水，其余試劑均為分析純。
[0061 ] 實(shí)施例1
[0062]指紋圖譜的建立
[0063] 1)供試品溶液和對照品溶液的制備：
[0064]供試品溶液:取桂枝茯苓膠囊內(nèi)容物適量，混勻，取約5g，精密稱定，置150mL圓底 燒瓶內(nèi)，加乙醚50mL，浸潤30min后加熱回流40min，過濾，濾渣用少量乙醚潤洗，合并洗液于 蒸發(fā)皿內(nèi)，蒸干，加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5mL量瓶內(nèi)，加甲醇稀釋定容至刻度搖勻，過0.22μπι濾 膜，即得供試品溶液；
[0065] 對照品溶液:5mg茯苓酸加入至50mL量瓶內(nèi)，加甲醇稀釋定容至刻度搖勻，過0.22 μπι濾膜，即得對照品溶液。
[0066] 2)超高效液相色譜檢測：
[0067] 分別精密吸取照品溶液與供試品溶液各lyL注入超高效液相色譜儀，測定，記錄 60min圖譜，色譜條件為：
[0068] 色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse HD Ci8(2· 1 X 100mm，1 ·8μηι);以乙臆為流動相 Α，以0.1 vol %磷酸水溶液為流動相Β，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫;流速每分鐘為0.2mL; 檢測波長為210nm;柱溫25°C;理論板數(shù)按茯苓酸峰計(jì)算不低于40000。
[0069] 表1梯度洗脫程序表
[0070]
[0071] 3)建立對照指紋圖譜：
[0072]按照步驟2)，對批號130501的桂枝茯苓膠囊進(jìn)行檢測，得到色圖譜，即為桂枝茯苓 膠囊中三萜類成分的指紋圖譜。如圖1所示。圖1是本發(fā)明實(shí)施例1提供的桂枝茯苓膠囊中三 萜類成分的指紋圖譜。
[0073] 實(shí)施例2
[0074] 1、指紋圖譜的建立
[0075] 分別取10個批次的桂枝茯苓膠囊供試品（批號130501、140301、140401、140701、 140801、140901、141001、141002、141101、150701)內(nèi)容物適量，取約5g，精密稱定，按照實(shí)施 例1的步驟1)中供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，按照實(shí)施例1的步驟2)的色譜條件 進(jìn)行超高效液相色譜測試，去掉前5min色譜峰，得到10條色譜圖（即10個批次桂枝茯苓膠囊 中三萜類成分的指紋圖譜），標(biāo)定10條色譜圖的20個共有峰，采用國家藥典頒布的《中藥色 譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》2012年版進(jìn)行分析，以中位數(shù)法對照指紋圖譜生成法，建立對 照指紋圖譜，如圖2所示。圖2是本發(fā)明實(shí)施例2提供的桂枝茯苓膠囊中三萜類成分的對照 指紋圖譜，圖2中每個封號對應(yīng)的相對保留時(shí)間和相對峰面積如表2所示：
[0076] 表2對照指紋圖譜中共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積范圍
[0077]

[0078] 2、共有峰指認(rèn)
[0079] 1)、色譜條件:除0. lvol %磷酸水溶液改為0. lvol %甲酸水溶液外，其余條件與實(shí) 施例1相同；
[0080] 2)、質(zhì)譜條件：采用ESI源，正、負(fù)離子模式分別掃描，毛細(xì)管電壓（正離子模式：4 000V;負(fù)離子模式:3500V)，霧化氣壓力45psi，干燥氣流速10L ·π?η-S加熱毛細(xì)管溫度350 °C，源內(nèi)裂解電壓175V，錐孔電壓65V，質(zhì)量數(shù)掃描范圍m/z 100~2 000。
[0081 ] 3)、化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫建立:通過Agilent提供的"formula-database-generator"軟 件建立GFC中化學(xué)成分的分子式與理論相對分子質(zhì)量數(shù)據(jù)庫。
[0082] 4)、指紋圖譜中共有峰鑒別:應(yīng)用UPLC/Q TOF MS在上述色譜和質(zhì)譜條件下對供試 品溶液進(jìn)行定性分析，結(jié)合紫外光譜信息、MS數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)進(jìn)行分析，初步鑒定出16個化合 物。對應(yīng)圖2,分別為1-常春藤皂苷、2-去氫土莫酸、3-土莫酸、4-豬苓酸C、6-3-表去氫土莫 酸、7-茯苓酸D、9-a-亞麻酸、10-去氫茯苓酸、11-齊墩果酸、12-茯苓酸、13-亞油酸、15-棕櫚 油酸甲酯、16-棕櫚酸、17-棕櫚酸乙酯、18-胡蘿卜苷、20-阿福豆苷。UPLC-Q-T0F/MS鑒定結(jié)果 見表3:
[0083]表3對照指紋圖譜中共有峰的指認(rèn)信息
[0084]
[0085] 3、相似度計(jì)算
[0086] 上述10個批次的桂枝茯苓膠囊供試品的色譜圖與對照指紋圖譜的對比圖如圖3所 示，圖3是本發(fā)明實(shí)施例2提供的10個批次的桂枝茯苓膠囊供試品色譜圖與對照指紋圖譜的 對比圖，圖3中，最上面的圖譜曲線為對照指紋圖譜，往下依次為10個批次的桂枝茯苓膠囊 供試品色譜曲線，對應(yīng)的批號標(biāo)注在色譜曲線的右側(cè)。
[0087]采用相似度軟件（中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)），以對照指紋圖譜作為參照 圖譜，計(jì)算10個批次的桂枝茯苓膠囊供試品指紋圖譜的相似度，結(jié)果見表4:
[0088]表4相似度計(jì)算結(jié)果
[0089]
[0090] 根據(jù)表4可以看出，10批樣品的指紋圖譜與對照指紋圖譜相似度在0.9以上，說明 該10批樣品中的三萜類成分含量穩(wěn)定。
[0091] 實(shí)施例3 [0092] 滯后峰測試
[0093] 本實(shí)施例中，滯后峰測試的過程與實(shí)施例1建立指紋圖譜的過程與基本相同，其區(qū) 別僅在于本實(shí)施例中記錄120min圖譜。得到的色譜圖如圖4所示。圖4是本發(fā)明實(shí)施例3提供 的桂枝茯苓膠囊中三萜類成分的色譜圖。通過圖4可以看出，結(jié)果50min后無色譜峰，因此在 桂枝茯苓膠囊指紋圖譜測定時(shí)，實(shí)施例1選擇的色譜條件適宜，無滯后成分影響樣品測定。
[0094] 實(shí)施例4 [0095] 精密度試驗(yàn)
[0096]取同一供試品（批號130501)內(nèi)容物適量，取約5g，精密稱定，按照實(shí)施例1的步驟 1)中供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，按照實(shí)施例1的步驟2)的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次進(jìn)行測定。采用相似度軟件（中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)），去掉前5min色譜峰，以 第1次進(jìn)樣所得指紋圖譜作為參照圖譜，計(jì)算后5次進(jìn)樣所得指紋圖譜的相似度。通過全譜 峰匹配(峰面積按總峰的0.1%以上的峰面積參與匹配），相似度結(jié)果均不小于0.99,符合指 紋圖譜的技術(shù)要求，表明該方法精密度良好。
[0097] 實(shí)施例5 [0098] 穩(wěn)定性試驗(yàn)
[0099]取同一供試品（批號130501)內(nèi)容物適量，取約5g，精密稱定，按照實(shí)施例1的步驟 1)中供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，按照實(shí)施例1的步驟2)的色譜條件于0、2、4、 6、8、12小時(shí)分別測定一次指紋圖譜，采用相似度軟件（中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系 統(tǒng)），去掉前5min色譜峰，以第1次進(jìn)樣所得指紋圖譜作為參照圖譜，計(jì)算后5次進(jìn)樣所得指 紋圖譜的相似度。通過全譜峰匹配(峰面積按總峰的0.1%以上的峰面積參與匹配），相似度 結(jié)果均不小于0.99,符合指紋圖譜的技術(shù)要求，表明供試品溶液12小時(shí)內(nèi)成分是穩(wěn)定的。 [0100] 實(shí)施例6 [0101] 重復(fù)性試驗(yàn)
[0102] 取同一供試品（批號130501)內(nèi)容物適量，取約5g，精密稱定，按照實(shí)施例1的步驟 1)中供試品溶液的制備方法平行制備6份，按照實(shí)施例1的步驟2)的色譜條件測定指紋圖 譜，采用相似度軟件（中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)），去掉前5min色譜峰，以第1次進(jìn) 樣所得指紋圖譜作為參照圖譜，計(jì)算后5次進(jìn)樣所得指紋圖譜的相似度。通過全譜峰匹配 (峰面積按總峰的0.1%以上的峰面積參與匹配），相似度結(jié)果均不小于0.99,符合指紋圖譜 的技術(shù)要求，表明該方法可較好重復(fù)。
[0103] 實(shí)施例7
[0104] 指紋圖譜中共有峰的歸屬
[0105] 取茯苓藥材、桃仁藥材、白芍藥材、丹皮藥材、桂枝藥材各約0.5g，精密稱定于圓底 燒瓶內(nèi)，加乙醚25mL浸潤30min后加熱回流40min，過濾，濾渣用少量乙醚潤洗，合并洗液于 蒸發(fā)皿內(nèi)，蒸干，加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5mL量瓶內(nèi)，加甲醇稀釋定容至刻度搖勻，過0.22μπι濾 膜，即得茯苓藥材供試品溶液、桃仁藥材供試品溶液、白芍藥材供試品溶液、丹皮藥材供試 品溶液和桂枝藥材供試品溶液。
[0106] 按照實(shí)施例1的步驟2)的色譜條件對上述供試品溶液進(jìn)行超高效液相色譜檢測， 去掉前5min色譜峰，檢測結(jié)果通過保留時(shí)間和DAD (Diode array detector，二極管陣列）掃 描分析，并與實(shí)施例1建立的對照指紋圖譜中標(biāo)定的20個共有峰進(jìn)行對應(yīng)，結(jié)果見圖5,圖5 是本發(fā)明實(shí)施例7提供的桂枝茯苓膠囊中三萜類成分指紋圖譜中各共有峰歸屬色譜圖。圖5 中，最上面的圖譜曲線為對照指紋圖譜，往下依次為不同藥材供試品色譜曲線，對應(yīng)的藥材 種類標(biāo)注在色譜曲線的右側(cè)。通過圖5可以看出，對照指紋圖譜中1、2、3、4、5、6、7、10、12、 14、15、17號峰共12個色譜峰主要來自于茯苓藥材，8、9、11、13、16號峰來自于其他四味藥 材，18、19、20號峰未能歸屬。
[0107] 實(shí)施例8
[0108]不同色譜條件下獲取的色譜圖
[0109]本實(shí)施例中，色譜圖的獲取過程與實(shí)施例1建立指紋圖譜的過程與基本相同，其區(qū) 別僅在于本實(shí)施例以乙腈為流動相A，以水為流動相B。得到的色譜圖如圖6所示，圖6是本發(fā) 明實(shí)施例8提供的桂枝茯苓膠囊中三萜類成分的色譜圖。
[0110] 實(shí)施例9
[0111] 不同色譜條件下獲取的色譜圖
[0112] 本實(shí)施例中，色譜圖的獲取過程與實(shí)施例1建立指紋圖譜的過程與基本相同，其區(qū) 別僅在于本實(shí)施例以甲醇為流動相A，以O(shè).lvol%磷酸水溶液為流動相B。得到的色譜圖如 圖7所示。圖7是本發(fā)明實(shí)施例9提供的桂枝茯苓膠囊中三萜類成分的色譜圖。
[0113] 實(shí)施例1〇
[0114] 不同色譜條件下獲取的色譜圖
[0115] 本實(shí)施例中，色譜圖的獲取過程與實(shí)施例1建立指紋圖譜的過程與基本相同，其區(qū) 別僅在于本實(shí)施例中色譜柱柱溫為20°C。得到的色譜圖如圖8所示。圖8是本發(fā)明實(shí)施例10 提供的桂枝茯苓膠囊中三萜類成分的色譜圖。
[0116] 實(shí)施例11
[0117] 不同色譜條件下獲取的色譜圖
[0118] 本實(shí)施例中，色譜圖的獲取過程與實(shí)施例1建立指紋圖譜的過程與基本相同，其區(qū) 別僅在于本實(shí)施例中色譜柱柱溫為30°C。得到的色譜圖，即桂枝茯苓膠囊中三萜類成分的 指紋圖譜如圖9所示。圖9是本發(fā)明實(shí)施例11提供的桂枝茯苓膠囊中三萜類成分的色譜圖。 [0 119] 實(shí)施例12
[0120]不同色譜條件下獲取的色譜圖
[0121]本實(shí)施例中，色譜圖的獲取過程與實(shí)施例1建立指紋圖譜的過程與基本相同，其區(qū) 別僅在于本實(shí)施例中流動相流速為〇. 18mL/min。得到的色譜圖如圖10所示。圖10是本發(fā)明 實(shí)施例12提供的桂枝茯苓膠囊中三萜類成分的色譜圖。
[0122] 實(shí)施例12
[0123]不同色譜條件下獲取的色譜圖
[0124] 本實(shí)施例中，色譜圖的獲取過程與實(shí)施例1建立指紋圖譜的過程與基本相同，其區(qū) 別僅在于本實(shí)施例中流動相流速為〇. 22mL/min。得到的色譜圖如圖11所示。圖11是本發(fā)明 實(shí)施例13提供的桂枝茯苓膠囊中三萜類成分的色譜圖。
[0125] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種桂枝茯苓膠囊中三萜類成分指紋圖譜的建立方法，包括以下步驟： a) 、桂枝茯苓膠囊內(nèi)容物依次經(jīng)過提取劑提取和除提取劑后，與溶劑混合，得到供試品 溶液;將茯苓酸與溶劑混合，得到對照品溶液； b) 、分別將照品溶液與供試品溶液注入超高效液相色譜儀中進(jìn)行檢測，得到桂枝茯苓 膠囊中三萜類成分指紋圖譜。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，檢測的過程中，以乙腈為流動相的A相，以 0. 00~0.5vol %酸的水溶液為流動相的B相，所述酸包括磷酸、甲酸和冰醋酸中的一種或多 種。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，檢測的過程中，洗脫方式為梯度洗脫，洗脫 程序設(shè)置為： 起始時(shí)，A相與B相的體積比為50:50;1211^11時(shí)4相與8相的體積比為55:45 ;161^11時(shí)4 相與B相的體積比為60:40; 20min時(shí)，A相與B相的體積比為65:35; 24min時(shí)，A相與B相的體積 比為70:30;2811^11時(shí)4相與時(shí)目的體積比為75 :25;321^11時(shí)4相與財(cái)目的體積比為85:15;34 ~60min時(shí)，A相與B相的體積比為90:10。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，檢測的過程中，檢測的波長200~220nm。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，檢測的過程中，流動相的流速為0.18~ 0·22mL/min〇6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，檢測的過程中，超高效液相色譜儀中色譜 柱的柱溫為20~30°C。7. 根據(jù)權(quán)利要求1~6任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，檢測的過程中，理論塔板數(shù)按茯 苓酸峰計(jì)算不低于40000。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a)中，所述提取的方式為加熱回流提 取。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，以茯苓酸作為內(nèi)參物，其相對保留時(shí)間為1. 〇〇,所述指紋圖譜中其它共有峰的相對保留時(shí)間分別為：0.375±20%、0.461 ±20%、 0.519±20%、0.645±20%、0.662±20%、0.707±20%、0.903±20%、0.923±20%、0.937 ± 20 %、0.952 ±20 %、0.969 ±20 %、1.085 ±20 %、1.109 ±20 %、1.151 ±20 %、1.210 土 20%、1.439±20%、1.478±20%、1.656±20%和1.735±20%。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述指紋圖譜中，相對保留時(shí)間分別為 0.375±20%、0.461±20%、0.519±20%、0.645±20%、0.707±20%、0.903±20%、0.937 ± 20 %、0.952 ±20 %、0.969 ±20 %、1.085 ±20 %、1.151 ±20 %、1.210 ±20 %、1.439 土 20 %、1.478 ± 20 %和1.735 ± 20 %，對應(yīng)的化合物依次為：常春藤皂苷、去氫土莫酸、土莫 酸、豬苓酸C、3_表去氫土莫酸、茯苓酸D、a_亞麻酸、去氫茯苓酸、齊墩果酸、亞油酸、棕櫚油 酸甲酯、棕櫚酸、棕櫚酸乙酯、胡蘿卜苷和阿福豆苷。
【文檔編號】G01N30/02GK105974030SQ201610583987
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年7月22日
【發(fā)明人】蕭偉, 林夏, 何艷梅, 王偉, 秦建平, 李家春, 黃文哲, 丁崗, 王振中
【申請人】江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司