一種丙型肝炎病毒抗體時(shí)間分辨檢測(cè)試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種丙型肝炎病毒抗體時(shí)間分辨檢測(cè)試劑盒，選用特定重組抗原用于包被和標(biāo)記，對(duì)封閉工藝進(jìn)行了優(yōu)化，提高了試劑盒的特異性，對(duì)標(biāo)記用生物素種類及標(biāo)記工藝做了系統(tǒng)性的優(yōu)化使得試劑盒的靈敏度進(jìn)一步提升，不但靈敏度高、特異性好，同時(shí)相較進(jìn)口發(fā)光試劑，檢測(cè)成本大大降低。
【專利說明】
一種丙型肝炎病毒抗體時(shí)間分辨檢測(cè)試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及病毒蛋白免疫分析技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種丙型肝炎病毒抗體時(shí)間分 辨檢測(cè)試劑盒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 丙型病毒性肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的傳染病，可通過血液、吸毒、母嬰 及性傳播等。有研究表明，20 %~50 %的HCV感染者會(huì)發(fā)生自發(fā)性病毒清除，但是仍然有 50 %~80 %的感染者會(huì)持續(xù)感染，其中85 %進(jìn)展為慢性肝炎，10~30年后，部分慢性丙肝患 者（尤其年齡較長(zhǎng)患者）發(fā)展為肝硬化，2~10年后，可能發(fā)展為肝細(xì)胞癌。由于與慢性乙 肝相比，丙肝更隱蔽，潛伏期為2~26周;癥狀更不明顯，高達(dá)75%的感染者無任何癥狀，因 此很容易被忽視，在中國(guó)，丙肝漏報(bào)率高達(dá)52%。目前為止，尚未研制成功可以預(yù)防丙肝的 疫苗，因此防治丙肝只有早診斷、早治療，防治病情的進(jìn)一步惡化，否則將會(huì)使自身病情加 重、影響身體健康，甚至可能將病毒傳染給其他人。因此有必要開發(fā)出一種性能較好的診斷 方法，能有效地在早期就將該疾病診斷出來，及時(shí)治療，減少因丙肝帶來的健康和財(cái)產(chǎn)的損 失。
[0003] 近年來臨床上應(yīng)用較多的丙型肝炎病毒抗體檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫分析法 (Enzyme Immunoassay，EIA)、化學(xué)發(fā)光免疫分析法（Chemi lumineseent Immunoassay， CLIA)〇
[0004] EIA的優(yōu)點(diǎn)在于其無污染、操作簡(jiǎn)單、試劑有效期長(zhǎng)、特異性好等，但由于其敏感性 相對(duì)較低，測(cè)定范圍相對(duì)較窄等缺點(diǎn)。酶免試劑盒與化學(xué)發(fā)光的丙肝抗體試劑盒大部分都 采用間接法，其特異性較差，出現(xiàn)假陽的概率較高，而雙抗原夾心法可以提高試劑盒的特異 性，但靈敏度較間接法試劑盒要低，故開發(fā)一種靈敏度和特異性都較高的雙抗原夾心法丙 型肝炎病毒抗體檢測(cè)試劑盒顯得尤為重要。
[0005] 間接法試劑盒第一步反應(yīng)是檢測(cè)樣本中的抗體與包被在微孔板上的抗原只有一 次特異性的結(jié)合，第二步是羊抗人或鼠抗人抗體與人抗-HCV抗體的結(jié)合，第二步的結(jié)合較 第一步結(jié)合特異性較差，故導(dǎo)致間接法試劑盒出現(xiàn)假陽結(jié)果的概率較高;雙抗原夾心法試 劑盒大部分采用的重組抗原的片段較短，用于標(biāo)記的重組抗原標(biāo)記上酶后抗原活性大大下 降，導(dǎo)致試劑盒靈敏度進(jìn)一步降低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題提出的一種靈敏度高、特異性好的利用雙抗 原夾心法進(jìn)行丙型肝炎病毒抗體檢測(cè)的時(shí)間分辨免疫熒光試劑盒，能夠具備和進(jìn)口發(fā)光試 劑相似的檢測(cè)靈敏度與特異性，但檢測(cè)成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于使用進(jìn)口發(fā)光試劑。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案為： 一種丙型肝炎病毒抗體時(shí)間分辨檢測(cè)試劑盒，包括包被反應(yīng)板，還包括生物素標(biāo)記HCV 重組抗原Π 與III、鑭系元素離子標(biāo)記的抗生物素抗體;所述包被反應(yīng)板為吸附有HCV重組 抗原I的微孔板。
[0008] 為了進(jìn)一步優(yōu)化上述技術(shù)方案，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施還包括： 進(jìn)一步地，上述HCV重組抗原I包含HCV病毒Core區(qū)與非結(jié)構(gòu)區(qū)NS3+NS4+NS5抗原以最大 程度地捕獲樣本中Core區(qū)與非結(jié)構(gòu)區(qū)抗原的抗體、HCV重組抗原II包含HCV Core區(qū)與非結(jié) 構(gòu)區(qū)NS3全長(zhǎng)片段，和HCV重組抗原III均包括HCV病毒結(jié)構(gòu)區(qū)核心抗原和非結(jié)構(gòu)區(qū)NS3抗原 的部分優(yōu)勢(shì)表位片段，標(biāo)記抗原采用HCV重組抗原II與HCV重組抗原III提高了試劑盒對(duì)NS3 抗體檢測(cè)的靈敏度，使得試劑盒的靈敏度接近美國(guó)Ortho公司試劑靈敏度。
[0009] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的試劑盒還包括生物素標(biāo)記HCV重組抗原稀釋液、鑭系元素離子 標(biāo)記的抗生物素抗體稀釋液、抗HCV-陽性對(duì)照和抗HCV-陰性對(duì)照;更進(jìn)一步地，本發(fā)明的試 劑盒還包括緩沖液、洗滌液、熒光增強(qiáng)液。
[0010] 優(yōu)選地，上述鑭系元素離子為EU3+、Tb3+、Sm3+、Dy 3+中的至少一種;更優(yōu)選地上述鑭 系元素離子為Eu3+。
[0011] 優(yōu)選地，上述熒光增強(qiáng)液含有β_二酮類化合物或芳香胺類化合物。
[0012] 另一方面，本發(fā)明還提供一種制備上述試劑盒的方法，包括以下步驟： a. HCV抗原包被板的獲得:將HCV重組抗原使用緩沖液稀釋至l-3yg/mL后加入微孔反 應(yīng)板內(nèi)，以l〇〇yL/孔包被過夜，然后經(jīng)洗滌、封閉、干燥，將微孔板條真空密封于鋁箱袋內(nèi)， 冷減備用； b. 生物素標(biāo)記HCV重組抗原II的獲得:將HCV重組抗原II經(jīng)磷酸鹽緩沖液透析后，按生 物素與HCV重組抗原II質(zhì)量比為1:3進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記后混勻10min，靜置2小時(shí);將標(biāo)記后的抗 原置于緩沖液中透析46-50小時(shí)進(jìn)行純化，獲得生物素標(biāo)記HCV重組抗原II;將HCV重組抗原 III經(jīng)磷酸鹽緩沖液透析后，按生物素與HCV重組抗原III質(zhì)量比為1:5進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記后混 勻10min，靜置2小時(shí);將標(biāo)記后的抗原置于緩沖液中透析46-50小時(shí)進(jìn)行純化，獲得生物素 標(biāo)記HCV重組抗原III，將生物素標(biāo)記HCV重組抗原II、生物素標(biāo)記HCV重組抗原III混合后得 生物素標(biāo)記HCV重組抗原，標(biāo)記后的重組抗原需用0.05%疏基甘油于37°C處理2小時(shí)； c. 鑭系元素離子標(biāo)記的抗生物素抗體的獲得:將抗生物素抗體經(jīng)緩沖液透析后，鑭系 元素離子與抗生物素抗體以質(zhì)量比1:3比例進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記后混勻，室溫反應(yīng)48小時(shí)；將標(biāo) 記好的抗生物素抗體用層析柱進(jìn)行分離純化，并用洗脫液進(jìn)行洗脫回收，以獲得鑭系元素 離子標(biāo)記的抗生物素抗體； d. 熒光增強(qiáng)液的配制：以無水乙醇溶解β_ΝΤΑ、Τ0Ρ0,再加入鄰苯二甲酸氫鉀和三蒸 水，40°(：溶解后，加入乙酸、1^切11乂-100，調(diào)?!1至3.2，定容后保存?zhèn)溆茫?e. 組裝各個(gè)組分，獲得丙型肝炎病毒抗體時(shí)間分辨檢測(cè)試劑盒。
[0013] 優(yōu)選地，還包括制備抗HCV-陽性對(duì)照的步驟:將抗-HCV血清用陰性對(duì)照稀釋后配 制成陽性對(duì)照，要求熒光值約30W~50W，已獲得抗HCV-陽性對(duì)照。
[0014] 優(yōu)選地，上述鑭系元素離子為Eu3+。
[0015] 本試劑盒利用固相時(shí)間分辨免疫熒光法(TRIFMA)，基于雙抗原夾心的非競(jìng)爭(zhēng)性免 疫分析。從國(guó)內(nèi)多家診斷試劑原料供應(yīng)商中篩選出抗原片段較長(zhǎng)的2-3種靈敏度高、特異性 好的重組抗原分別用于包被與標(biāo)記。所用包被抗原和標(biāo)記抗原為基因重組抗原(包括HCV病 毒結(jié)構(gòu)區(qū)核心抗原和非結(jié)構(gòu)區(qū)抗原）。對(duì)于標(biāo)記抗原標(biāo)記后抗原活性降低的問題，本發(fā)明采 用標(biāo)記長(zhǎng)臂生物素進(jìn)行標(biāo)記并對(duì)標(biāo)記工藝進(jìn)行優(yōu)化以降低對(duì)標(biāo)記抗原活性的影響。
[0016] 本發(fā)明的時(shí)間盒反應(yīng)原理為:樣本中的抗-HCV抗體(包括I gG、I gM等型）與生物素 標(biāo)記的HCV重組抗原II/III及固相HCV重組抗原I通過免疫反應(yīng)，形成"固相HCV重組抗原I 一 抗HCV-生物素標(biāo)記HCV重組抗原II/III復(fù)合物"；振蕩反應(yīng)后洗滌，洗去游離的生物素抗 原；然后加入鑭系元素離子標(biāo)記的抗生物素抗體，形成"固相HCV重組抗原I 一抗HCV -生物 素標(biāo)記HCV重組抗原II/III 一鑭系元素離子標(biāo)記的抗生物素抗體復(fù)合物"；振蕩反應(yīng)后洗 滌，洗去游離的鑭系元素離子標(biāo)記的抗生物素抗體。加入熒光增強(qiáng)液，增強(qiáng)液將復(fù)合物上的 Eu解離至溶液中，Eu與增強(qiáng)液中的組分形成熒光絡(luò)合物，其熒光強(qiáng)度與血清中的抗HCV濃度 成正相關(guān)，從而獲得檢測(cè)結(jié)果。
[0017] 本發(fā)明的一種丙型肝炎病毒抗體時(shí)間分辨檢測(cè)試劑盒，選用特定重組抗原用于包 被和標(biāo)記，特定地使用兩種標(biāo)記抗原提高了試劑盒的靈敏度，并對(duì)標(biāo)記用生物素種類及標(biāo) 記工藝做了系統(tǒng)性的優(yōu)化，同時(shí)改變傳統(tǒng)的生物素-鏈霉親和素放大系統(tǒng)為生物素-抗生物 素體系使得試劑盒的靈敏度進(jìn)一步提升，不但靈敏度高、特異性好，同時(shí)相較進(jìn)口發(fā)光試 劑，檢測(cè)成本大大降低；同時(shí)相較進(jìn)口發(fā)光試劑，檢測(cè)成本大大降低。
【附圖說明】
[0018] 圖1為利用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行HCV抗體檢測(cè)的檢測(cè)原理示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 本發(fā)明提供了一種丙型肝炎病毒抗體時(shí)間分辨檢測(cè)試劑盒，包括包被反應(yīng)板，還 包括生物素標(biāo)記HCV重組抗原II、III、鑭系元素離子標(biāo)記的抗生物素抗體;所述包被反應(yīng)板 為吸附有HCV重組抗原I的微孔板。
[0020] 下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)和具體的介紹，以使更好的理解本發(fā)明， 但是下述實(shí)施例并不限制本發(fā)明范圍。
[0021 ]實(shí)施例1丙型肝炎病毒抗體時(shí)間分辨檢測(cè)試劑盒的制備 使用Eu3+作為熒光標(biāo)記物制備試劑盒，具體操作如下： 1. HCV抗原包被板的獲得： 將HCV基因重組抗原以合適的比例，使用碳酸鹽緩沖液稀釋至l-3yg/mL后加入微孔反 應(yīng)板內(nèi)，1〇〇此/孔，包被過夜后經(jīng)洗滌、封閉、干燥等程序，將微孔板條真空密封于鋁箱袋 內(nèi)，冷減備用。
[0022] 2.生物素標(biāo)記HCV抗原的獲得:將HCV標(biāo)記抗原II、HCV標(biāo)記抗原III經(jīng)磷酸鹽緩沖 液透析后，按該比例(生物素與標(biāo)記抗原1質(zhì)量比為1:3;生物素與標(biāo)記抗原2質(zhì)量比為1:5 ) 分別單獨(dú)進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記后混勻lOmin，靜置約2小時(shí)。將標(biāo)記后的抗原置于磷酸鹽緩沖液中 透析48小時(shí)（± 2小時(shí))進(jìn)行純化，獲得生物標(biāo)記HCV抗原。
[0023] 3.抗生物素抗體銪標(biāo)記物的獲得:將抗生物素抗體經(jīng)碳酸鹽緩沖液透析后，銪與 抗生物素抗體質(zhì)量比為1:3比例進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記后混勻，室溫反應(yīng)48小時(shí)± 2小時(shí)。將標(biāo)記好 的抗生物素抗體用層析柱進(jìn)行分離純化，并用洗脫液進(jìn)行洗脫回收，以獲得抗生物素抗體 銪標(biāo)記物。
[0024] 4.熒光增強(qiáng)液的配制：以無水乙醇溶解β-ΝΤΑ、Τ0Ρ0,再加入鄰苯二甲酸氫鉀和三 蒸水，40 °C溶解后，加入乙酸、Triton Χ-100，調(diào)ΡΗ至3 · 2，定容。
[0025] 5.抗HCV-陽性對(duì)照的獲得:將抗-HCV血清用陰性對(duì)照稀釋后配制成陽性對(duì)照，要 求熒光值約30W~50W，已獲得抗HCV-陽性對(duì)照。
[0026] 上述組分制備完畢后，加入緩沖液、洗滌液等其他試劑盒組分，制備得到丙型肝炎 病毒抗體時(shí)間分辨免疫熒光檢測(cè)試劑盒。
[0027]實(shí)施例2本發(fā)明的試劑盒與進(jìn)口發(fā)光試劑盒的比較實(shí)驗(yàn) 利用本發(fā)明的丙型肝炎病毒抗體檢測(cè)試劑盒（時(shí)間分辨免疫熒光法）與德國(guó)Roche Diagnostics GmbH公司的丙型肝炎病毒抗體檢測(cè)試劑盒（電化學(xué)發(fā)光法)Anti-HCV II同時(shí) 檢測(cè)1073例血清樣本，包括HCV陽性血清樣本422例，HCV陰性血清樣本651例(含60例干擾樣 本，干擾因素有CMV / Rubella / ANA / HBsAg / RF / HSV / TP / HCG)。另外檢測(cè)了422 例陽性血清樣本中111例對(duì)應(yīng)的同源血漿樣本、651例陰性血清樣本中115例對(duì)應(yīng)的同源血 漿樣本，BBI/Zepto血清轉(zhuǎn)換盤樣本12例。若樣本初測(cè)結(jié)果不一致，則用兩種檢測(cè)試劑盒再 檢測(cè)一遍 檢測(cè)結(jié)果顯示:有18例樣本的檢測(cè)結(jié)果不一致。以電化學(xué)發(fā)光法的檢測(cè)結(jié)果為參考，則 時(shí)間分辨免疫熒光法的靈敏度達(dá)到95.7%，特異性達(dá)到100%，符合率達(dá)到98.3%(表1)。
[0028]特異性的比較 對(duì)上述18份初測(cè)結(jié)果不一致的樣本用確認(rèn)試劑盒(丙型肝炎病毒(HCV)抗體檢測(cè)試劑 盒(免疫印跡法)）進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示其中16份樣本為陰性，2份為陽性，證明本發(fā)明的丙型 肝炎病毒抗體檢測(cè)試劑盒(時(shí)間分辨免疫熒光法)在特異性方面優(yōu)于現(xiàn)行電化學(xué)發(fā)光法試 劑盒。
[0029]靈敏度的比較 同時(shí)用兩種試劑盒檢測(cè)12份BBI/Zepto血清轉(zhuǎn)換盤，根據(jù)檢出數(shù)比較兩種檢測(cè)方法的 靈敏度。
[0030] 12份BBI/Zepto血清轉(zhuǎn)換盤中，血清盤編號(hào)分別為PHV922-03和PHV922-04的樣本 電化學(xué)發(fā)光試劑未能檢出。使用確認(rèn)試劑盒(丙型肝炎病毒(HCV)抗體檢測(cè)試劑盒(免疫印 跡法)）進(jìn)行復(fù)檢，結(jié)果均為陽性，證明本發(fā)明的丙型肝炎病毒抗體檢測(cè)試劑盒(時(shí)間分辨免 疫熒光法)在靈敏度方面優(yōu)于現(xiàn)行電化學(xué)發(fā)光法試劑盒。
[0031] 通過上述實(shí)施例可以知曉，本發(fā)明的一種丙型肝炎病毒抗體時(shí)間分辨免疫熒光檢 測(cè)試劑盒，選用特定重組抗原用于包被和標(biāo)記，對(duì)封閉工藝進(jìn)行了優(yōu)化提高了試劑盒的特 異性，對(duì)標(biāo)記用生物素種類及標(biāo)記工藝做了系統(tǒng)性的優(yōu)化使得試劑盒的靈敏度進(jìn)一步提 升，不但靈敏度高、特異性好，同時(shí)相較進(jìn)□發(fā)光試劑，檢測(cè)成本大大降低。
[0032] 以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限 制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和 替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和 修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種丙型肝炎病毒抗體時(shí)間分辨檢測(cè)試劑盒，包括包被反應(yīng)板，其特征在于，還包括 生物素標(biāo)記HCV重組抗原II與III、鑭系元素離子標(biāo)記的抗生物素抗體;所述包被反應(yīng)板為 吸附有HCV重組抗原I的微孔板。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述HCV重組抗原I和HCV重組抗原II、 III均包括HCV病毒結(jié)構(gòu)區(qū)核心抗原和非結(jié)構(gòu)區(qū)抗原。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，還包括生物素標(biāo)記HCV重組抗原稀釋液、 鑭系元素離子標(biāo)記的抗生物素抗體稀釋液、抗HCV-陽性對(duì)照和抗HCV-陰性對(duì)照。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，還包括緩沖液、洗滌液、熒光增強(qiáng)液。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述鑭系元素離子為Eu3+、 Tb3+、Sm3+、Dy3+中的至少一種。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述鑭系元素離子為Eu3+。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述熒光增強(qiáng)液含有β-二 酮類化合物或芳香胺類化合物。8. -種制備如權(quán)利要求1所述的試劑盒的方法，其特征在于，包括以下步驟： 步驟1 :HCV抗原包被板的獲得 將HCV重組抗原使用緩沖液稀釋至l-3yg/mL后加入微孔反應(yīng)板內(nèi)，以lOOyL/孔包被過 夜，然后經(jīng)洗滌、封閉、干燥，將微孔板條真空密封于鋁箱袋內(nèi)，冷藏備用； 步驟2:生物素標(biāo)記HCV重組抗原II、III的獲得 將HCV重組抗原II經(jīng)磷酸鹽緩沖液透析后，按生物素與HCV重組抗原II、III分別進(jìn)行標(biāo) 記，標(biāo)記后混勻lOmin，靜置2小時(shí);將標(biāo)記后的抗原置于緩沖液中透析進(jìn)行純化，獲得生物 素標(biāo)記HCV重組抗原II; 步驟3:鑭系元素離子標(biāo)記的抗生物素抗體的獲得 將抗生物素抗體經(jīng)緩沖液透析后，鑭系元素離子與抗生物素抗體以質(zhì)量比1:3比例進(jìn) 行標(biāo)記，標(biāo)記后混勻，室溫反應(yīng)48小時(shí)；將標(biāo)記好的抗生物素抗體用層析柱進(jìn)行分離純化， 并用洗脫液進(jìn)行洗脫回收，以獲得鑭系元素離子標(biāo)記的抗生物素抗體； 步驟4:熒光增強(qiáng)液的配制 以無水乙醇溶解β-ΝΤΑ、Τ0Ρ0，再加入鄰苯二甲酸氫鉀和三蒸水，40 °C溶解后，加入乙酸 和Triton X-100，調(diào)節(jié)PH值至3 · 2，定容后保存?zhèn)溆茫? 步驟5:組裝各個(gè)組分，獲得丙型肝炎病毒抗體時(shí)間分辨檢測(cè)試劑盒。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述鑭系元素離子為Eu3+。10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的步驟2中生物素與HCV重組抗原II、 III分別按重量比為1:3和1:5進(jìn)行標(biāo)記;標(biāo)記后的抗原置于緩沖液中透析46-50個(gè)小時(shí)。
【文檔編號(hào)】G01N33/569GK105974115SQ201610531653
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年7月7日
【發(fā)明人】戶元林, 張正元
【申請(qǐng)人】蘇州新波生物技術(shù)有限公司