基于膠乳免疫比濁法的IgA試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基于膠乳免疫比濁法的IgA試劑盒，其包括：試劑A，所述試劑A為pH＝8.0～9.4的甘氨酸緩沖體系，含有0.1～0.5g/L的高分子促聚劑、1～10g/L的表面活性劑和0.5～10g/L的電解質(zhì)；以及試劑B，所述試劑B為pH＝6.5～7.3的MES緩沖體系，含有2.5～3g/L的羊抗人IgA多克隆抗體、5～10mL/L的羊抗人IgA多克隆抗體包被的膠乳、1～10g/L的表面活性劑和0.5～10g/L的電解質(zhì)。本發(fā)明還公開(kāi)了制備試劑B的方法。所述試劑盒可用于人IgA的測(cè)定，可有效避免非特異性反應(yīng)，檢測(cè)靈敏度較高，且具有較低的檢測(cè)限。
【專利說(shuō)明】
基于膠乳免疫比濁法的IgA試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于膠乳免疫比濁法的IgA試劑盒 及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 免疫球蛋白A(IgA)按免疫功能可分為血清型和分泌型兩種，血清型IgA存在于血 清中，可介導(dǎo)調(diào)理吞噬ADCC作用，其含量占總IgA的85 %左右。分泌型IgA存在于分泌液中， 如唾液、淚液、初乳、鼻和支氣管分泌液、胃腸液、尿液、汗液等，機(jī)體粘膜局部抗感染免疫的 主要抗體，它能抑制微生物在呼吸道上皮附著，減緩病毒繁殖，是粘膜重要屏障，對(duì)某些病 毒、細(xì)菌和一般抗原具有抗體活性，是防止病原體入侵機(jī)體的第一道防線。已有研究證明， 呼吸道分泌液中IgA含量的高低直接影響呼吸道粘膜對(duì)病原體的抵抗力，兩者呈正相關(guān)。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)IgA的方法主要有免疫比濁法和放射免疫擴(kuò)散法等，其中免疫比 濁法是抗原抗體結(jié)合動(dòng)態(tài)測(cè)定方法，操作相對(duì)簡(jiǎn)單、成本低，在生化分析儀上使用較為廣 泛。免疫比濁法可分為免疫透射比濁法和免疫散射比濁法。其基本原理是：當(dāng)抗原與抗體在 特殊稀釋系統(tǒng)中反應(yīng)而且比例合適(一般抗體過(guò)量)時(shí)，形成的可溶性免疫復(fù)合物在稀釋系 統(tǒng)中在高分子促聚劑(聚乙二醇等）的作用下聚合析出直徑為340nm~700nm的顆粒，使反應(yīng) 液出現(xiàn)濁度。當(dāng)抗體濃度固定時(shí)，形成的免疫復(fù)合物的量隨著檢樣中抗原量的增加而增加， 反應(yīng)液的濁度也隨之增加。當(dāng)入射光照射不同濁度的反應(yīng)液時(shí)可被不同程度的吸收、反射 和折射，通過(guò)測(cè)定反應(yīng)液的濁度與一系列標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，即可得出檢樣中抗原的含量。在普通 的免疫透射比濁法或免疫散射比濁法中，少量的小的抗原抗體復(fù)合物極難形成濁度，除非 放置較長(zhǎng)時(shí)間，但檢測(cè)的靈敏度會(huì)較低，而加大抗體抗原的用量又會(huì)增加檢測(cè)成本，而且不 符合微量化的要求?；诖?，現(xiàn)有技術(shù)中公開(kāi)有膠乳增強(qiáng)免疫比濁法即膠乳免疫比濁法，其 原理是將與待測(cè)物質(zhì)相對(duì)應(yīng)的抗體包被在一定直徑的膠乳顆粒上，使抗原抗體結(jié)合物的體 積增大，光通過(guò)之后，透射光和散射光的強(qiáng)度變化更為顯著，從而提高試驗(yàn)的靈敏度。
[0004] 但是在膠乳免疫比濁法中，添加的高分子促聚劑雖然可以使抗體更容易結(jié)合抗 原，但是同時(shí)也會(huì)使抗體結(jié)合其他物質(zhì)，導(dǎo)致非特異性增強(qiáng);而且活化膠乳亦使得抗體本身 的反應(yīng)性顯著增加，增多超量的高分子促聚劑，會(huì)使更多的膠乳聚集，進(jìn)一步促進(jìn)非特異性 反應(yīng)，結(jié)果容易導(dǎo)致聚集的膠乳顆粒粒徑不均勻，反應(yīng)重現(xiàn)性低，檢測(cè)時(shí)的特征波長(zhǎng)不固 定。而在臨床使用過(guò)程中，參數(shù)都是固定的，特征波長(zhǎng)的變動(dòng)使得該技術(shù)在實(shí)際臨床應(yīng)用中 有一定局限性，現(xiàn)有的測(cè)定IgA的膠乳免疫比濁法用的試劑盒的檢測(cè)限較高，對(duì)低濃度的樣 本的檢測(cè)效果不理想。另外，現(xiàn)有的膠乳免疫比濁法所用的膠乳在制備過(guò)程中需要分離過(guò) 量的EDC、NHS等活化試劑，而且需要進(jìn)行封閉處理，操作上較為繁瑣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 因此，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中測(cè)定IgA的試劑盒的容易產(chǎn)生非特異性反應(yīng)，對(duì)低濃度的樣 本的檢測(cè)效果不理想的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種可以降低非特異性反應(yīng)、檢 測(cè)靈敏度高、檢測(cè)限低的基于膠乳免疫比濁法的IgA試劑盒。
[0006] 本發(fā)明的基于膠乳免疫比濁法的IgA試劑盒包括：
[0007] 試劑A，所述試劑A為pH = 8.0~9.4的甘氨酸緩沖體系，含有0.1~0.5g/L的高分子 促聚劑、1~l〇g/L的表面活性劑和0.5~10g/L的電解質(zhì)；
[0008] 以及試劑B，所述試劑B為pH = 6.5~7.3的MES緩沖體系，含有2.5~3g/L的羊抗人 IgA多克隆抗體、5~10mL/L的羊抗人IgA多克隆抗體包被的膠乳、1~10g/L的表面活性劑和 0.5~10g/L的電解質(zhì)。
[0009] 所述膠乳為pH = 6.5~7.3的MES緩沖體系，是粒徑為30~80nm優(yōu)選40~50nm的羧 基微球經(jīng)NHS(N-羥基丁二酰亞胺)和EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽） 活化后再由羊抗人IgA多克隆抗體包被得到的乳膠;所述膠乳中，羧基微球的濃度為1~2g/ L優(yōu)選lg/L，NHS與羧基微球的質(zhì)量比為0.05~0.1:1，EDC與羧基微球的質(zhì)量比為0.05~ 〇. 1:1，包被用的羊抗人IgA多克隆抗體與羧基微球的質(zhì)量比為0.05~0.1:1。
[0010] 優(yōu)選的，所述試劑A和所述試劑B分別還含有0.5~lg/L的防腐劑，所述防腐劑為 proclin300和/或疊氮鈉。
[0011] 優(yōu)選的，所述試劑A中的高分子促聚劑為聚乙二醇6000,聚乙二醇6000在所述試劑 A中的濃度為0.2~0.5g/L;所述試劑A和所述試劑B中的表面活性劑均為曲拉通X100;所述 試劑A和所述試劑B中的電解質(zhì)均為氯化鈉。
[0012]本發(fā)明的一較佳實(shí)施例的所述試劑A為pH = 8.6的100mmol/L甘氨酸緩沖體系，含 有0.5g/L的聚乙二醇6000、18/1的曲拉通乂100、58/1的氯化鈉和18/1的疊氮鈉。
[0013]本發(fā)明的一較佳實(shí)施例的所述試劑B為pH = 6.8的50mmol/L MES緩沖體系，含有 2.8g/L的羊抗人IgA多克隆抗體、5mL/L的羊抗人IgA多克隆抗體包被的膠乳、lg/L的曲拉通 X100、5g/L的氯化鈉和lg/L的疊氮鈉。
[0014]本發(fā)明另一目的還在于公開(kāi)一種制備試劑B的方法，所述試劑B為pH = 6.5~7.3的 MES緩沖體系，含有2.5~3g/L的羊抗人IgA多克隆抗體、5~10mL/L的羊抗人IgA多克隆抗體 包被的膠乳、1~l〇g/L的表面活性劑和0.5~10g/L的電解質(zhì)；
[0015]該方法包括如下步驟：
[0016] l)用pH = 6·5~7·3的MES緩沖液將羧基微球稀釋至l~2g/L，再加入NHS和EDC，15 ~25 °C下反應(yīng)20~30分鐘得到活化膠乳；
[0017] 2)向活化膠乳中加入包被用的羊抗人IgA多克隆抗體，在25~37°C下振搖孵育2~ 4小時(shí)，制得羊抗人IgA多克隆抗體包被的膠乳；
[0018] 3)根據(jù)所述試劑B的各組分濃度，向pH = 6.5~7.3的MES緩沖液中加入表面活性 劑、電解質(zhì)和羊抗人IgA多克隆抗體，然后加入步驟2)制得的羊抗人IgA多克隆抗體包被的 膠乳；
[0019] 4)用0.2yL尼龍膜過(guò)濾除菌和大顆粒，得試劑B。
[0020] 步驟1)中的羧基微球粒徑為30~80nm優(yōu)選40~50nm;NHS與羧基微球的質(zhì)量比為 0.05~0.1:1，EDC與羧基微球的質(zhì)量比為0.05~0.1:1;步驟2)中，包被用的羊抗人IgA多克 隆抗體與羧基微球的質(zhì)量比為〇. 05~0.1:1。
[0021] 步驟2)和步驟3)中加入的羊抗人IgA多克隆抗體預(yù)先用pH = 6.5~7.3的MES緩沖 液稀釋至20~30g/L。
[0022] 步驟3)中，還添加有防腐劑pr〇Clin300和/或疊氮鈉，所述防腐劑添加濃度為0.5 ~lg/L〇
[0023] 本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)及積極進(jìn)步效果在于：
[0024] 1、本發(fā)明的一關(guān)鍵技術(shù)是試劑B中控制羊抗人IgA多克隆抗體與活化膠乳中的羧 基微球的質(zhì)量比例為200~400:1，同時(shí)羧基微球的粒徑為30~80nm尤其是40~50nm，使少 量包被用抗體與羧基微球結(jié)合，這樣便形成了普通抗體和攜帶羧基微球的包被抗體的混合 體，而且通過(guò)0.2yL膜過(guò)濾去除聚集的微球。當(dāng)加入抗原時(shí)，抗原就會(huì)按照比例與這兩種抗 體結(jié)合，聚集形成的顆粒物就會(huì)包含1個(gè)或幾個(gè)羧基微球，反應(yīng)的性能大大增加，盡可能避 免非特異性反應(yīng)。
[0025] 2、本發(fā)明另一關(guān)鍵技術(shù)是高分子促聚劑的用量，濃度為0.1~0.5g/L。本發(fā)明由于 加入了含有羧基微球的活化膠乳，抗體的反應(yīng)性顯著增加，但是若按現(xiàn)有技術(shù)中為促進(jìn)免 疫復(fù)合物聚集而添加過(guò)量的高分子促聚劑，反倒會(huì)使更多的羧基微球聚集，產(chǎn)生非特異性 反應(yīng)。本發(fā)明試圖調(diào)整高分子促聚劑的用量以盡可能的避免非特異性反應(yīng)，由于含有活化 的羧基微球，反應(yīng)本身具有一定的靈敏度，所以考慮較少的高分子促聚劑是否就能具有較 好的促聚作用。實(shí)驗(yàn)的實(shí)際結(jié)果也確實(shí)如此，當(dāng)高分子促聚劑的用量降低至濃度為0.1~ 0.5g/L時(shí)可達(dá)到較佳的效果。
[0026] 3、本發(fā)明還有一關(guān)鍵技術(shù)涉及所述試劑B的制備過(guò)程，首先膠乳中的羧基微球經(jīng) NHS、EDC活化后與包被用的羊抗人IgA多克隆抗體混合孵育，然后與其余組分混合，配制成 試劑B。與傳統(tǒng)的膠乳制備過(guò)程相比，控制NHS、EDC以及包被用的羊抗人IgA多克隆抗體的用 量，可避免NHS、EDC與活化羧基微球分離過(guò)程，以及活化羧基微球封閉過(guò)程，因此操作上更 加簡(jiǎn)化。
[0027] 綜上，本發(fā)明的所述試劑盒可用于全自動(dòng)生化分析儀上檢測(cè)人血清IgA的含量，與 現(xiàn)有的免疫比濁試劑相比，可有效避免非特異性反應(yīng)，特征吸收波長(zhǎng)穩(wěn)定，可提高反應(yīng)靈敏 度，檢測(cè)限較低，可用于較低濃度樣本的檢測(cè)，而且與傳統(tǒng)的膠乳制備過(guò)程相比，本發(fā)明免 去了較多的液固分離和封閉過(guò)程，操作上更加簡(jiǎn)化。
【附圖說(shuō)明】
[0028] 圖1為IgA標(biāo)準(zhǔn)血清樣本的濃度及Δ A值的對(duì)應(yīng)散點(diǎn)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 實(shí)施例1~3試劑盒及其制備
[0030] 試劑盒可用于膠乳免疫比濁法測(cè)定IgA，包括試劑A和試劑B。
[0031]試劑A的組分如表1所示。
[0032] 表1試劑A的組分
[0033]
[0034]
[0035] 試劑A的配制步驟為(配制1L):分別按照表1中實(shí)施例1~3的組分濃度，取甘氨酸 (7.5g，100mmol)溶于純化水（1L)中，然后加入對(duì)應(yīng)量的氯化鈉、曲拉通X100、聚乙二醇6000 和疊氮鈉，混勻并用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH得到試劑A。
[0036] (2)試劑B的組分如表2所示。
[0037] 表2試劑B的組分
[0038]
[0039]表2中的膠乳為含有l(wèi)g/L的羧基微球的MES緩沖體系，膠乳中的羧基微球經(jīng)NHS和 EDC活化并由羊抗人IgA多克隆抗體包被，實(shí)施例1~3的膠乳中的NHS、EDC和羊抗人IgA多克 隆抗體與羧基微球質(zhì)量比如表3所示。
[0040] 表3膠乳中的各組分與羧基微球的質(zhì)量比
[0041]
[0042] 試劑B的配制步驟為(配制1L):
[0043] 1)取100yL固體含量為 10g/100mL的駿基微球（由Bangs laboratories，Inc提供）， 用MES緩沖液(50mmol/L，pH=6.8,下同）稀釋至10mL，然后加入表3所示比例對(duì)應(yīng)量的NHS和 H)C，室溫反應(yīng)20分鐘得到活化膠乳。
[0044] 2)向活化膠乳中加入表3所示比例對(duì)應(yīng)體積的含30g/L羊抗人IgA多克隆抗體的 MES緩沖液，然后在37°C下振搖孵育2小時(shí)制得羊抗人IgA多克隆抗體包被的膠乳，即表2中 所述的膠乳。
[0045] 3)向500mL的MES緩沖液中加入表2所示比例對(duì)應(yīng)量的氯化鈉、曲拉通X100、疊氮鈉 和表2所示比例對(duì)應(yīng)體積的含30g/L羊抗人IgA多克隆抗體的MES緩沖液，然后加入步驟2)制 得的羊抗人IgA多克隆抗體包被的10mL膠乳，并用MES緩沖液補(bǔ)足至1L。
[0046] 4)混勻后用0.22yL的尼龍膜過(guò)濾，除菌和除大顆粒得到試劑B。
[0047]效果實(shí)施例1
[0048] 效果測(cè)試試劑盒:實(shí)施例1~3的試劑盒、對(duì)比例的IgA試劑盒（由英國(guó)RAND0X公司 生產(chǎn)）。
[0049]儀器：日立7170生化分析儀。
[0050] 測(cè)試波長(zhǎng)：主波長(zhǎng)340nm，副波長(zhǎng)700nm〇
[0051 ]測(cè)試方法:終點(diǎn)法，遞增性反應(yīng)。37°C條件下，首先試劑A與IgA的血清樣本混勻3~ 5分鐘，然后加入試劑B開(kāi)始反應(yīng)，其中體積比試劑A:試劑B:樣本=200:40:2; 5分鐘時(shí)比照 空白測(cè)定初始吸光度A1，然后在10分鐘時(shí)比照空白測(cè)定吸光度A2，計(jì)算A2與A1的差值Δ A。 [0052] 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定
[0053]以實(shí)施例1~3和對(duì)比例的試劑盒分別逐一測(cè)定如表4所示的一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度的 IgM的標(biāo)準(zhǔn)血清樣本的ΔΑ值，而根據(jù)一系列IgM的濃度和測(cè)得的ΔΑ值可分別擬合出各試劑 盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線為L(zhǎng)OG IT-LOG 4P函數(shù)。
[0054] IgM的濃度與測(cè)得的△ A值的對(duì)應(yīng)的散點(diǎn)圖如圖1所示，由圖1可知，實(shí)施例1~3相 比于對(duì)比例，在相同的條件下，吸光度變化更加明顯，靈敏度更高。
[0055] 表4標(biāo)準(zhǔn)血清樣本的Δ A值測(cè)試結(jié)果
[0056]
[0057]
[0058] 2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢測(cè)效果
[0059] 以實(shí)施例1~3和對(duì)比例的試劑盒分別測(cè)定的表5所示一系列含有已知濃度IgA的 血清樣本的A A值，然后在擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線上分別得出對(duì)應(yīng)的測(cè)定濃度，該測(cè)定濃度和實(shí)際 濃度會(huì)出現(xiàn)偏差，如表5所示。
[0060] 表5測(cè)定結(jié)果對(duì)比
[0061]
[0062]臨床準(zhǔn)確度要求偏差不超過(guò)10 %。通過(guò)表5可知，對(duì)比例的試劑盒在檢測(cè)0.22g/L 的樣本時(shí)偏差就超過(guò)了臨床要求的10%，其檢測(cè)限只能是〇.44g/L。而本發(fā)明的試劑盒在檢 測(cè)0.11g/L樣本所得結(jié)果與實(shí)際濃度偏差在10%以內(nèi)，符合臨床準(zhǔn)確度要求，因此最低檢測(cè) 限可以達(dá)到0. llg/L。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于膠乳免疫比濁法的IgA試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括： 試劑A，所述試劑A為pH = 8.0~9.4的甘氨酸緩沖體系，含有0.1~0.5g/L的高分子促聚 劑、1~10g/L的表面活性劑和0.5~10g/L的電解質(zhì)； 以及試劑B，所述試劑B為pH=6.5~7.3的MES緩沖體系，含有2.5~3g/L的羊抗人IgA多 克隆抗體、5~10mL/L的羊抗人IgA多克隆抗體包被的膠乳、1~10g/L的表面活性劑和0.5~ l〇g/L的電解質(zhì)。2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述膠乳為pH=6.5~7.3的MES緩沖體系， 是粒徑為30~80nm優(yōu)選40~50nm的羧基微球經(jīng)NHS和EDC活化后再由羊抗人IgA多克隆抗體 包被得到的膠乳;所述膠乳中，羧基微球的濃度為1~2g/L優(yōu)選lg/L，NHS與羧基微球的質(zhì)量 比為0.05~0.1:1，EDC與羧基微球的質(zhì)量比為0.05~0.1:1，包被用的羊抗人IgA多克隆抗 體與羧基微球的質(zhì)量比為0.05~0.1:1。3. 如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑A和所述試劑B分別還含有0.5 ~lg/L的防腐劑，所述防腐劑為proclin300和/或疊氮鈉。4. 如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑A中的高分子促聚劑為聚乙二醇 6000，聚乙二醇6000在所述試劑A中的濃度為0.2~0.5g/L;所述試劑A和所述試劑B中的表 面活性劑均為曲拉通X100;所述試劑A和所述試劑B中的電解質(zhì)均為氯化鈉。5. 如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑A為pH = 8.6的100mmol/L甘氨酸 緩沖體系，含有〇.5g/L的聚乙二醇6000、lg//L的曲拉通X100、5 g//L的氯化鈉和lg/L的疊氮 鈉。6. 如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑B為pH = 6.8的50mmol/L MES緩沖 體系，含有2.8g/L的羊抗人IgA多克隆抗體、5mL/L的羊抗人IgA多克隆抗體包被的膠乳、lg/ L的曲拉通X100、5g/L的氯化鈉和lg/L的疊氮鈉。7. -種制備試劑B的方法，其特征在于，所述試劑B為pH = 6.5~7.3的MES緩沖體系，含 有2.5~3g/L的羊抗人IgA多克隆抗體、5~10mL/L的羊抗人IgA多克隆抗體包被的膠乳、1~ l〇g/L的表面活性劑和0.5~10g/L的電解質(zhì)； 該方法包括如下步驟： 1) 用pH = 6·5~7·3的MES緩沖液將羧基微球稀釋至l~2g/L，再加入NHS和EDC，15~25 °C下反應(yīng)20~30分鐘得到活化膠乳； 2) 向活化膠乳中加入包被用的羊抗人IgA多克隆抗體，在25~37°C下振搖孵育2~4小 時(shí)，制得羊抗人IgA多克隆抗體包被的膠乳； 3) 根據(jù)所述試劑B的各組分濃度，向pH = 6.5~7.3的MES緩沖液中加入表面活性劑、電 解質(zhì)和羊抗人IgA多克隆抗體，然后加入步驟2)制得的羊抗人IgA多克隆抗體包被的膠乳； 4) 用0.2yL尼龍膜過(guò)濾除菌和大顆粒，得試劑B。8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟1)中的羧基微球粒徑為30~80nm優(yōu)選40 ~50nm;NHS與羧基微球的質(zhì)量比為0.05~0.1:1，EDC與羧基微球的質(zhì)量比為0.05~0.1:1; 步驟2)中，包被用的羊抗人IgA多克隆抗體與羧基微球的質(zhì)量比為0.05~0.1:1。9. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟2)和步驟3)中加入的羊抗人IgA多克隆 抗體預(yù)先用pH=6.5~7.3的MES緩沖液稀釋至20~30g/L。10. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟3)中，還添加有防腐劑proclin300和/
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK105974130SQ201610431412
【公開(kāi)日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年6月17日
【發(fā)明人】王軍峰, 馮松, 孟菲
【申請(qǐng)人】上海執(zhí)誠(chéng)生物科技有限公司