c-Kit作為藥物成癮治療靶點(diǎn)的應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了c?Kit的新用途。本發(fā)明提供了c?Kit作為藥物靶標(biāo)在篩選治療藥物成癮的藥物中的應(yīng)用以及在篩選治療成癮藥物物質(zhì)依賴的成癮心理渴求和興奮性的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明采用經(jīng)典評(píng)價(jià)成癮的大鼠敏化和條件位置偏愛(ài)動(dòng)物模型，分別觀察c?Kit的抑制劑伊馬替尼對(duì)大鼠的敏化行為表達(dá)和條件位置偏愛(ài)形成戒斷后復(fù)燃行為的影響，評(píng)價(jià)伊馬替尼對(duì)嗎啡成癮的抑制作用及嗎啡成癮戒斷后的防復(fù)吸效果，確定其作用靶點(diǎn)c?Kit受體在作為藥物成癮的戒毒治療靶點(diǎn)中的應(yīng)用。本發(fā)明效果好，有望從根本上治療藥物成癮。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
c-K i t作為藥物成癮治療靶點(diǎn)的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及C-Kit作為藥物靶標(biāo)在篩選治療藥物成癮藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]藥物濫用(drug abuse)或成癮(drug addict1n)已成為世界性的醫(yī)學(xué)和社會(huì)學(xué)問(wèn)題，毒品不僅會(huì)嚴(yán)重危害人類(lèi)健康，還帶來(lái)了一系列經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和政治問(wèn)題。根據(jù)聯(lián)合國(guó)毒品和犯罪問(wèn)題辦公室2013世界毒品報(bào)告，2011年國(guó)際藥物濫用人口占全球成年人總數(shù)的
0.3%?0.9%，而我國(guó)登記在冊(cè)的吸毒人數(shù)為247.5萬(wàn)。近年來(lái)，外源性阿片類(lèi)物質(zhì)(如嗎啡、海洛因)濫用已成為日益嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題。它不僅嚴(yán)重摧殘濫用者本人的身心健康，同時(shí)也給家庭、社會(huì)帶來(lái)災(zāi)難性后果。因?yàn)榘⑵?lèi)物質(zhì)一旦濫用成癮，戒斷極其困難。且據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)藥物濫用的復(fù)吸率高達(dá)95%以上。
[0003]藥物成癮是一種以失去控制能力和強(qiáng)迫性用藥為主要特征的慢性復(fù)發(fā)性腦疾病，其形成機(jī)制尚不明確(Nestler，2004)。目前，對(duì)吸毒者進(jìn)行戒毒治療主要包括自然戒斷法、替代療法(nicotine replacement therapy，NRT)和對(duì)癥治療。各種療法均能取得一定的效果，但對(duì)成癮的心理渴求的治療效果不佳。成癮機(jī)制的不明，戒毒的有效靶標(biāo)有限，尋求戒毒新靶點(diǎn)對(duì)于藥物成癮心理渴求的治療迫在眉睫。
[0004]c-Kit基因位于人染色體4ql2_13，屬于原癌基因，其產(chǎn)物是ΙΠ型酪氨酸激酶。C-Kit作為酪氨酸激酶受體蛋白家族的重要成員之一，其與干細(xì)胞因子(SCF)結(jié)合作為重要的受體配基復(fù)合物通過(guò)激活下游信號(hào)分子復(fù)合物，產(chǎn)生強(qiáng)大的連鎖反應(yīng)，從而在細(xì)胞分化增殖等調(diào)控中發(fā)揮著舉足輕重的作用。迄今為止，二聚化結(jié)構(gòu)及磷脂酰肌醇3’-激酶(PI3K)、JAK-STAT等十幾條激酶介導(dǎo)的信號(hào)通路被陸續(xù)證實(shí)與c-kit的活化密切相關(guān)，而針對(duì)抑制c-Kit活化設(shè)計(jì)的革E向藥物也陸續(xù)投入應(yīng)用，與特異性的單克隆抗體一起在臨床相關(guān)腫瘤的診斷及治療等方面起到了關(guān)鍵性的作用。c-Kit在70%小細(xì)胞肺癌和GIST患者體內(nèi)表達(dá)。至今為止，c-Kit是否在成癮中起著重要作用以及是否可以作為戒毒藥物作用的靶標(biāo)未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供C-Kit作為藥物靶標(biāo)在篩選治療藥物成癮的藥物中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供C-Kit作為藥物靶標(biāo)在篩選治療成癮藥物物質(zhì)依賴的成癮心理渴求和興奮性的藥物中的應(yīng)用。
[0007]伊馬替尼(imatinib)是酪氨酸激酶抑制劑，該藥由瑞典諾華(Novartis)公司開(kāi)發(fā)，對(duì)c-Kit具有抑制作用，本發(fā)明經(jīng)灌胃給予實(shí)驗(yàn)大鼠伊馬替尼(0，100mg/kg)或中樞神經(jīng)系統(tǒng)核團(tuán)定位給予后，皮下注射10mg/kg嗎啡，采用經(jīng)典評(píng)價(jià)成癮的大鼠敏化和條件位置偏愛(ài)動(dòng)物模型，分別觀察伊馬替尼對(duì)大鼠的敏化行為表達(dá)和條件位置偏愛(ài)形成戒斷后復(fù)燃行為的影響，評(píng)價(jià)伊馬替尼對(duì)嗎啡成癮的抑制作用及嗎啡成癮戒斷后的防復(fù)吸效果；通過(guò)western-blot確定其作用革E點(diǎn)c-Kit在伊馬替尼中樞神經(jīng)系統(tǒng)核團(tuán)定位給予后的活性變化，觀察C-Kit作為戒毒治療靶點(diǎn)的可能性。
[0008]結(jié)果可見(jiàn):伊馬替尼可抑制大鼠嗎啡敏化的形成，定位注射伊馬替尼于獎(jiǎng)賞相關(guān)腦區(qū)伏隔核的核部抑制C-Kit的活性，可減弱嗎啡成癮大鼠的心理渴求。以上結(jié)果表明:C-Kit在藥物成癮中起著重要作用，針對(duì)其設(shè)計(jì)藥物有望戒除毒癮。
[0009]本發(fā)明所述的成癮藥物是指麻醉藥品和精神藥物等。其中麻醉藥品又分為阿片類(lèi)、可卡因類(lèi)、大麻類(lèi)，阿片類(lèi)包含天然來(lái)源的阿片及從中提取的有效成分如嗎啡，以及將有效成分加工得到的產(chǎn)品如海洛因，類(lèi)似阿片作用的人工合成品如美沙酮等。精神藥物分為鎮(zhèn)靜催眠藥及抗焦慮藥、中樞興奮劑、致幻劑等。還包括酒精、煙草和揮發(fā)性有機(jī)溶劑等。
[0010]本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn):(I)本發(fā)明為治療藥物成癮心理渴求提供了一種有效治療的靶點(diǎn)；(2)本發(fā)明對(duì)心理渴求和藥物所致的興奮性均有效，治療效果好，有望從根本上治療物質(zhì)成癮及防止停藥后的復(fù)吸。
【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1為自發(fā)活動(dòng)箱裝置圖；
[0012]圖2為伊馬替尼對(duì)大鼠嗎啡敏化形成的影響；
[0013]A為給藥實(shí)驗(yàn)流程圖;B為伊馬替尼對(duì)大鼠嗎啡敏化形成的影響
[0014]圖3為條件位置偏愛(ài)裝置圖；
[0015]圖4為伏隔核的核部定位給予伊馬替尼抑制嗎啡成癮大鼠的心理渴求；
[0016]A為伏隔核定位給藥的時(shí)間流程圖；B為伏隔核的核部定位給予伊馬替尼對(duì)嗎啡成癮大鼠的心理渴求的抑制作用;C為伏隔核的核部定位給予伊馬替尼對(duì)c-Kit活性的抑制作用
【具體實(shí)施方式】
[0017]通過(guò)以下詳細(xì)說(shuō)明結(jié)合附圖可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。所提供的實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明方法的說(shuō)明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0018]【實(shí)施例1】伊馬替尼對(duì)大鼠嗎啡敏化表達(dá)的影響
[0019]本實(shí)施例選擇伊馬替尼作為抗嗎啡成癮高發(fā)性活動(dòng)的藥物，通過(guò)建立嗎啡敏化大鼠模型，探討C-Kit抑制劑伊馬替尼對(duì)大鼠嗎啡所致的高發(fā)性自發(fā)活動(dòng)的改善作用，旨在選擇療效確切，毒性小的抗精神活性物質(zhì)所致高發(fā)性自發(fā)活動(dòng)的藥物作用靶標(biāo)。
[0020]材料與方法
[0021 ] 藥品及試劑Morphine(青海制藥廠)；伊馬替尼(Novartis PharmaStein AG);
[0022]動(dòng)物SPF級(jí)SD雄性大鼠，體重220_250g。湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為N0.42000600012344，生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(鄂)2015_2018。鼠飼料，購(gòu)于武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
[0023]實(shí)驗(yàn)方法
[0024]動(dòng)物分組與處理:大鼠隨機(jī)分為四組，分別為生理鹽水+溶劑組、生理鹽水+伊馬替尼給藥組和嗎啡+溶劑組、嗎啡+伊馬替尼給藥組。均在武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)環(huán)境中進(jìn)行飼養(yǎng)，溫度為23 ± 2°C，濕度為50 土 5 %，光照時(shí)間為6:00-18:00，采用12小時(shí)明暗交替，并確保大鼠在飼養(yǎng)時(shí)能夠自由獲取食物與飲用水，實(shí)驗(yàn)前均提供一周時(shí)間環(huán)境適應(yīng)。
[0025]動(dòng)物造模:動(dòng)物造模:實(shí)驗(yàn)前一天(第O天)，對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行活動(dòng)量基線測(cè)定，根據(jù)測(cè)定結(jié)果隨機(jī)分為4組(η= 10);實(shí)驗(yàn)第I?5天，生理鹽水+溶劑對(duì)照組和生理鹽水-伊馬替尼給藥組均皮下注射生理鹽水(lml/kg)，嗎啡+溶劑對(duì)照組和嗎啡-伊馬替尼給藥組均皮下注射嗎啡(10mg/kg)，給藥完后，所有的動(dòng)物記錄自發(fā)活動(dòng)60分鐘。如此實(shí)驗(yàn)重復(fù)5天。然后戒斷5天，于實(shí)驗(yàn)第10天，生理鹽水+溶劑對(duì)照組和嗎啡+溶劑對(duì)照組提前45分鐘灌胃生理鹽水(2ml/kg)，而生理鹽水-伊馬替尼給藥組和嗎啡+伊馬替尼給藥組提前45分鐘灌胃伊馬替尼(100mg/kg)，給藥后，以小劑量嗎啡(5mg/kg)皮下注射激發(fā)，檢測(cè)其自發(fā)活動(dòng)行為60分鐘，觀察自發(fā)活動(dòng)行為的變化，如圖2A所示。
[0026]檢測(cè)指標(biāo):
[0027]各組大鼠注射嗎啡后放入自發(fā)活動(dòng)檢測(cè)箱(如圖1)記錄自發(fā)活動(dòng)I小時(shí)，敏化形成后，自發(fā)活動(dòng)采用DigBehv自發(fā)活動(dòng)視頻分析系統(tǒng)(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制)，是由4個(gè)自發(fā)活動(dòng)觀察箱、視頻合成器、視頻圖樣采樣卡和分析軟件等組成。本系統(tǒng)能對(duì)大鼠活動(dòng)進(jìn)行視頻跟蹤，自動(dòng)記錄小鼠活動(dòng)軌跡，記錄大鼠的活動(dòng)次數(shù)。自發(fā)活動(dòng)評(píng)價(jià)的指標(biāo)是:大鼠一定時(shí)間段內(nèi)(如60min)的活動(dòng)總次數(shù)，即總次數(shù)增多顯示自發(fā)活動(dòng)增加。
[0028]實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0029]結(jié)果可見(jiàn)，大鼠經(jīng)過(guò)5天嗎啡連續(xù)給藥后，發(fā)現(xiàn)分組給予伊馬替尼與生理鹽水干預(yù)的大鼠的自發(fā)性行為具有顯著性差異，即系統(tǒng)給予伊馬替尼對(duì)正常動(dòng)物的自主行為是沒(méi)有明顯影響的，可排除伊馬替尼自身的藥物作用。皮下注射嗎啡的實(shí)驗(yàn)組，系統(tǒng)給予空白溶劑，與生理鹽水對(duì)照組比較，可觀測(cè)到SD大鼠自發(fā)性行為明顯增多，興奮性增高，敏化作用明顯；系統(tǒng)給予伊馬替尼后，與空白溶劑的嗎啡組比較發(fā)現(xiàn)敏化表達(dá)收到明顯抑制。如附圖2B所示(*表示差異有顯著性)。
[0030]【實(shí)施例2】伏隔核的核部定位給予伊馬替尼抑制大鼠嗎啡成癮心里渴求
[0031]由實(shí)施例1的結(jié)果可知伊馬替尼可以作為抗嗎啡成癮的藥物，而其又是c-Kit的抑制劑，通過(guò)建立嗎啡條件位置偏愛(ài)(condit1ned place preference，CPP)模型，研究伊馬替尼定位微注射入伏隔核的核部對(duì)嗎啡依賴戒斷后心理渴求的影響，同時(shí)觀察在成癮性藥物作用相關(guān)腦區(qū)有大量表達(dá)(Katafuchi，2000)的C-Kit的活性變化。旨在確定其作為藥物靶標(biāo)在篩選一種療效確切、毒性小的藥物成癮治療藥物中發(fā)揮的作用。
[0032]材料與方法
[0033]藥品及試劑Morphine(青海制藥廠)；伊馬替尼(Novartis PharmaStein AG)
[0034]動(dòng)物SPF級(jí)SD雄性大鼠，體重220_250g。湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為N0.42000600012016，生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(鄂)2015-2018。鼠飼料，購(gòu)于武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
[0035]實(shí)驗(yàn)儀器
[0036]條件位置偏愛(ài)儀(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制):實(shí)驗(yàn)采用計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制。裝置由三箱構(gòu)成的條件性位置偏愛(ài)箱:兩個(gè)側(cè)室和一個(gè)中間室(如圖3)。三室由可移動(dòng)的隔板分開(kāi)，內(nèi)外均為黑色。其中A箱和B箱位于中間箱的兩側(cè)，大小相同，A箱側(cè)壁上有9盞發(fā)黃光二極管構(gòu)成的正方形，底板為不銹鋼鋼條，B箱底板為不銹鋼網(wǎng)格。大鼠在各箱停留時(shí)間和出入次數(shù)可通過(guò)數(shù)據(jù)傳送到計(jì)算機(jī)，自動(dòng)收集記錄行為學(xué)資料。
[0037]實(shí)驗(yàn)方法
[0038]大鼠伏隔核的核部行定位手術(shù)，一星期后進(jìn)行生理鹽水或嗎啡CPP訓(xùn)練，如圖4A所不O
[0039](I)嗎啡CPP模型的建立
[0040]基礎(chǔ)值測(cè)試:
[0041]第I天，開(kāi)放三箱間通道，啟動(dòng)計(jì)算機(jī)上CPP程序，大鼠由中間室放入，任其在三箱中自由活動(dòng)15分鐘，電腦同步記錄其在各室中停留的時(shí)間。
[0042]條件性位置偏愛(ài)訓(xùn)練:
[0043]第2至9天，封閉三箱間通道。第2、4、6、8天，實(shí)驗(yàn)組皮下注射嗎啡(10mg/kg)并放入伴藥側(cè)45分鐘；對(duì)照組皮下注射生理鹽水(lml/kg)并放入非伴藥側(cè)45分鐘。第3、5、7、9天，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組大鼠均注射生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組放入非伴藥側(cè)，對(duì)照組放入伴藥側(cè)，均為45分鐘。每只大鼠的伴藥側(cè)是固定的。每組大鼠之后被放回飼養(yǎng)籠。
[0044]嗎啡CPP測(cè)試:
[0045]第10天進(jìn)行CPP測(cè)試，與基礎(chǔ)值測(cè)試階段相似。開(kāi)放三箱間通道，不予任何注射，啟動(dòng)計(jì)算機(jī)上CPP程序，大鼠由中間室放入，任其在三箱中自由活動(dòng)15分鐘，電腦同步記錄其在各室中停留的時(shí)間。偏愛(ài)分?jǐn)?shù)(CPP score)被定義為伴藥室所呆時(shí)間與非伴藥室所呆時(shí)間的差值。將大鼠在伴藥箱中CPP后測(cè)值與前側(cè)值比較確定大鼠是否形成CPP。并根據(jù)CPP后測(cè)值剔除未形成CPP的大鼠，將動(dòng)物進(jìn)行匹配分組。
[0046](2)環(huán)境線索誘發(fā)覓藥行為模型的建立
[0047]在實(shí)驗(yàn)的第11天，大鼠提前15分鐘微量注射伊馬替尼(4yg/0.5yl)和生理鹽水(0.5μ1)于伏隔核的核部，然后暴露于給藥箱，停留10分鐘，一部分大鼠再回到籠養(yǎng)環(huán)境中，用于24小時(shí)后和一周后條件位置偏愛(ài)行為學(xué)的測(cè)試;另一部分大鼠于60分鐘后斷頭取腦，采用western-blot的方法，檢測(cè)伏隔核的核部c-kit活性的變化與條件位置偏愛(ài)行為學(xué)變化的關(guān)系。
[0048](3)嗎啡CPP重新測(cè)試
[0049]伊馬替尼給藥后第I天和第7天，即第12和18天，測(cè)試大鼠對(duì)伴藥箱的偏愛(ài)程度，15分鐘，與基礎(chǔ)值測(cè)試階段相似。中間第13天到第17天，對(duì)大鼠不做任何處理。
[0050](4)嗎啡CPP的點(diǎn)燃
[0051]第14天檢測(cè)后24小時(shí)，即第15天，利用小劑量嗎啡(3ml/kg)進(jìn)行點(diǎn)燃。嗎啡注射后10分鐘，將大鼠放入中間箱開(kāi)始15分鐘的CPP值測(cè)試。
[0052]檢測(cè)指標(biāo):
[0053]大鼠訓(xùn)練后，采用條件位置偏愛(ài)箱檢測(cè)嗎啡成癮情況，條件位置偏愛(ài)評(píng)分(CPPScore)即反應(yīng)大鼠成癮行為的形成情況，CPP Score增高且有顯著性差異，成癮行為形成。伏隔核的核部微注射伊馬替尼再暴露后60min，檢測(cè)c-kit的活性，并于24小時(shí)和7天后檢測(cè)條件位置偏愛(ài)評(píng)分的變化。
[0054]實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0055]結(jié)果見(jiàn)圖4B，給藥組與對(duì)照組相比差異具有顯著性。伏隔核的核部微注射伊馬替尼后，條件位置偏愛(ài)減弱，且2周后不被點(diǎn)燃;未給藥的大鼠，條件位置偏愛(ài)依然存在。采用western-blot方法檢測(cè)到伏隔核的核部給予伊馬替尼后c-kit的磷酸化活性明顯降低(圖4C)。說(shuō)明微注射伊馬替尼于伏隔核的核部，通過(guò)抑制c-kit活化阻斷給藥環(huán)境引起的心理渴求，可改善嗎啡成癮癥狀。
[0056]實(shí)驗(yàn)結(jié)論
[0057]總之，伊馬替尼系統(tǒng)給藥可以抑制嗎啡引起的敏化活動(dòng)的形成，微注射C-Kit抑制劑于伏隔核的核部可抑制嗎啡成癮后心理渴求的形成，說(shuō)明C-Kit信號(hào)分子在嗎啡所致的成癮行為中起著關(guān)鍵的作用，針對(duì)其設(shè)計(jì)藥物抑制其活性可達(dá)到戒毒的效果，是用于戒毒藥物研發(fā)的有效作用靶標(biāo)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.C-Kit作為藥物靶標(biāo)在篩選治療成癮藥物物質(zhì)依賴的藥物中的應(yīng)用。2.c-Kit作為藥物靶標(biāo)在篩選治療成癮藥物物質(zhì)依賴的成癮心理渴求和興奮性的藥物中的應(yīng)用。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的成癮藥物是指(I)麻醉藥品，其中麻醉藥品又分為阿片類(lèi)、可卡因類(lèi)、大麻類(lèi)，阿片類(lèi)包含天然來(lái)源的阿片及從中提取的有效成分嗎啡，以及將有效成分加工得到的產(chǎn)品海洛因，類(lèi)似阿片作用的人工合成品；(2)精神藥物，精神藥物分為鎮(zhèn)靜催眠藥及抗焦慮藥巴比妥類(lèi)、中樞興奮劑苯丙胺類(lèi)、致幻劑麥角二乙胺;(3)酒精、煙草和揮發(fā)性有機(jī)溶劑。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK105974131SQ201610435065
【公開(kāi)日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年6月16日
【發(fā)明人】李艷琴, 楊奇, 陳萍萍
【申請(qǐng)人】武漢大學(xué)