自動多步純化系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】一種自動多步色譜純化系統(tǒng)(400)，其包括系統(tǒng)控制器(401)、具有至少一個泵(425)和兩個或更多個捕獲柱(412a，412b，412c)的捕獲流路徑(410)、具有用于后續(xù)的純化的純化柱(417，422a，422b)的洗脫流路徑和具有兩個或更多個閥(407，411a，411b，421a，421b)的閥組件，所述閥被控制以將所述捕獲柱分別選擇性地連接到捕獲流路徑和洗脫流路徑，使得兩個流路徑可以同時且并行運(yùn)行。
【專利說明】
自動多步純化系統(tǒng)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及多步色譜純化，且更特別涉及具有兩個或更多個純化段的自動多步色 譜純化系統(tǒng)，所述兩個或更多個純化段用于對來自彼此隔離的單獨的進(jìn)料源的靶分子進(jìn)行 純化。
【背景技術(shù)】
[0002] 在當(dāng)前的藥物研究中，對短時間純化許多蛋白質(zhì)存在提高的需求。然而，蛋白質(zhì)純 化耗時且其需要許多人工工作。
[0003] 例如治療抗體形式的蛋白質(zhì)代表醫(yī)藥市場中最快速發(fā)展的領(lǐng)域中的一個。該領(lǐng)域 的發(fā)展使開發(fā)新的高效的且節(jié)約成本的平臺成為必要，用于準(zhǔn)備和分析早期候選物，以進(jìn) 行較快和較好的抗體選擇和表征。通常，蛋白質(zhì)通過細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生，其中使用哺乳動物或 細(xì)菌細(xì)胞系，其設(shè)計成通過包含用于關(guān)注的蛋白質(zhì)的基因的重組體質(zhì)粒的插入而產(chǎn)生該蛋 白質(zhì)。由于所用的細(xì)胞系為活的有機(jī)體，它們必須用通常由動物血清的制劑供應(yīng)的復(fù)雜生 長培養(yǎng)基喂養(yǎng)，其包含糖、氨基酸和生長因子。從供給細(xì)胞的化合物的混合物且從細(xì)胞本身 的副產(chǎn)物分離需要的蛋白質(zhì)到足以準(zhǔn)備和分析的純度具有艱巨的挑戰(zhàn)性。
[0004] 純化來自細(xì)胞碎片的蛋白質(zhì)的程序起初取決于蛋白質(zhì)的表達(dá)位點。促使一些蛋白 質(zhì)直接從細(xì)胞分泌到周圍的生長介質(zhì)中；其他蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)制備。對于后面的蛋白質(zhì)，純 化過程的第一步驟包括細(xì)胞溶解，這可以通過各種方法進(jìn)行，包括機(jī)械剪切、滲透振蕩或酶 處理。這種破壞將細(xì)胞的全部內(nèi)含物釋放到勻漿中，且另外產(chǎn)生由于其小尺寸而難以除去 的亞細(xì)胞鏈段。這些亞細(xì)胞鏈段一般通過離心或通過過濾除去。盡管以較小比例，但是由于 在蛋白質(zhì)生產(chǎn)運(yùn)行過程中細(xì)胞的自然死亡和細(xì)胞內(nèi)宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的釋放，直接分泌的蛋 白質(zhì)會出現(xiàn)相同問題。
[0005] 因此，當(dāng)前使用的典型的純化過程包括以下步驟： ?細(xì)胞溶解以回收細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)或在分泌的蛋白質(zhì)的情況下從介質(zhì)回收蛋白質(zhì)； ?使用例如不同離心或過濾除去細(xì)胞碎片以獲得包含關(guān)注的蛋白質(zhì)的澄清樣本； ?在多步工藝中使用各種色譜介質(zhì)以將關(guān)注的蛋白質(zhì)與樣本中的其他蛋白質(zhì)和各種 其他雜質(zhì)分離。
[0006] 色譜技術(shù)通?；诘鞍踪|(zhì)的電荷、疏水程度或尺寸來分離蛋白質(zhì)的混合物。多種 不同色譜樹脂可用于各種這些技術(shù)，允許根據(jù)所涉及的具體蛋白質(zhì)準(zhǔn)確調(diào)節(jié)純化方案。這 些分離方法各自的本質(zhì)為可促使蛋白質(zhì)在不同速率下沿長柱向下移動，實現(xiàn)物理分離(物 理分離隨蛋白質(zhì)進(jìn)一步沿柱向下行進(jìn)而提高），或促使蛋白質(zhì)選擇性地粘附到分離介質(zhì)，后 續(xù)通過不同溶劑不同地洗脫。在以下情況下，在雜質(zhì)特異性粘附到柱，而關(guān)注的蛋白質(zhì)不粘 附到柱，也就是說，關(guān)注的蛋白質(zhì)存在于"流過液"中時，需要的蛋白質(zhì)與雜質(zhì)分離。
[0007] 以可交換的反荷離子命名的離子交換色譜法為適用于純化可離子化的分子的程 序。離子化的分子基于其帶電荷基團(tuán)與附接到固相支撐基質(zhì)的帶相反電荷的分子的非特定 靜電相互作用而分離，由此阻礙與固相更強(qiáng)相互作用的那些離子化的分子。各種類型的離 子化的分子的凈電荷及其對于基質(zhì)的親和力根據(jù)帶電荷基團(tuán)的數(shù)目、各個基團(tuán)的電荷和分 子的競爭來與帶電荷的固相基質(zhì)相互作用的特性而變化。這些差別導(dǎo)致各種分子類型通過 離子交換色譜法分解。在使用離子交換色譜法的典型的蛋白質(zhì)純化中，將源自例如哺乳動 物細(xì)胞培養(yǎng)物中的宿主細(xì)胞的許多蛋白質(zhì)的混合物施加到離子交換柱。在非結(jié)合性分子洗 掉之后，在步進(jìn)模式或梯度模式中例如通過改變pH值、反荷離子濃度等來調(diào)節(jié)狀況，以從固 相釋放非特定保持或阻礙的關(guān)注的離子化的蛋白質(zhì)并將其與具有不同電荷特征的蛋白質(zhì) 分咼。
[0008] 陰離子交換色譜法包括在一定的pH值下且在具體分離工藝的狀況下，關(guān)注的陰離 子分子與負(fù)反荷離子競爭來與附接到固相基質(zhì)的帶正電荷的分子相互作用。相反，陽離子 交換色譜法包括在一定的pH值下且在具體分離方法的狀況下，關(guān)注的陽離子分子與正反荷 離子競爭來與附接到固相基質(zhì)的帶負(fù)電荷分子相互作用?；旌夏Ｊ降碾x子交換色譜法包括 在同一步驟中使用陽離子和陰離子交換色譜介質(zhì)的組合。具體而言，"混合模式"是指陽離 子交換和/或陰離子交換和疏水相互作用部分的混合物共價附接到的固相支撐基質(zhì)。
[0009] 采用待純化的蛋白質(zhì)和固定捕獲劑之間的具體的結(jié)構(gòu)依賴性（即，空間補(bǔ)償)相互 作用的親和色譜法為一些蛋白質(zhì)例如抗體的標(biāo)準(zhǔn)純化選擇。蛋白質(zhì)A，例如，為用于蛋白質(zhì) 例如抗體的親和色譜法的有用吸附劑，其包含F(xiàn)c區(qū)域。蛋白質(zhì)A為來自金黃色葡萄球菌的 41kD細(xì)胞壁蛋白質(zhì)，其高親和力地(對人體IgG為約10- 8Μ)連接到抗體的Fc區(qū)域。
[0010] 其他色譜方法為羥磷灰石色譜法或疏水相互作用色譜法(HIC)。蛋白質(zhì)純化和色 譜過程的更詳細(xì)描述可以通過GE Healthcare Life Sciences公司提供的本領(lǐng)域的一系列 手冊中發(fā)現(xiàn)，包括:親和色譜法、抗體純化、用于蛋白質(zhì)純化的策略等。其都通過引用結(jié)合到 文中。
[0011] 因此，典型的純化進(jìn)行一個或多個離心和過濾步驟以及至少2種色譜分離技術(shù)，例 如親和色譜法(AC)、凝膠滲透色譜法(GPC)、離子交換色譜法（IEC)、疏水相互作用色譜法 (HIC)、反相色譜法(RPC)和正相色譜法(NPC)。通常各種提到的技術(shù)需要導(dǎo)致在色譜分離執(zhí) 行之前進(jìn)行樣本準(zhǔn)備的不同運(yùn)行(緩沖液、pH值、傳導(dǎo)率)狀況。
[0012] 如所述，色譜純化方案可以包括一個或多個純化步驟，且在一個實施例中，方案包 括三個純化步驟，通常稱為捕獲、中間純化和精加工(polishing)。表1說明所選擇的不同色 譜純化技術(shù)的相關(guān)特征和三步驟方案的不同純化步驟中的相關(guān)用途。當(dāng)設(shè)計色譜純化方案 時，存在考慮何時計劃各個純化步驟的四個重要性能參數(shù):分解度、容量、速度和回收率。只 有在損害其他的情況下，才可以實現(xiàn)這四個參數(shù)中任一個的優(yōu)化，且各個純化步驟將相互 妥協(xié)。各個參數(shù)的重要性將取決于各個純化步驟的目的而變化，例如純化步驟是否用于捕 獲、中間純化或精加工等。純化方法應(yīng)當(dāng)被選擇和優(yōu)化以滿足各個純化步驟的目的。盡管回 收率可能不是待優(yōu)化的關(guān)鍵參數(shù)，然而在任何準(zhǔn)備情形下將需要考慮，尤其對于高價值產(chǎn) 品的生產(chǎn)，此外在優(yōu)化捕獲步驟期間測定回收率是重要的。
[0013] 表1.
[0014] 容量和分解度之間的最佳平衡必須根據(jù)各種情況限定。如在捕獲階段中，選擇性 將不僅僅對獲得靶分子的高結(jié)合容量重要。然而，與大多數(shù)捕獲步驟相反，在洗脫期間選擇 性是重要的且常常通過應(yīng)用連續(xù)梯度或多步洗脫程序獲得。
[0015] 除了通過各種純化方法可得到的不同選擇性之外，純化效率強(qiáng)烈取決于可用于各 種方法的不同色譜介質(zhì)的選擇。效率、流阻、選擇性和容量在介質(zhì)之間不同。介質(zhì)的粒徑強(qiáng) 烈影響效率和流阻。
[0016] 具有大珠料的介質(zhì)給予柱低效率(峰較寬)和低背壓，然而小珠料給予高效率和高 背壓。在純化過程早期(例如捕獲階段），常常需要高速度，原因是樣本體積較大且樣本快速 需要被穩(wěn)定。較不關(guān)注于分解度。具有大顆粒的色譜介質(zhì)應(yīng)當(dāng)選擇成在高流動速率下給予 低背壓。在精加工階段中，關(guān)注于高純度，其可以用具有高效率的色譜介質(zhì)（即小珠料)獲 得。這些介質(zhì)給出較高背壓，所述較高背壓可能需要較低流動速率和抵抗高壓的柱。這些限 制是可接受的，原因是該階段中的樣本體積和量較少。
[0017] 單批次色譜技術(shù)在蛋白質(zhì)的實驗室規(guī)模純化中和在工業(yè)應(yīng)用中都良好地接受;然 而這種技術(shù)具有勞動密集性、昂貴性，由于長的 加工時間和高運(yùn)行成本(例如大溶劑量、昂貴樹脂和硬件）。這種技術(shù)還對運(yùn)行狀況(例 如產(chǎn)物滴定量、保留時間和進(jìn)料速率(產(chǎn)物從80%動態(tài)結(jié)合容量值開始損失)敏感。還開發(fā)了 一些備選的半連續(xù)技術(shù)， 這表示它們連接兩種或三種不同色譜模式，例如： ?TO 2011/037522公開了包括以出口連接至入口的至少兩個分離單元的分離系統(tǒng)。所 有柱在線連接； ?W0 2011/017514公開了親和色譜步驟和兩個離子交換色譜步驟的組合，而不需要保 持槽或緩沖液交換步驟； ?W09307168公開了用于一種蛋白質(zhì)的基本上連續(xù)分離和分析的現(xiàn)有技術(shù)自動色譜系 統(tǒng)的一個實例，其包括樣本輸入裝置、第一液體色譜柱、將樣本輸入裝置連接到柱的多端口 注射閥、用于提供經(jīng)由多端口閥到柱的溶液的可變的壓力遞送的栗裝置和規(guī)定系統(tǒng)控制程 序的順序的程序裝置。
[0018] 但這些沒有一種允許具有連續(xù)進(jìn)料。
[0019] W02013050104公開了能夠運(yùn)行連續(xù)色譜工藝的現(xiàn)有技術(shù)自動工業(yè)規(guī)模的色譜系 統(tǒng)，其只需要三個分離柱。所述工藝為包括兩個色譜步驟的兩步程序。第一色譜步驟(捕獲） 在優(yōu)選兩個分離柱上交替且連續(xù)進(jìn)行;第二色譜步驟(精加工)在第三柱上也連續(xù)進(jìn)行。但 該系統(tǒng)和上述自動純化系統(tǒng)無法使得多個不同樣本使用同一個系統(tǒng)以自動和高效方式純 化。
[0020] 色譜介質(zhì)(樹脂）的原位清潔(CIP)對最終的生物醫(yī)藥產(chǎn)品的完整性和安全是重要 的。取決于進(jìn)料材料的源，各種類型的雜質(zhì)（如果不除去的話)可能在色譜介質(zhì)中捕獲且導(dǎo) 致從一個循環(huán)攜帶(carryover)到下一個循環(huán)。該攜帶的材料可以為產(chǎn)物或產(chǎn)物變體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0021] 本發(fā)明的目的在于提供色譜純化系統(tǒng)，所述系統(tǒng)克服現(xiàn)有技術(shù)的一個或多個缺 點。這通過如獨立權(quán)利要求中所限定的色譜純化系統(tǒng)獲得。
[0022] 本發(fā)明的色譜純化系統(tǒng)的一個益處在于其允許直接從細(xì)胞培養(yǎng)物以高效方式無 人值守地純化多種不同靶分子。
[0023] 本發(fā)明的更完整理解以及其進(jìn)一步的特征和優(yōu)點將通過參考以下詳述和附圖獲 得。
【附圖說明】
[0024]圖1示意性地顯示色譜系統(tǒng)的一個實施方案。
[0025]圖2a_2d顯示具有定位在不同轉(zhuǎn)子位置的轉(zhuǎn)子的旋轉(zhuǎn)閥的實施方案的示意圖。 [0026]圖3示意性地顯示色譜系統(tǒng)的另一個實施方案。
[0027]圖4a_4c為旋轉(zhuǎn)閥的備選布置的示意圖。
[0028] 圖4a_4c示意性地顯示兩步純化過程。
[0029] 圖5a_5d示意性地顯示用于進(jìn)行圖4a_4c的兩步純化過程的流體環(huán)路。
[0030]圖6a和6b為旋轉(zhuǎn)閥的備選布置的示意圖。
[0031 ]圖7a和7b為旋轉(zhuǎn)閥的備選布置的示意圖。
[0032]圖8顯示多步純化系統(tǒng)的一個示意性實施方案。
[0033]圖9顯示兩步純化系統(tǒng)的一個示意性實施方案。
[0034] 圖10顯示閥組件。
[0035]圖11顯示兩步純化系統(tǒng)的另一個示意性實施方案。
[0036]圖12顯示在圖9或10的系統(tǒng)上的并行兩步純化過程的各個步驟的示意圖。
【具體實施方式】
[0037]圖1示意性地顯示色譜系統(tǒng)190的一個實施方案，其包括： ?布置成選擇來自流體源A1、A2、B1、B2的輸入流體的兩個3通輸入閥160和161， ?兩個系統(tǒng)栗150和151， ?用于記錄在系統(tǒng)栗之后的流路徑中的系統(tǒng)壓力的壓力傳感器200， ?確保通過栗供應(yīng)的流體的適當(dāng)混合的混合器210， ?用于將樣本注射到流體路徑中的注射閥220， ?選擇性地連接/斷開流體路徑中的柱240的柱連接閥230， ?柱前壓力傳感器235和柱后壓力傳感器236， ?用于檢測來自柱的輸出的紫外線(UV)監(jiān)測器250， #傳導(dǎo)率監(jiān)測器260， ?pH值監(jiān)測器265， ?輸出選擇閥270,其具有兩個或更多個輸出位置，例如連接到餾分(fraction)收集器 280、廢棄物容器等，和 ?系統(tǒng)控制器10,其連接到控制通過系統(tǒng)的液體流的栗和閥和連接到監(jiān)測流量的傳感 器和監(jiān)測器，通過虛線310說明連接件。
[0038] 圖1的色譜系統(tǒng)表示可以如何設(shè)計色譜系統(tǒng)的一般實施例，且其他實施方案可以 具有不同設(shè)計，其包括一些部件中的兩個或更多個且潛在性缺乏所述部件中的一些。根據(jù) 一個實施方案，所述色譜系統(tǒng)為液體色譜系統(tǒng)。
[0039] 圖2a_2d示意性公開了例如可以用于根據(jù)上文的色譜系統(tǒng)的閥10。閥10為旋轉(zhuǎn)閥， 其具有端口 131a、132s、133a和134a的定子且具有在面向定子的表面上形成的凹槽140、 141a和141b(以虛線顯示）。閥10在未決專利申請PCT/SE2013/050985中更詳細(xì)公開，其通過 引用結(jié)合到文中。
[0040] 在第一轉(zhuǎn)子位置上，如圖2a中所示，閥10布置成繞開部件端口 133a和134a。流體流 進(jìn)入入口端口 131a，經(jīng)由第一噴嘴131b行進(jìn)通過對角線轉(zhuǎn)子凹槽140且通過出口端口 132a (經(jīng)由第二噴嘴132b)離開閥。閥的其他端口和凹槽在第一轉(zhuǎn)子位置并不激活，即部件被繞 開。
[0041 ]圖2b顯示第二轉(zhuǎn)子位置上的閥10，其中轉(zhuǎn)子12中的互連路徑使入口端口 131a與部 件進(jìn)料端口 133a互連且使部件返回端口 134a與出口端口 132a互連。在該轉(zhuǎn)子位置上，部件 以前向流連接件連接到流體流中。更具體而言，平行凹槽141a使入口端口的閥噴嘴131b和 部件進(jìn)料端口 133a的閥噴嘴133b互連，而其他平行凹槽141b使部件返回端口 134a的閥噴嘴 134b和出口端口 132a的閥噴嘴132b互連。
[0042]圖2c顯示第三轉(zhuǎn)子位置上的閥10，其中轉(zhuǎn)子12中的互連路徑使入口端口 13 la與部 件返回端口 134a互連且使部件進(jìn)料端口 133a與出口端口 132a互連。在該轉(zhuǎn)子位置上，部件 以反向流連接件連接到流體流中。更具體而言，平行凹槽141a使入口端口的閥噴嘴131b和 部件返回端口 134a的閥噴嘴134b互連，而其他平行凹槽141b使部件進(jìn)料端口 133a的閥噴嘴 133b和出口端口 132a的閥噴嘴132b互連。
[0043]圖2d顯示第四轉(zhuǎn)子位置上的閥10，其中轉(zhuǎn)子12中的互連路徑憑借主要入口端口 13la和出口端口 132a之間的流路徑使部件進(jìn)料端口 133a與部件返回端口 134a互連。
[0044]圖3示意性地顯示色譜系統(tǒng)190的另一個實施方案，其包括布置成為兩個系統(tǒng)栗 150和151選擇來自流體源A1、A2、B1、B2的輸入流體的兩個輸入3通閥160和161。所述色譜系 統(tǒng)190還可以包括： ?用于記錄在系統(tǒng)栗之后的流路徑中的系統(tǒng)壓力的壓力傳感器200， ?確保通過栗供應(yīng)的流體適當(dāng)混合的混合器210， ?用于將樣本注射到流體路徑中的注射閥220， ?用于選擇性地連接/斷開流體路徑中的柱240的柱連接閥230， ?用于檢測來自柱的輸出的紫外線(UV)監(jiān)測器250， #傳導(dǎo)率監(jiān)測器260,和 ?輸出選擇閥270,其具有兩個或更多個輸出位置，例如連接到餾分收集器280、廢棄物 容器等。
[0045] 圖3顯示色譜系統(tǒng)的一個實施方案，其中本發(fā)明的閥10用于兩個不同位置，即用作 如圖6a-6d中公開的柱連接閥230且用作如圖7a-7c中公開的輸出選擇閥270。
[0046] 圖1和3的色譜系統(tǒng)表示色譜系統(tǒng)可以如何構(gòu)建的實施例，且其他實施方案可以具 有不同設(shè)計，其包括一些部件中的兩個或更多個且潛在地缺乏所述部件中的一些。根據(jù)一 個實施方案，所述色譜系統(tǒng)為液體色譜系統(tǒng)。
[0047] 旋轉(zhuǎn)閥10的通用性質(zhì)還通過一些應(yīng)用的具體實施例說明，其中閥在流路徑設(shè)計和 所有運(yùn)行中提供足夠的益處。圖4a_4c示意性地顯示兩步純化過程，其可以通過使用旋轉(zhuǎn)閥 10的組件簡化。在這種類型的兩步純化過程中，圖4a中所示的第一步驟通常包括在第一柱A 240(例如親和柱等）中捕獲靶樣本例如蛋白質(zhì)。為了監(jiān)測靶樣本的捕獲，UV監(jiān)測器250在流 路徑中連接到柱A后。捕獲階段過程可以常規(guī)包括洗滌階段，其中從柱A洗滌掉非靶分子等， 洗滌階段也通過UV監(jiān)測器監(jiān)測以確定所有非靶標(biāo)何時被洗滌掉。在捕獲/洗滌階段期間，第 二柱B并不連接，如圖4a中所指示。當(dāng)來自UV監(jiān)測器的輸出信號指示捕獲/洗滌階段結(jié)束，下 一個階段在于從柱A洗脫靶樣本且進(jìn)一步使用柱B使其純化。為了從柱A洗脫靶樣本，將洗脫 緩沖液等供應(yīng)到源，由此靶樣本從柱A釋放。在洗脫階段期間，來自柱A的輸出使用UV監(jiān)測器 監(jiān)測，以識別靶樣本何時到達(dá)UV監(jiān)測器，由此柱B在流體路徑中連接在UV監(jiān)測器后以接受靶 樣本，如圖4b中所示，且然后當(dāng)所有靶樣本加載在柱B上時停止洗脫過程并引發(fā)為第二純化 步驟的第三階段。在第二純化步驟中，如圖4c中所示，柱A優(yōu)選從流路徑斷開，且洗脫緩沖液 通常用第二純化緩沖液替換以在柱B中驅(qū)動色譜純化。在該步驟中，合乎需要的是通過在柱 B的輸出端引入UV監(jiān)測器來監(jiān)測來自柱B的輸出。因此，在第三階段中，與先前步驟相比，需 要改變柱B和UV監(jiān)測器的邏輯順序。除非存在可利用的兩個單獨的UV監(jiān)測器，否則改變兩個 流體部件的邏輯順序的過程并非無關(guān)緊要的操作，這需要多個閥部件。而且，在一些情形 下，合乎需要的是從柱A將洗脫的靶樣本盡可能快地引入到柱B上且然后盡可能快地改變緩 沖液，例如由于在洗脫期間使用的緩沖液會使蛋白質(zhì)不穩(wěn)定。
[0048]圖5a_5d顯示兩步純化過程可以使用包括本發(fā)明的設(shè)計的三個旋轉(zhuǎn)閥10a-l〇C的 組件如何設(shè)計的實施例。在該組件中，三個旋轉(zhuǎn)閥10a-10c串聯(lián)連接源到出口。柱A240在閥 l〇a的兩個部件進(jìn)料端口和返回端口之間連接(如圖2a_2d所公開），使得柱A連接且從流路 徑斷開。第二柱B 240在第二和第三閥10b和10c分別的部件進(jìn)料端口之間連接，且UV監(jiān)測器 250在第二和第三閥10b和10c分別的部件返回端口之間連接。通過該組件，高效改變柱B和 UV監(jiān)測器的邏輯順序使得能夠只使用兩個閥，同時還允許繞開兩個部件以及部件到流路徑 的單獨連接。
[0049]在圖5a中，所有三個閥10a-l〇C以繞開模式(第一位置)布置，由此流體流從源直接 行進(jìn)通過到出口。圖5b表示捕獲/洗滌階段和起初的洗脫階段，其中將流體流被引導(dǎo)通過柱 A和UV監(jiān)測器，然而柱B保持?jǐn)嚅_。這通過在第二位置上的閥10a、在第三位置上的閥10b和在 第二位置上的閥10c實現(xiàn)。圖5c表示洗脫階段，其中靶樣本通過UV監(jiān)測器檢測且第二柱B連 接在UV監(jiān)測器之后。這通過使閥10a保持在第二位置上、使閥10b保持在第三位置上且使閥 l〇c設(shè)定在第三位置上實現(xiàn)。注意到只通過將閥10c的位置從第二位置轉(zhuǎn)換到第三位置將柱 B連接在UV監(jiān)測器之后。圖5d表示第二純化步驟，其中柱A從流路徑斷開，且柱B和UV監(jiān)測器 的邏輯順序業(yè)已改變。這通過將閥l〇a設(shè)定在第一位置上、將閥10b設(shè)定在第二位置上且將 閥10c設(shè)定在第二位置上實現(xiàn)。
[0050]上述實施方案表示使用的一個實施例，當(dāng)改變流路徑中的部件的邏輯順序有利 時，該組件還可以用于其中該功能有用的任何應(yīng)用。通過根據(jù)圖5a-5d使用連接到兩個部件 的兩個閥l〇b和10c改變流路徑中的部件的邏輯順序，可以形成優(yōu)化使用各個步驟中可利用 的部件的不同流路徑構(gòu)造。例如UV監(jiān)測器、出口閥或柱的位置可以改變以最匹配當(dāng)前應(yīng)用。 如從上文明顯的是，用于改變流路徑中的部件的邏輯順序的這樣一個組件可以一般通過包 括第一和第二旋轉(zhuǎn)閥l〇a和10b以及第一和第二流體部件的流體環(huán)路獲得，其中： -第二閥的入口端口連接到第一閥的出口端口， -第一流體部件連接在第一閥的部件進(jìn)料端口和第二閥的部件進(jìn)料端口之間，且 -第二流體部件連接在第一閥的部件返回端口和第二閥的部件返回端口之間。
[0051 ]而且，本發(fā)明的閥10可以用作兩個獨立流體路徑的開關(guān)，如圖6a和6b中所指示，其 中源A和B分別連接到部件端口，且柱A和B分別連接到入口和出口。在這種構(gòu)造中，閥使得源 A或B能夠選擇性性連接到相應(yīng)的柱A和B。其中這樣一個組件將會是有用的一個應(yīng)用在于進(jìn) 行一個柱的調(diào)節(jié)，且在其他柱中并行運(yùn)行色譜方法，例如在生物加工生產(chǎn)流路徑中，其中所 調(diào)節(jié)的柱可以轉(zhuǎn)換到色譜方法且其他柱斷開以清潔或替換。
[0052]圖7a_7b示意性地顯示另一個應(yīng)用的具體實施例，其中將本發(fā)明的閥10引入到圖1 的色譜系統(tǒng)190的流路徑中的備選位置，以便啟用備選的兩步純化過程，其中洗脫的樣本餾 分儲存在樣本回路中以進(jìn)行后續(xù)的第二純化步驟。在圖7a和7b的系統(tǒng)190中，閥215業(yè)已在 流路徑中引入到注射閥220前，且出口端口連接到注射閥220的入口端口?；旌掀?10連接在 閥215的部件端口中的一個和注射閥220上的第二入口端口之間。閥215的其他部件端口連 接到輸出選擇閥270的出口端口。而且，在圖7a和7b中，回路閥300連接到注射閥的相應(yīng)出口 和入口。在所公開的實施方案中，顯示8個樣本回路310連接到回路閥300,各個回路能夠收 集一定的樣本體積以后續(xù)根據(jù)本領(lǐng)域普通實踐純化。在備選的實施方案中，回路功能可以 結(jié)合到注射閥220中。與圖3相比，柱選擇閥230通過能夠連接兩個或更多個柱到流體路徑的 閥（通過柱A和B 240說明）替換。
[0053]圖7a示意性地顯示第一純化步驟，其中靶樣本在流體路徑中引入且在柱A中捕獲 和洗滌，通過箭頭指示液體流。與圖9和10中說明的上述實施例相同，相同裝置起初用于起 始的洗脫，任選具有流路徑中連接的混合器。當(dāng)?shù)谝话袠颖就ㄟ^UV-監(jiān)測器250檢測時，閥 215和270轉(zhuǎn)換到圖7b中所示的相應(yīng)位置，由此形成用于將洗脫的樣本流重新引入到注射閥 220中的并行流路徑。在該重新注射過程期間，在閥215和注射閥220兩者中存在兩個并行流 體路徑且將洗脫的樣本流引導(dǎo)到回路閥300的入口，其中將需要的餾分收集和儲存在樣本 回路310中。注射閥220中的閥流路徑在圖7b中示意性地顯示為虛線。如先前所述，儲存在樣 本回路310中的洗脫的餾分可以后續(xù)使用柱B等進(jìn)一步純化。
[0054]圖5a_5d和7a_7b的兩個實施方案顯示使用通用閥10或具有類似能力的閥如何執(zhí) 行完全自動兩步純化過程的實施例。
[0055] 在其中重新布置上述色譜裝置的一些部件并添加一些額外的部件的另一個實施 方案中，可以提供能夠直接從多種細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)料等隔離地純化多種靶分子例如蛋白質(zhì)等 的完全自動兩步純化系統(tǒng)。
[0056] 該實施方案提供能夠既降低人工工作量又并行進(jìn)行蛋白質(zhì)純化以縮短加工時間 并搭配提高穩(wěn)健性和可靠性的系統(tǒng)。根據(jù)一個實施方案，所述系統(tǒng)可以設(shè)置為有限人工相 互作用且然后在不具有其他人工相互作用的情況下自動且完全無人值守地純化彼此隔離 的多種蛋白質(zhì)。所述系統(tǒng)裝置還可以用于大規(guī)模制造生物制劑，其中許多(a breath of)不 同蛋白質(zhì)可以彼此隔離地純化以用于分析、準(zhǔn)備或不斷的治療目的。
[0057]在一個實施方案中，提供了允許從包含全細(xì)胞的多種不澄清的抗體進(jìn)料等例如 (mAb或多克隆的）自動直接純化靶分子的系統(tǒng)構(gòu)造，其中從其相應(yīng)的源純化各種靶分子保 持隔離以避免被其他進(jìn)料源的成分污染，盡管按順序使用同一純化單元。所述系統(tǒng)還可以 適用于基于其他親和力的技術(shù)。在本發(fā)明的實施方案中，可以無人值守方式純化超過一種 靶分子例如(mAb或多克隆的）。在一些實施方案中，所述系統(tǒng)構(gòu)造允許以無人值守方式兩步 純化和分餾多種靶分子例如(mAb或多克隆的)進(jìn)料。
[0058]還可以提供多個自動保護(hù)機(jī)構(gòu)以確保多種mAb-進(jìn)料純化的連續(xù)進(jìn)程。
[0059] 根據(jù)圖8中示意性公開的一個實施方案，提供了布置成進(jìn)行多個隔離的多步純化 循環(huán)以從進(jìn)料源406a_e純化靶分子的自動多步色譜純化系統(tǒng)400，其包括： ?包括存儲器(未示出）的系統(tǒng)控制器401，存儲器儲存指令以控制系統(tǒng)400的部件， ?兩個或更多個純化段410、415、420，其各自代表純化步驟， ?用于驅(qū)動純化的至少一個栗425， ?具有兩個或更多個閥407、411&^、421&，13的閥組件，其用于控制系統(tǒng)400中的流體流 量； 其中： 所述純化段中的一個410為具有兩個或更多個捕獲柱412a-c的捕獲段且閥組件411a，b 布置成交替地將各個捕獲柱連接到 ?捕獲流路徑，其中柱流通地連接到進(jìn)料源406a_e中的一個以捕獲相應(yīng)的靶分子，且 ?洗脫流路徑，其用于將捕獲的靶分子洗脫到后續(xù)的純化步驟且準(zhǔn)備柱412a_c，以用 于后續(xù)的捕獲階段，在捕獲段410后的純化段415或420中的至少一個包括與捕獲柱的數(shù)目 相比較少數(shù)目的洗脫純化流路徑，各個洗脫純化流路徑包括純化柱417或422a，b，由此來自 捕獲段的洗脫流在所述洗脫純化流路徑中用中間清潔連續(xù)純化，以使后續(xù)的純化保持隔 離，且 其中各個純化段與后續(xù)的純化段處于直接流體連通而不具有任何中間樣本儲存部件。
[0060] 圖8中公開的自動多步色譜純化系統(tǒng)400高度簡化，以便更明顯公開本發(fā)明的主要 概念，且本領(lǐng)域技術(shù)人員將易于理解將需要哪個特征和部件以便執(zhí)行該系統(tǒng)。參考圖9等顯 示更詳細(xì)的實施方案。自動多步色譜純化系統(tǒng)400的一個主要特征為其布置成自動進(jìn)行多 個多步純化循環(huán)，以便以非常高效方式使用有限量的系統(tǒng)部件和純化單元(例如色譜柱)從 相應(yīng)的進(jìn)料源406a_e純化靶分子，同時仍使各種靶分子與業(yè)已通過本系統(tǒng)加工的先前進(jìn)料 的其他分子或成分保持隔離，以避免樣本之間的污染。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語隔離的是 指避免串?dāng)_或交叉污染的具體應(yīng)用所需要的任何化學(xué)隔離程度，且其可以在不同應(yīng)用中不 同。而且應(yīng)當(dāng)注意到根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)布置成進(jìn)行現(xiàn)有技術(shù)中通用的自動多步純化，而不 具有任何中間樣本儲存部件，例如樣本回路等。換而言之，各個純化段與后續(xù)的純化段處于 直接流體連通。
[0061]系統(tǒng)控制器401可以為自動化領(lǐng)域中的任何類型的通用控制器，例如計算機(jī)、平板 設(shè)備、嵌入式加工單元等。為了控制根據(jù)文中所述的流方案的系統(tǒng)，系統(tǒng)控制器401包括存 儲器(未示出），其儲存指令，以控制系統(tǒng)400的部件，且所述存儲器可以為可利用的任何常 規(guī)存儲器。
[0062]系統(tǒng)控制器401通過任何合適的方式例如電線，無線等(通過圖8中的虛線指示)連 接到系統(tǒng)的部件，且其還可以連接到外周單元，例如遠(yuǎn)程儲存設(shè)備、計算機(jī)等。
[0063] 在圖8的多步色譜純化系統(tǒng)400中，存在三個純化段410、415、420，但如所述，多步 純化可以包括兩個至多個不同或類似的純化段，且每一個段可以表示如上文公開且本領(lǐng)域 技術(shù)人員所了解的純化步驟。在圖8中，示意性公開了單獨一個栗425以驅(qū)動純化，但在本發(fā) 明的不同實施中，可根據(jù)需要存在任何合適數(shù)目的栗以根據(jù)具體裝置提供自動運(yùn)行。同樣， 還顯示示意性閥組件，其具有有限數(shù)目的閥407、411 &^、421&，13以控制系統(tǒng)400中的流體 流，且可以存在任何合適數(shù)目 或類型的閥。在一些實施方案中，可以提供多端口閥，其可以提供多種流體控制過程的 完整功能。
[0064]根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述純化段中的一個410為具有如上文所述的兩個或更 多個捕獲柱412a_c的捕獲段，所述捕獲步驟可以通過一定范圍的不同色譜技術(shù)進(jìn)行。在一 個實施方案中，捕獲柱為布置成捕獲關(guān)注的蛋白質(zhì)的親和色譜柱。用于捕獲柱的合適捕獲 介質(zhì)的選擇以及后續(xù)的純化段的選擇根據(jù)本領(lǐng)域普通實踐進(jìn)行，且例如在上述GE Healthcare手冊中公開。為了獲得高生產(chǎn)量，兩個或更多個捕獲柱412a_c以交替方式使用， 從而捕獲的靶分子可以在一個柱中洗脫，而后續(xù)的靶分子在另一個柱中捕獲，或在另一個 柱原位清潔和平衡等。如所述，為了保持靶分子不受污染，通過清潔原位工藝和平衡工藝準(zhǔn) 備用于后續(xù)的捕獲階段的各個捕獲柱以使后續(xù)的純化保持隔離。這種過程在本領(lǐng)域尤其已 知。
[0065] 由于捕獲步驟常常比后續(xù)的步驟更耗時，且由于包括的不同階段例如捕獲、洗脫 和清潔都需要按順序進(jìn)行，所公開的實施方案在某些方面是相同的：與后續(xù)的純化段中的 流路徑的數(shù)目相比，具有捕獲柱的捕獲流路徑的數(shù)目較大。然而，后續(xù)的段還可以具有多個 流路徑，取決于所述段的特定純化類型的特征和所涉及的過程時間。因此本發(fā)明一般提供 在可以降低用于加工多個樣本進(jìn)料的整個循環(huán)時間時，通過提供部分并行布置的段優(yōu)化多 步純化過程的效率的新方式。因此根據(jù)圖8中示意性地顯示的實施方案，與捕獲柱的數(shù)目相 比，捕獲段410后的純化段415和420包括較少數(shù)目的洗脫純化流路徑。
[0066] 根據(jù)一個實施方案，所述純化段中的一個包括一個或多個凝膠過濾柱，但其他柱 類型可以根據(jù)上文所討論選擇。
[0067] 根據(jù)參考圖9-15的實施方案更詳細(xì)討論的一個實施方案，所述系統(tǒng)可以包括布置 在進(jìn)料源和捕獲段之間的進(jìn)料過濾器段，所述進(jìn)料過濾器段布置成選擇性地引入用于各個 進(jìn)料流的清潔過濾器。業(yè)已顯示，提供用于過濾進(jìn)料流的合適過濾器使其可以通過將不澄 清的細(xì)胞培養(yǎng)物介質(zhì)或溶菌產(chǎn)物直接進(jìn)料到系統(tǒng)中來運(yùn)行根據(jù)本發(fā)明的多步純化過程。
[0068] 由于一些類型的純化步驟需要特定的緩沖液特征，所述系統(tǒng)可以提供洗脫調(diào)節(jié)進(jìn) 料源，其布置成提供調(diào)節(jié)流到洗脫流，以便使洗脫流的一個或多個緩沖液參數(shù)改變成適用 于后續(xù)的純化段的狀況。為了避免任何后續(xù)的步驟潛在性沉淀，例如由于調(diào)節(jié)緩沖液特征， 所述系統(tǒng)可以包括布置在洗脫調(diào)節(jié)進(jìn)料源和后續(xù)的純化段之間的洗脫過濾器段，所述洗脫 過濾器段布置成選擇性地引入用于各個洗脫流的清潔過濾器。所述系統(tǒng)還可以包括連接到 系統(tǒng)控制器以提供純化過程狀態(tài)的輸入的一個或多個傳感器，所述傳感器選自：pH值傳感 器、傳導(dǎo)率傳感器、UV吸收性傳感器、空氣傳感器等。
[0069] 還提供了自動多步色譜純化方法，其包括使用自動色譜系統(tǒng)從進(jìn)料源純化靶分子 的多個隔離的多步純化循環(huán)，所述自動色譜系統(tǒng)包括： 系統(tǒng)控制器，其包括存儲器，存儲器儲存指令，以用于控制系統(tǒng)的部件， 兩個或更多個純化段，其各自代表純化步驟， 所述純化段中的一個為具有兩個或更多個捕獲柱的捕獲段， 捕獲段后的至少一個純化段包括與捕獲柱的數(shù)目相比較少數(shù)目的洗脫純化流路徑，各 個洗脫純化流路徑包括純化柱， 其中各個純化段與后續(xù)的純化步驟處于直接流體連通而不具有任何中間樣本儲存部 件， 用于驅(qū)動純化的至少一個栗，和 具有兩個或更多個用于控制系統(tǒng)中的流體流量的閥的閥組件， 其中所述方法包括： 交替地將各個捕獲柱連接到： 捕獲流路徑，其中所述柱流通地連接到進(jìn)料源中的一個以捕獲相應(yīng)的靶分子，且 洗脫流路徑，其用于將捕獲的靶分子洗脫到后續(xù)的純化步驟并準(zhǔn)備用于后續(xù)的捕獲階 段的柱， 在所述洗脫純化流路徑中從捕獲段連續(xù)純化洗脫流，其中各個洗脫純化流路徑在各個 后續(xù)的純化之前清潔以使靶分子保持隔離。
[0070] 圖9顯示能夠直接從細(xì)胞培養(yǎng)物等純化靶分子例如蛋白質(zhì)等的這樣一個自動兩步 純化系統(tǒng)500的示意圖。在圖8的實施方案的以下描述中，公開了用于從mAb進(jìn)料純化mAb的 系統(tǒng)，但如所述，mAb可以為可以通過兩步或更多步色譜純化進(jìn)行純化的任何靶分子。
[0071] 所述構(gòu)造包括兩個獨立流。
[0072] ?捕獲流(實線流路徑）。例如在親和柱上驅(qū)動mAb-進(jìn)料以捕獲mAb; ?洗脫流(虛線流路徑）。驅(qū)動mAb從捕獲步驟洗脫，加載到例如凝膠過濾柱上，使用柱 凝膠過濾和CIP。
[0073]為了同時運(yùn)行捕獲運(yùn)行和洗脫流兩者，使用兩個捕獲柱510a和510b且其可以分別 通過兩個捕獲柱閥590和600(例如圖6a和6b中所公開的閥10)在兩個流路徑之間轉(zhuǎn)換，但其 他閥可以同樣有用。兩個閥用于控制兩個捕獲柱510a和510b哪一個將用于加載進(jìn)料或mAb 洗脫。閥10操縱兩個并行流構(gòu)造的能力使這成為可能。在一個備選的實施方案中，提供了多 功能的閥，其布置成提供如通過所公開的實施方案中的兩個閥提供的相應(yīng)功能。
[0074]兩個流路徑的描述 捕獲流(實線流路徑） 這部分構(gòu)造的目的為在無人值守、連續(xù)和隔離的方式中，收獲未加工的抗體進(jìn)料并將 其加載到親和柱上以允許關(guān)注的靶分子連接到捕獲柱。其他目的為允許加工多種進(jìn)料，這 通過以下方法獲得:首先，使用可以選擇使用哪種進(jìn)料且還檢測容器何時是空的且空氣何 時進(jìn)入系統(tǒng)的入口閥。其次，使用可以處理多個過濾器并將各個進(jìn)料引導(dǎo)到新的過濾器的 柱閥。柱閥還用于通過查看壓力變化量監(jiān)測過濾器的狀況。
[0075]在圖8中公開的自動兩步純化系統(tǒng)500的捕獲流段包括： ?具有未加工的mAb-進(jìn)料的四個mAb-進(jìn)料容器520a-d; ?具有至少四個入口端口和一個出口端口的捕獲流入口閥530，其布置成： ?選擇使用哪個mAb-進(jìn)料容器520a-d ?空氣檢測器540,其布置成： 引發(fā)緩沖液的變化； 洗滌出進(jìn)入流路徑的空氣； 用緩沖液洗滌； ?捕獲流栗550,其布置成： ?將mAb-進(jìn)料從相應(yīng)的mAb-進(jìn)料容器520a-d栗送到捕獲柱510a和510b; ?布置成過濾未加工的mAb-進(jìn)料和能夠通過閥捕獲流入口閥530響應(yīng)新的mAb-進(jìn)料容 器520a-d的選擇來選擇新的過濾器570a-d的過濾器組575; ?包括布置成當(dāng)過濾mAb進(jìn)料時能夠選擇使用哪個過濾器570a-d的兩個過濾器選擇 閥560和580; 每一 mAb-進(jìn)料使用一個過濾器，使用一次； ?根據(jù)一個實施方案，所述過濾器段提供壓力傳感器(未示出），其布置成測量過濾器 前和過濾器后的壓力以給出關(guān)于過濾器的壓力變化量，例如可以用于診斷過濾器的狀況； ?捕獲柱段515,其包括： ?兩個捕獲柱510a和510b; ?連接到捕獲柱510a和510b的輸入端且布置成選擇哪個捕獲柱510a和510b分別用于 捕獲和洗脫的第一捕獲柱閥590。如從圖8顯而易見且將在下文更詳細(xì)公開了，第一捕獲柱 閥590布置成使得當(dāng)兩個柱中的一個連接在捕獲流位置時，那么其他柱連接在洗脫流位置； ?在第一捕獲柱閥590和如圖2a-2d中公開的各個捕獲柱510a和510b之間連接以啟用 捕獲柱510a和51 Ob的上流、下流或繞開的任選柱控制閥（圖9中所示的一個實施例）； ?第二捕獲柱閥600,分別連接到捕獲柱510a和510b的相應(yīng)輸出端且布置成將流從用 于捕獲而連接的捕獲柱510a或510b引導(dǎo)到廢棄物出口，且將流從用于洗脫而連接的捕獲柱 510a或510b引導(dǎo)到洗脫收集流路徑(在下文更詳細(xì)公開）； ?將樣本栗流引導(dǎo)到廢棄物。
[0076]洗脫流(虛線流路徑） 這部分流的目的為在無人值守、連續(xù)方式中，洗脫捕獲在捕獲柱510a或510b中的靶蛋 白質(zhì)，調(diào)節(jié)緩沖液狀況，檢測潛在性團(tuán)聚，通過過濾洗脫的靶蛋白質(zhì)保護(hù)凝膠過濾柱，進(jìn)行 凝膠過濾，通過進(jìn)行兩個柱的柱CIP且使其重新平衡為新一輪做準(zhǔn)備。
[0077]在洗脫過程期間，在洗脫緩沖液源710a_d中提供合適的洗脫緩沖液，源通過洗脫 選擇閥720選擇。洗脫緩沖液源710a-d可以例如包括流體，所述流體用于： 洗滌捕獲物； 洗脫捕獲物； 凝膠過濾； CIPo
[0078]洗脫選擇閥720的出口連接到洗脫栗730，其將洗脫緩沖液進(jìn)料到捕獲柱段515中 的第一捕獲柱閥590的洗脫入口，由此將洗脫緩沖液進(jìn)料到在用于洗脫捕獲的物類的洗脫 流位置上連接的捕獲柱510a或510b。在洗脫過程期間，將在洗脫流位置上連接的捕獲柱 510a或510b的出口通過第二捕獲柱閥600引導(dǎo)到布置成進(jìn)行洗脫的樣本的第二步驟純化的 洗脫純化段760。還可以提供避免空氣進(jìn)入系統(tǒng)的任選空氣傳感器(未示出）和例如監(jiān)測捕 獲和凝膠過濾柱中的壓力的系統(tǒng)壓力傳感器(未示出）。
[0079] 洗脫純化段760包括緩沖液調(diào)節(jié)栗740形式的洗脫調(diào)節(jié)進(jìn)料源，所述緩沖液調(diào)節(jié)栗 740用于從緩沖液源750供應(yīng)調(diào)節(jié)緩沖液以便調(diào)節(jié)洗脫流的緩沖液參數(shù)。在所公開的實施方 案中，將調(diào)節(jié)緩沖液在T交叉點610引入到洗脫流中，由此使洗脫流和調(diào)節(jié)緩沖液混合，還可 以任何合適方式引入且緩沖液可以主動或被動混合?？刂普{(diào)節(jié)緩沖液的流動速率從而所得 混合的洗脫流具有用于第二純化步驟的合乎需要的特征。根據(jù)一個實施方案，洗脫在低pH 值下進(jìn)行且緩沖液調(diào)節(jié)栗740用于將緩沖液引入到系統(tǒng)流中，這將提高pH值到期望的水平 以用于后續(xù)的第二純化步驟。由于引入調(diào)節(jié)緩沖液會導(dǎo)致形成團(tuán)聚體，洗脫純化段760可以 包括用于檢測可以在調(diào)節(jié)之后引入的團(tuán)聚體的傳感器620,和過濾器閥670,所述過濾器閥 670用于響應(yīng)檢測流中的團(tuán)聚體將團(tuán)聚體過濾器640a-d引入到洗脫流中以保護(hù)第二純化柱 680例如凝膠過濾柱。在一個實施方案中，傳感器620可以為能夠在多波長下監(jiān)測吸收率的 多波長UV監(jiān)測器。例如監(jiān)測可以在280nm和600nm下進(jìn)行，由此280nm監(jiān)測蛋白質(zhì)在洗脫流中 的存在，而600nm監(jiān)測由潛在性團(tuán)聚體引起的光散射。
[0080]在所公開的實施方案中，過濾器閥670為配備有在回路位置上的過濾器的回路閥， 且過濾器在靶蛋白質(zhì)從捕獲物洗脫且同時加載到凝膠過濾柱上的時間期間在線布置。在一 個實施方案中，當(dāng)沒有檢測到團(tuán)聚體時且在不存在形成團(tuán)聚體等的風(fēng)險的過程步驟期間， 過濾器閥670布置成繞開過濾器640a-c，例如以避免由使用過濾器引起的背壓提高。在自動 過程期間的一個實施方案中，在例如凝膠過濾形式的第二純化之前，調(diào)節(jié)緩沖液狀態(tài)終止， 使捕獲柱脫線并改變通過洗脫栗730供應(yīng)的緩沖液。當(dāng)樣本從捕獲柱洗脫且同時加載到凝 膠過濾柱上時，回路閥用于選擇使用哪個過濾器。根據(jù)一個實施方案，為了避免樣本之間的 污染，同一過濾器只用于各個mAb洗脫，即使用一次。當(dāng)mAb峰值業(yè)已進(jìn)入凝膠過濾柱時，過 濾器繞開。
[0081 ]如業(yè)已提及，第二純化單元680可以為任何合適類型、能夠進(jìn)一步分離從捕獲柱洗 脫的物類的凝膠過濾柱。在第二純化單元680之后，可以提供能夠在洗脫的物類的吸收率的 一個或多個波長下監(jiān)測吸收率的第二UV監(jiān)測器和用于例如在多壁板705等中收集相關(guān)餾分 的餾分收集器700。例如監(jiān)測可以在280nm下進(jìn)行以監(jiān)測洗脫流中蛋白質(zhì)的存在。在一個實 施方案中，第二純化680和第一UV監(jiān)測器620可以通過如圖5a-d等中所公開的閥組件流通地 連接以使凝膠過濾柱和第二UV在線脫線。當(dāng)洗脫的mAb的起始部分到達(dá)這個閥時，將使凝膠 過濾柱在線，開始pH值-調(diào)節(jié)，且使凝膠過濾前的在線過濾器在線。當(dāng)洗脫的mAb的結(jié)束到達(dá) 這個閥時，pH值調(diào)節(jié)將停止，將進(jìn)行凝膠過濾前的在線過濾器脫線、捕獲柱脫線和改變緩沖 液。
[0082] 而且所述系統(tǒng)500可以包括任何合適傳感器，例如用于傳導(dǎo)率監(jiān)測或pH值-監(jiān)測 等。
[0083]所述系統(tǒng)還布置成在從一個進(jìn)料容器520a_d轉(zhuǎn)換到另一個之間進(jìn)行任何需要或 期望的系統(tǒng)準(zhǔn)備循環(huán)以便啟動例如:洗滌、調(diào)節(jié)等、下一個純化循環(huán)柱CIP和重新平衡。在所 公開的實施方案中，大多數(shù)這些循環(huán)通過洗脫段進(jìn)行。
[0084]與圖1的系統(tǒng)中的類似，所有激活部件連接到系統(tǒng)控制器(未示出），所述系統(tǒng)控制 器連接到栗和閥以控制通過系統(tǒng)的液體流，且連接到傳感器和監(jiān)測器以監(jiān)測流量。
[0085]圖10示意性公開了捕獲柱選擇閥組件，基于圖2a_d中公開的閥10。所述組件包括 如圖2a-2d中所公開在第一捕獲柱閥590和各個捕獲柱510a和510b之間連接以啟用捕獲柱 510a和51 Ob的上流、下流或繞開的另外的柱控制閥59 la和59 lb。
[0086] 圖11顯示基于來自GE Healthcare的AKTA Pure模塊色譜系統(tǒng)的自動兩步純化過 程的流路徑組件的示意性實施例，其中提及GE Healthcare生產(chǎn)模型： 所述構(gòu)造包括兩個獨立流。
[0087] ?樣本栗流(藍(lán)色流路徑）。驅(qū)動mAb-進(jìn)料以在親和柱上捕獲mAb; ?系統(tǒng)栗流(綠色流路徑）。驅(qū)動mAb從捕獲步驟洗脫，加載到凝膠過濾柱，使用柱的凝 膠過濾和CIP。
[0088] 為了這兩者同時運(yùn)行，使用兩個捕獲柱且在兩個通用閥V9-V柱的幫助下，我們可 以決定哪個捕獲柱將用于加載進(jìn)料或洗脫mAb J9-V能夠處理兩個并行流構(gòu)造而使其稱為 可能。
[0089]兩個流路徑的描述。
[0090]樣本栗流(藍(lán)色流路徑）。
[0091] 這部分構(gòu)造的目的為在無人值守、連續(xù)的方式中，收獲未加工的抗體進(jìn)料并將其 加載到親和柱上以允許關(guān)注的靶分子連接到捕獲柱。其他目的為允許加工多種進(jìn)料，這通 過以下方法獲得:首先，使用可以選擇使用哪種進(jìn)料以及檢測容器何時是空的和空氣何時 進(jìn)入系統(tǒng)的入口閥。其次使用可以處理多個過濾器且將各種進(jìn)料引導(dǎo)到新的過濾器的柱 閥。柱閥還用于通過查看壓力變化量監(jiān)測過濾器的狀況。
[0092] ?具有未加工的mAb-進(jìn)料的容器； ?樣本栗入口閥V9-S ?選擇使用哪種mAb-進(jìn)料 ?檢測空氣 引發(fā)到緩沖液的變化； 洗滌出進(jìn)入流路徑的空氣； 用緩沖液洗滌； ?樣本栗 〇栗送mAb-進(jìn)料 ?柱閥V9-C ?當(dāng)過濾mAb進(jìn)料時選擇使用哪種過濾器 每一 mAb-進(jìn)料使用一個過濾器，使用一次； ?測量過濾器前和過濾器后的壓力 給出關(guān)于過濾器的壓力變化量以用于診斷過濾器的狀況； ?注射閥V9-inj 〇使使用樣本和系統(tǒng)栗的栗-洗滌指令成為可能； ?引導(dǎo)流以修正V9-V(l)的入口； ?通用閥V9-V(l) 〇V9-V(l)用于選擇哪個柱用于捕獲和洗脫； ?通用閥 V9-V(2)或 V9-V(3) ?充當(dāng)柱閥，確定上流、下流或繞開； ?通用閥V9-V(4) 〇V9-V(4)用于選擇流是否行進(jìn)到廢棄物或進(jìn)入系統(tǒng)流路徑； ?將樣本栗流引導(dǎo)到廢棄物； ?用于廢棄物的容器； ?最終樣本栗流； 系統(tǒng)栗流(綠色流路徑）。
[0093] 這部分流的目的為在無人值守、連續(xù)方式中，洗脫捕獲的靶蛋白質(zhì)，調(diào)節(jié)緩沖液狀 況，檢測團(tuán)聚的問題，通過過濾洗脫的靶蛋白質(zhì)保護(hù)凝膠過濾柱，進(jìn)行凝膠過濾，通過進(jìn)行 兩個柱的柱CIP且使其重新平衡為新一輪做準(zhǔn)備。
[0094] 通過使用入口閥V9-A進(jìn)行洗脫以改變到洗脫緩沖液的緩沖液。所有步驟通過A-系 統(tǒng)栗驅(qū)動。B-系統(tǒng)栗用于調(diào)節(jié)洗脫之后的緩沖液狀況。洗脫在低pH值下進(jìn)行且B-系統(tǒng)栗用 于將緩沖液引入到系統(tǒng)流中，這將提高pH值。這會導(dǎo)致形成團(tuán)聚體。為了檢測團(tuán)聚體，使用 能夠在多個波長下監(jiān)測吸收率的U9-M。監(jiān)測在280nm和600nm下進(jìn)行，280nm監(jiān)測蛋白質(zhì)的存 在，而600nm監(jiān)測由團(tuán)聚體引入的光散射。
[0095] 為了保護(hù)凝膠過濾柱免受團(tuán)聚體，使用配備有過濾器的回路閥，那些過濾器在我 們的靶蛋白質(zhì)從捕獲物洗脫且同時加載到凝膠過濾柱上的時間期間在線布置。后續(xù)使其脫 線以避免由使用過濾器引起的背壓提高。
[0096] 在凝膠過濾之前，調(diào)節(jié)緩沖液狀況結(jié)束，使捕獲柱脫線并進(jìn)行緩沖液改變。在遵循 之后，激活具有峰值分餾的凝膠過濾。
[0097]進(jìn)行最后的柱CIP和重新平衡。
[0098] ?具有用于捕獲洗滌的緩沖液的容器； ?系統(tǒng)栗入口閥V9-A ?選擇使用哪種緩沖液 -洗滌捕獲物 -洗脫捕獲物 凝膠過濾 CIP ?空氣傳感器以避免空氣進(jìn)入系統(tǒng) ?系統(tǒng)栗 ?栗送緩沖液 ?系統(tǒng)壓力傳感器 ?監(jiān)測捕獲和凝膠過濾柱中的壓力 ?注射閥V9-inj 〇使使用樣本和系統(tǒng)栗的栗-洗滌指令成為可能； ?引導(dǎo)流以修正V9-V(l)的入口 ?通用閥V9-V(l) 〇V9-V(l)用于選擇哪個柱用于捕獲和洗脫； ?通用閥 V9-V(2)或 V9-V(3) ?充當(dāng)柱閥，確定上流、下流或繞開； ?通用閥V9-V(4) 〇V9-V(4)用于選擇流是否行進(jìn)到廢棄物或進(jìn)入系統(tǒng)流路徑； ?將系統(tǒng)栗流引導(dǎo)到系統(tǒng)流路徑； ?在線pH值-調(diào)節(jié) ?系統(tǒng)栗B流用于在流路徑中引入pH值調(diào)節(jié)緩沖液； 〇緩沖液主動或被動混合； ?UV和vis監(jiān)測 ?測量280nm和600nm下的吸收率； 280nm給出關(guān)于蛋白質(zhì)峰值的信息； 600nm給出關(guān)于可能形成的沉淀物的信息； #回路閥V9-L ?回路閥用于選擇當(dāng)樣本從捕獲柱洗脫且同時加載到凝膠過濾柱上時使用哪個過濾 器； 每一 mAb洗脫使用一個過濾器，使用一次； 當(dāng)mAb峰值進(jìn)入凝膠過濾柱時，過濾器繞開； ?作為X入口閥繪制的通用閥 ?該閥用作通用閥以使凝膠過濾柱和第二UV在線脫線； 〇當(dāng)洗脫的mAb的起始部分到達(dá)該閥時，將使凝膠過濾柱在線，開始pH值-調(diào)節(jié)，且使 凝膠過濾前的在線過濾器在線； ?當(dāng)洗脫的mAb的結(jié)束部分到達(dá)該閥時，pH值調(diào)節(jié)將停止，進(jìn)行凝膠過濾前的在線過 濾器脫線、捕獲柱脫線和改變緩沖液； ?傳導(dǎo)性監(jiān)測 ?pH值-監(jiān)測 ?出口閥V9-0 ?引導(dǎo)流到餾分收集器、廢棄物或出口 1-10 ?操控峰值分餾； ?在色譜進(jìn)行之后，兩個柱原位清潔。
[0099]圖12示意性地顯示表示在圖9和10中公開的實施方案中執(zhí)行的并行布置工作流的 示意圖。在該示意圖中，頂部柱表示通過捕獲柱A引起的流體路徑而底部柱表示通過捕獲柱 B引起的流體路徑。在該示意圖中，使用以下符號： ?加載進(jìn)料1-4 =>靶分子從進(jìn)料源1-4捕獲； ?W =>通過緩沖液流進(jìn)料洗滌捕獲的靶分子； ?E =>通過洗脫緩沖液進(jìn)料洗脫捕獲的靶分子； ?CIP =>原位清潔捕獲柱； ?CIP/Eq =>原位清潔和平衡凝膠過濾柱。
[0100]如圖12中所說明，靶分子從進(jìn)料2捕獲基本上在進(jìn)料1的捕獲階段結(jié)束時同時引 發(fā)。在所公開的實施例中，捕獲步驟的持續(xù)時間設(shè)定等于其他步驟所需要的總時間，但這可 以明顯對于不同純化裝置和步驟而不同。
【主權(quán)項】
1. 一種自動多步色譜純化系統(tǒng)，其布置成進(jìn)行用于純化來自進(jìn)料源的靶分子的多個隔 離的多步純化循環(huán)，所述自動多步色譜純化系統(tǒng)包括： ?系統(tǒng)控制器，其包括存儲器，所述存儲器儲存用于控制所述系統(tǒng)的部件的指令， ?兩個或更多個純化段，其各自代表純化步驟， ?至少一個用于驅(qū)動所述純化的栗， ?閥組件，其具有兩個或更多個用于控制所述系統(tǒng)中的流體流量的閥， 其中： 所述純化段中的一個為具有兩個或更多個捕獲柱的捕獲段，且所述閥組件布置成交替 地將各個捕獲柱連接到 -捕獲流路徑，其中所述柱流通地連接到進(jìn)料源中的一個以捕獲相應(yīng)的靶分子，和 -洗脫流路徑，所述洗脫流路徑用于將捕獲的靶分子洗脫到后續(xù)的純化步驟且準(zhǔn)備所 述柱，以用于后續(xù)的捕獲階段， 在所述捕獲段后的所述純化段中的至少一個包括與所述捕獲柱的數(shù)目相比較少數(shù)目 的洗脫純化流路徑，各個洗脫純化流路徑包括純化柱，其中來自所述捕獲段的洗脫流在所 述洗脫純化流路徑中用中間清潔繼續(xù)純化，以使后續(xù)的純化保持隔離，且 其中各個純化段與后續(xù)的純化段處于直接流體連通，而不具有任何中間樣本儲存部 件。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述捕獲柱為親和色譜柱。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述純化段中的一個包括一個或多個 凝膠過濾柱。4. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的系統(tǒng)，其特征在于，其包括在所述進(jìn)料源和所述 捕獲段之間布置的進(jìn)料過濾器段，所述進(jìn)料過濾器段布置成選擇性地引入用于各個進(jìn)料流 的清潔過濾器。5. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的系統(tǒng)，其特征在于，其包括洗脫調(diào)節(jié)進(jìn)料源，其布 置成對所述洗脫流提供調(diào)節(jié)流，以便將所述洗脫流的一個或多個緩沖液參數(shù)改變成適用于 后續(xù)的純化段的狀況。6. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的系統(tǒng)，其特征在于，其包括在所述洗脫調(diào)節(jié)進(jìn)料 源和后續(xù)的純化段之間布置的洗脫過濾器段，所述洗脫過濾器段布置成選擇性地引入用于 各個洗脫流的清潔過濾器。7. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的系統(tǒng)，其特征在于，其包括一個或多個傳感器，其 連接到所述系統(tǒng)控制器以提供純化過程的狀態(tài)的輸入，所述傳感器選自：pH值傳感器、傳導(dǎo) 率傳感器、UV吸收性傳感器、空氣傳感器。8. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的系統(tǒng)，其特征在于，其布置成通過原位清潔工藝 和平衡工藝準(zhǔn)備所述捕獲柱，以用于后續(xù)的捕獲階段，以使后續(xù)的純化保持隔離。9. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述洗脫純化流路徑的中間 清潔包括原位清潔工藝和平衡工藝。10. -種自動多步色譜純化方法，其包括用于使用自動色譜系統(tǒng)純化來自進(jìn)料源的靶 分子的多個隔離的多步純化循環(huán)，所述自動色譜系統(tǒng)包括： ?系統(tǒng)控制器，其包括存儲器，所述存儲器儲存用于控制所述系統(tǒng)的部件的指令， ?兩個或更多個純化段，其各自代表純化步驟， i. 所述純化段中的一個為具有兩個或更多個捕獲柱的捕獲段 ii. 在所述捕獲段后的所述純化段中的至少一個包括與所述捕獲柱的數(shù)目相比較少 數(shù)目的洗脫純化流路徑，各個洗脫純化流路徑包括純化柱， iii. 其中各個純化段與后續(xù)的純化步驟處于直接流體連通，而不具有任何中間樣本 儲存部件， ?用于驅(qū)動所述純化的至少一個栗，和 ?閥組件，其具有用于控制所述系統(tǒng)中的流體流量的兩個或更多個閥， 其中所述方法包括： 交替地將各個捕獲柱連接到： ?捕獲流路徑，其中所述柱流通地連接到所述進(jìn)料源中的一個，以捕獲相應(yīng)的靶分子， 且 ?洗脫流路徑，所述洗脫流路徑用于將捕獲的靶分子洗脫到后續(xù)的純化步驟且用于準(zhǔn) 備所述柱，以用于后續(xù)的捕獲階段， 在所述洗脫純化流路徑中連續(xù)純化來自所述捕獲段的洗脫流，其中各個洗脫純化流路 徑在各個后續(xù)的純化之前清潔，以使靶分子保持隔離。11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述捕獲柱為親和色譜柱。12. 根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的方法，其特征在于，所述純化段中的一個包括一個或多 個凝膠過濾柱。13. 根據(jù)權(quán)利要求10-12中任一項所述的方法，其特征在于，所述色譜系統(tǒng)包括在所述 進(jìn)料源和所述捕獲段之間布置的進(jìn)料過濾器段，所述進(jìn)料過濾器段布置成選擇性地引入用 于進(jìn)料流的清潔過濾器。14. 根據(jù)權(quán)利要求10-12中任一項所述的方法，其特征在于，所述色譜系統(tǒng)包括洗脫調(diào) 節(jié)進(jìn)料源，其布置成對所述洗脫流提供調(diào)節(jié)流，以便使所述洗脫流的一個或多個緩沖液參 數(shù)改變成適用于后續(xù)的純化段的狀況。15. 根據(jù)權(quán)利要求10-12中任一項所述的方法，其特征在于，所述色譜系統(tǒng)包括在所述 洗脫調(diào)節(jié)進(jìn)料源和后續(xù)的純化段之間布置的洗脫過濾器段，所述洗脫過濾器段布置成選擇 性地引入用于各個洗脫流的清潔過濾器。16. 根據(jù)權(quán)利要求10-12中任一項所述的方法，其特征在于，所述色譜系統(tǒng)包括一個或 多個傳感器，其連接到所述系統(tǒng)控制器以提供所述純化過程的狀態(tài)的輸入，所述傳感器選 自：pH值傳感器、傳導(dǎo)率傳感器、UV吸收性傳感器、空氣傳感器。17. 根據(jù)權(quán)利要求10-12中任一項所述的方法，其特征在于，通過原位清潔工藝和平衡 工藝準(zhǔn)備所述捕獲柱以用于后續(xù)的捕獲階段，以使后續(xù)的純化保持隔離的步驟。18. 根據(jù)權(quán)利要求10-12中任一項所述的方法，其特征在于，所述洗脫純化流路徑的中 間清潔包括原位清潔工藝和平衡工藝。
【文檔編號】G01N30/88GK105980847SQ201580008706
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2015年2月13日
【發(fā)明人】C.O.埃里克森, N.諾爾曼
【申請人】通用電氣健康護(hù)理生物科學(xué)股份公司