利用可編程核酸探針的高通量且高度多路復(fù)用的成像的制作方法
【專利摘要】在此尤其提供了用于以高空間分辨率將感興趣的靶標(biāo)成像的方法和組合物。
【專利說明】利用可編程核酸探針的高通量且高度多路復(fù)用的成像
[0001] 相關(guān)申請
[0002] 本申請要求2014年3月11日提交的美國臨時申請?zhí)?1/951,461的權(quán)益，其全部內(nèi) 容通過引用結(jié)合在此。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明總體上涉及檢測和量化分析物(例如，靶標(biāo))的領(lǐng)域。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 熒光顯微鏡檢術(shù)是一種用于探索在例如生物系統(tǒng)中的分子的有力工具。然而，可 以被區(qū)別地且同時地可視化的不同物種的數(shù)目（即多路復(fù)用能力)受到熒光團(tuán)之間的光譜 重疊的限制。
[0006] 發(fā)明概述
[0007] 本發(fā)明尤其提供了用于檢測、成像并且/或者量化感興趣的靶標(biāo)(例如，生物分子） 的方法和組合物。在此提供的方法中的一些包括（1)使一個有待分析的樣品（例如，一個疑 似含有一個或多個感興趣的靶標(biāo)的樣品）與特異性結(jié)合這些靶標(biāo)的部分(每個部分是一個 給定靶標(biāo)的結(jié)合配偶體)接觸，其中每個部分偶聯(lián)至一個核酸(在此稱為對接鏈)并且其中 具有不同特異性的結(jié)合配偶體偶聯(lián)至不同對接鏈，（2)任選地去除未結(jié)合的結(jié)合配偶體， (3)使該樣品與經(jīng)標(biāo)記的（例如，熒光標(biāo)記的）核酸接觸，這些核酸具有互補(bǔ)于并且因此特異 于一個對接鏈的核苷酸序列（此類標(biāo)記核酸在此稱為經(jīng)標(biāo)記的成像鏈），（4)任選地去除未 結(jié)合的成像鏈，（5)將樣品整體或部分成像以便檢測經(jīng)結(jié)合的成像鏈的位置和數(shù)目，（6)猝 滅來自樣品的經(jīng)標(biāo)記成像鏈的信號（例如，通過漂白，包括光漂白），并且（7)重復(fù)步驟(3)_ (6)，每次使用一個相對于本方法中所用的全部其他成像鏈來說具有獨特核苷酸序列的成 像鏈。
[0008] 成像鏈可以被相同地標(biāo)記，包括被相同地進(jìn)行熒光標(biāo)記。在其他實施例中，具有一 個相同序列的成像鏈可以被相同地標(biāo)記。第一種方法可能是更方便的，因為它需要單一的 激發(fā)波長和檢測器。
[0009] 用這樣的方式，可以檢測、成像并且/或者量化一個樣品中的兩個或更多個靶標(biāo)， 無論它們在該樣品中的位置如何，包括無論它們在樣品中的位置是否非常接近，以致于如 果同時觀察來自這兩個或更多個靶標(biāo)的信號則是不能區(qū)別的。因此，兩個或更多個靶標(biāo)之 間的距離可小于用于檢測靶標(biāo)的成像系統(tǒng)的分辨距離，并且仍然使用在此提供的方法，可 以將兩個或更多個靶標(biāo)彼此區(qū)別開，由此促進(jìn)對此類靶標(biāo)的更準(zhǔn)確且穩(wěn)健的檢測和量化。 在一些情況下，該分辨距離可以為約50nm，作為一個實例。
[0010] 應(yīng)當(dāng)理解，在進(jìn)行該方法之前，一個樣品的"靶標(biāo)內(nèi)容"可能是已知或懷疑的、或未 知和不受懷疑的。接觸樣品的結(jié)合配偶體可結(jié)合或不可結(jié)合到該樣品上，這取決于靶標(biāo)是 否存在(例如，當(dāng)靶標(biāo)存在時，該結(jié)合配偶體可結(jié)合到該樣品上）。接觸樣品的成像鏈可結(jié)合 或不可結(jié)合到該樣品上，這取決于靶標(biāo)是否存在(例如，當(dāng)靶標(biāo)存在時，該成像鏈可結(jié)合一 個結(jié)合到靶標(biāo)上的相應(yīng)的對接鏈）。"結(jié)合到樣品上"意指結(jié)合配偶體或成像鏈被結(jié)合到其 對應(yīng)的靶標(biāo)或?qū)渔溕稀?br>[0011] 結(jié)合配偶體可以是天然存在的蛋白質(zhì)，諸如抗體或抗體片段。在結(jié)合配偶體是一 種抗體或抗體片段的情況下，對接鏈可以在一個恒定區(qū)偶聯(lián)到其上。結(jié)合配偶體可以是一 種諸如單克隆抗體的抗體，或者它可以是抗原結(jié)合抗體片段，諸如來自單克隆抗體的抗原 結(jié)合片段。在一些實施例中，結(jié)合配偶體是一種受體。
[0012] 結(jié)合配偶體可以通過一個中間接頭連接至對接鏈。在一些實施例中，一個中間接 頭包含生物素和/或鏈霉抗生物素蛋白。
[0013] 可以對成像鏈進(jìn)行熒光標(biāo)記（即，將它們偶聯(lián)至一個熒光團(tuán)）。偶聯(lián)至具有不同核 苷酸序列的成像鏈的熒光團(tuán)可以是彼此相同的，或者它們可具有與其他熒光團(tuán)重疊或不重 疊的發(fā)射分布圖。熒光標(biāo)記的成像鏈可包括至少一個熒光團(tuán)。
[0014] 在一些情況下，諸如成像鏈的熒光標(biāo)記的成像核酸可包括1、2、3、或更多個熒光 團(tuán)。
[0015] 該樣品可以是細(xì)胞、細(xì)胞群、或者來自細(xì)胞或細(xì)胞群的細(xì)胞裂解物。該靶標(biāo)可以是 蛋白質(zhì)。
[0016] 因此將了解到，本發(fā)明提供一種用于檢測分析物的方法，該方法是通過將分析物 結(jié)合到其對應(yīng)的結(jié)合配偶體上并且順序地確定此類結(jié)合配偶體的存在，通過重復(fù)地結(jié)合、 檢測并且猝滅(例如，漂白，諸如光漂白）任選地被相同地標(biāo)記(例如，相同地?zé)晒鈽?biāo)記）的成 像鏈。
[0017] 因此，本披露提供一種方法，包括（1)使一個有待針對一個或多個靶標(biāo)的存在進(jìn)行 測試的樣品與一個或多個靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體接觸，其中每個靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體連 接至一個對接鏈，并且其中具有不同特異性的靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體連接至不同對接鏈， (2)任選地去除未結(jié)合的靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體，（3)使該樣品與具有互補(bǔ)于一個對接鏈的 核苷酸序列的經(jīng)標(biāo)記成像鏈接觸，（4)任選地去除未結(jié)合的成像鏈，（5)將該樣品成像以便 檢測結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像鏈的位置和數(shù)目，（6)猝滅來自結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像鏈的信號，并且 (7)重復(fù)步驟(3)-(6)，每次使用一個相對于全部其他經(jīng)標(biāo)記成像鏈來說具有獨特核苷酸序 列的經(jīng)標(biāo)記成像鏈。
[0018] 在一些實施例中，該樣品在步驟(1)中與多于一個的靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體接觸。
[0019] 在一些實施例中，該靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體是一種抗體或抗體片段。
[0020] 在一些實施例中，這些經(jīng)標(biāo)記成像鏈被相同地標(biāo)記。在一些實施例中，這些經(jīng)標(biāo)記 成像鏈各自包括一個不同的標(biāo)記。在一些實施例中，這些經(jīng)標(biāo)記成像鏈?zhǔn)菬晒鈽?biāo)記的成像 鏈。
[0021 ]在一些實施例中，該一個或多個靶標(biāo)是蛋白質(zhì)。在一些實施例中，該樣品是細(xì)胞、 細(xì)胞裂解物或組織裂解物。
[0022] 在一些實施例中，使用共聚焦或落射熒光顯微鏡檢術(shù)在步驟(5)中將該樣品成像。
[0023] 在一些實施例中，步驟(6)中的猝滅信號包括光漂白。
[0024] 本披露進(jìn)一步提供一種包含結(jié)合到多于一個的靶標(biāo)識別部分(諸如靶標(biāo)特異性結(jié) 合配偶體)上的樣品的組合物，每個靶標(biāo)識別部分結(jié)合到一個對接核酸(諸如對接鏈)上，并 且至少一個對接核酸穩(wěn)定地結(jié)合到經(jīng)標(biāo)記成像核酸(諸如成像鏈)上。
[0025] 本披露進(jìn)一步提供一種組合物，該組合物包含結(jié)合到多于一個的靶標(biāo)特異性結(jié)合 配偶體上的一個樣品，每個結(jié)合配偶體結(jié)合到一個對接鏈上；以及至少一個穩(wěn)定地結(jié)合到 經(jīng)標(biāo)記成像鏈上的對接鏈。
[0026] 本披露進(jìn)一步提供一種方法，包括（1)使一個有待針對一個或多個靶標(biāo)的存在進(jìn) 行測試的樣品與一個或多個靶標(biāo)識別部分(諸如靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體)接觸，其中每個靶 標(biāo)識別部分連接至一個對接核酸(諸如對接鏈），并且其中具有不同特異性的靶標(biāo)識別部分 連接至不同對接核酸，（2)任選地去除未結(jié)合的靶標(biāo)識別部分，（3)使該樣品與具有互補(bǔ)于 一個對接核酸的核苷酸序列的經(jīng)標(biāo)記成像核酸(諸如成像鏈)接觸，（4)任選地去除未結(jié)合 的經(jīng)標(biāo)記成像核酸，（5)將樣品成像以便檢測結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像核酸的位置和數(shù)目，（6)通 過改變溫度和/或緩沖條件將結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像核酸從對接核酸去除，并且（7)重復(fù)步驟 (3)-(6)，每次使用一個相對于全部其他經(jīng)標(biāo)記成像核酸來說具有獨特核苷酸序列的經(jīng)標(biāo) 記成像核酸。在此類條件下，該成像核酸自發(fā)地從對接核酸解離。
[0027] 本披露進(jìn)一步提供一種方法，包括（1)使一個有待針對一個或多個靶標(biāo)的存在進(jìn) 行測試的樣品與一個或多個靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體接觸，其中每個靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體 連接至一個對接核酸，并且其中具有不同特異性的靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體連接至不同對接 核酸，（2)任選地去除未結(jié)合的靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體，（3)使該樣品與具有互補(bǔ)于一個對 接核酸的核苷酸序列的經(jīng)標(biāo)記成像核酸接觸，（4)任選地去除未結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像核酸， (5)將樣品成像以便檢測結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像核酸的位置和數(shù)目，（6)通過改變溫度和/或緩 沖條件將結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像核酸從對接核酸去除，并且(7)重復(fù)步驟(3)-(6)，每次使用一 個相對于全部其他經(jīng)標(biāo)記成像核酸來說具有獨特核苷酸序列的經(jīng)標(biāo)記成像核酸。在此類條 件下，該成像核酸自發(fā)地從對接核酸解離。
[0028] 在一些實施例中，通過減小鹽濃度、添加變性劑、或提高溫度將經(jīng)標(biāo)記成像核酸從 對接核酸去除。在一些實施例中，該鹽是Mg++。在一些實施例中，該變性劑是甲酰胺、尿素或 DMS0〇
[0029] 本披露進(jìn)一步提供一種方法，包括（1)使一個有待針對一個或多個靶標(biāo)的存在進(jìn) 行測試的樣品與一個或多個靶標(biāo)識別部分(諸如靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體)接觸，其中每個靶 標(biāo)識別部分連接至一個對接核酸(諸如對接鏈），并且其中具有不同特異性的靶標(biāo)識別部分 連接至不同對接核酸，（2)任選地去除未結(jié)合的靶標(biāo)識別部分，（3)使該樣品與具有互補(bǔ)于 一個對接核酸的核苷酸序列的經(jīng)標(biāo)記成像核酸(諸如成像鏈)接觸，（4)任選地去除未結(jié)合 的經(jīng)標(biāo)記成像核酸，（5)將樣品成像以便檢測結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像核酸的位置和數(shù)目，（6)將 結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像核酸從對接核酸去除，并且(7)重復(fù)步驟(3)-(6)，每次使用一個相對于 全部其他經(jīng)標(biāo)記成像核酸來說具有獨特核苷酸序列的經(jīng)標(biāo)記成像核酸。
[0030] 本披露進(jìn)一步提供一種方法，包括（1)使一個有待針對一個或多個靶標(biāo)的存在進(jìn) 行測試的樣品與一個或多個靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體接觸，其中每個靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體 連接至一個對接核酸，并且其中具有不同特異性的靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體連接至不同對接 核酸，（2)任選地去除未結(jié)合的靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體，（3)使該樣品與具有互補(bǔ)于一個對 接核酸的核苷酸序列的經(jīng)標(biāo)記成像核酸接觸，（4)任選地去除未結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像核酸， (5)將樣品成像以便檢測結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像核酸的位置和數(shù)目，（6)將結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像核 酸從對接核酸去除，并且(7)重復(fù)步驟(3)-(6)，每次使用一個相對于全部其他經(jīng)標(biāo)記成像 核酸來說具有獨特核苷酸序列的經(jīng)標(biāo)記成像核酸。
[0031 ]在一些實施例中，在步驟(6)中，在一個競爭核酸的存在下，不通過鏈置換將經(jīng)標(biāo) 記成像核酸從對接核酸去除。
[0032] 在一些實施例中，在步驟(6)中，通過化學(xué)法、光化學(xué)法或酶促法裂解、修飾或降解 經(jīng)標(biāo)記成像核酸，將經(jīng)標(biāo)記成像核酸從對接核酸去除。
[0033] 在一些實施例中，當(dāng)經(jīng)標(biāo)記成像核酸結(jié)合到其對應(yīng)的對接核酸上時，在成像核酸 或?qū)雍怂嵘喜淮嬖趩捂渽^(qū)。在一些實施例中，該對接核酸不具有立足點序列（toehold sequence)。在一些實施例中，該成像核酸不具有立足點序列。
[0034] 在一些實施例中，該經(jīng)標(biāo)記成像核酸不是自淬滅的。
[0035] 本披露進(jìn)一步提供一種方法，包括（1)使一個有待針對一個或多個靶標(biāo)的存在進(jìn) 行測試的樣品與一個或多個靶標(biāo)識別部分(諸如靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體)接觸，其中每個靶 標(biāo)識別部分連接至一個對接核酸(諸如對接鏈），并且其中具有不同特異性的靶標(biāo)識別部分 連接至不同對接核酸，（2)任選地去除未結(jié)合的靶標(biāo)識別部分，（3)使該樣品與具有互補(bǔ)于 一個對接核酸的核苷酸序列的經(jīng)標(biāo)記成像核酸(諸如成像鏈)接觸，（4)任選地去除未結(jié)合 的經(jīng)標(biāo)記成像核酸，（5)將樣品成像以便檢測結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像核酸的位置和數(shù)目，（6)通 過去除或修飾它們的信號發(fā)射部分而不完全去除成像核酸來滅活結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像核酸， 并且(7)重復(fù)步驟(3)-(6)，每次使用一個相對于全部其他經(jīng)標(biāo)記成像核酸來說具有獨特核 苷酸序列的經(jīng)標(biāo)記成像核酸。
[0036] 本披露進(jìn)一步提供一種方法，包括（1)使一個有待針對一個或多個靶標(biāo)的存在進(jìn) 行測試的樣品與一個或多個靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體接觸，其中每個靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體 連接至一個對接核酸，并且其中具有不同特異性的靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體連接至不同對接 核酸，（2)任選地去除未結(jié)合的靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體，（3)使該樣品與具有互補(bǔ)于一個對 接核酸的核苷酸序列的經(jīng)標(biāo)記成像核酸接觸，（4)任選地去除未結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像核酸， (5)將樣品成像以便檢測結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像核酸的位置和數(shù)目，（6)通過去除或修飾它們的 信號發(fā)射部分而不完全去除成像核酸來滅活結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像核酸，并且（7)重復(fù)步驟 (3)-(6)，每次使用一個相對于全部其他經(jīng)標(biāo)記成像核酸來說具有獨特核苷酸序列的經(jīng)標(biāo) 記成像核酸。
[0037] 不同實施例同樣適用于前述方法。這些實施例如下：
[0038] 在一些實施例中，該樣品在步驟（1)中與多于一個的靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體接觸。 在一些實施例中，該靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體是一種抗體或抗體片段。在一些實施例中，該靶 標(biāo)特異性結(jié)合配偶體是天然或工程化的配體、小分子、適體、肽、或寡核苷酸。
[0039] 在一些實施例中，這些經(jīng)標(biāo)記成像核酸被相同地標(biāo)記。在一些實施例中，這些經(jīng)標(biāo) 記成像核酸各自包括一個不同的標(biāo)記。在一些實施例中，這些經(jīng)標(biāo)記成像核酸是熒光標(biāo)記 的成像核酸。
[0040] 在一些實施例中，該一個或多個靶標(biāo)是蛋白質(zhì)。在一些實施例中，該樣品是細(xì)胞、 細(xì)胞裂解物或組織裂解物。
[0041] 在一些實施例中，使用共聚焦或落射熒光顯微鏡檢術(shù)在步驟(5)中將該樣品成像。
[0042] 在一些實施例中，該未結(jié)合的對接核酸是部分雙鏈的。在一些實施例中，該未結(jié)合 的成像核酸是部分雙鏈的。
[0043] 在一些實施例中，該成像核酸是一個分子信標(biāo)或者包括一個發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)。在一 些實施例中，該成像核酸是一個分子信標(biāo)或者包括一個自淬滅的發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)。在一些實 施例中，該成像核酸是一個半雙鏈體(hemiduplex)。在一些實施例中，該半雙鏈體是自淬滅 的。在一些實施例中，該成像核酸通過一個樹枝狀結(jié)構(gòu)或一個聚合結(jié)構(gòu)結(jié)合到多個信號發(fā) 射部分上。該成像核酸可以是直鏈或支鏈的。
[0044] 在一些實施例中，該對接核酸包括一個發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)。
[0045] 這些和其他實施例將在此更詳細(xì)地進(jìn)行說明。
[0046] 附圖簡述
[0047] 圖1是在本披露中提供的一種高通量和本質(zhì)上可縮放的多路復(fù)用成像方法的一個 實施例的示意圖。在探針雜交后將細(xì)胞成像并且然后在隨后輪次的成像之前進(jìn)行光漂白。
[0048] 圖2是一種基于緩沖液更換的高通量和本質(zhì)上可縮放的多路復(fù)用成像方法的一個 實施例的示意圖，該緩沖液更換使用具有輕微變性特征的溶液，諸如減小的鹽濃度、增加的 甲酰胺濃度、或更高的溫度。
[0049] 圖3是通過使用在本披露中提供的方法去除成像鏈來滅活該成像鏈的一個實施例 的示意圖。
[0050] 圖4是通過滅活熒光團(tuán)而不去除成像鏈的核酸部分來滅活該成像鏈的一個實施例 的示意圖。
[0051] 圖5是一個分子信標(biāo)樣的自淬滅成像鏈的一個實施例的示意圖。
[0052]圖6是一個半雙鏈體自淬滅成像鏈的一個實施例的示意圖。
[0053]圖7是一個非單鏈對接鏈的一個實施例的示意圖。
[0054] 圖8是一個成像鏈的一個實施例的示意圖，該成像鏈募集多個信號發(fā)射部分拷貝 至對接鏈。
[0055] 圖9是一個非單鏈成像鏈的一個實施例的示意圖。
[0056] 圖10是示出在3種不同條件下具有對應(yīng)的反向互補(bǔ)鏈的10個不同寡核苷酸的預(yù)測 解離常數(shù)的圖。序列al: 5 ' -CATCTAAAGCC-3 '（ SEQ ID NO: 1);序列a2:5 ' -GAATTTCCTCG-3 ' (SEQIDN0:2);序列a3:5'-GTTTAATTGCG-3'（SEQIDN0:3) ;序列a4:5'-ACAATTCTTCG-3' (SEQ ID N0:4);序列a5:5'-TTTCTTGCTTC_3'（SEQ ID N0:5);序列a6:5'-GCATTGTTACT_3' (SEQIDN0:6) ;序列a7:5'-ATATACAAGCG-3'（SEQIDN0:7);序列a8 :5'-GCTGTCTATTG-3' (SEQIDN0:8);序列a9:5'-TCTTTATGCTG-3'（SEQIDN0:9) ;序列al0:5'-CAATCTCATCC-3' (SEQ ID NO:10)。
[0057] 發(fā)明說明
[0058] 本發(fā)明尤其提供了例如，在使用基于核酸的成像探針(例如，基于DNA的成像探針） 的細(xì)胞環(huán)境中用于多路復(fù)用熒光成像的組合物和方法。在此提供的方法是部分地基于核酸 對接鏈和成像鏈的可編程性。也就是說，例如，對接鏈和成像鏈可以被設(shè)計，從而使得它們 在某些條件下彼此結(jié)合一定的時間。這種可編程性允許成像鏈穩(wěn)定結(jié)合到對接鏈，如在此 提供的?？傮w上，在此提供的方法涉及鑒定一個特定樣品（例如，生物樣品）中的一個或多個 靶標(biāo)(例如，諸如蛋白質(zhì)或核酸的一個或多個生物分子）。在一些情況下，一個或多個靶標(biāo)是 否存在于樣品中是未知的。因此，本披露的方法可用于確定在一個疑似含有一個或多個靶 標(biāo)的樣品中是否存在該一個或多個靶標(biāo)。在在此提供的方面和實施例的任一個中，一個樣 品可含有或可疑似含有一個或多個靶標(biāo)。
[0059] 因此，本發(fā)明提供用于基于可編程核酸(例如，DNA)探針進(jìn)行高通量且高度多路復(fù) 用的成像以及分析物/靶標(biāo)檢測的方法。這些方法依賴于一種采用正交成像鏈的順序成像 方法，這些正交成像鏈可以穩(wěn)定地附接至一個固定在結(jié)合配偶體(諸如抗體)上的互補(bǔ)對接 鏈(圖1)。在與一個成像鏈雜交且成像后，進(jìn)行一個猝滅步驟(諸如一個光漂白步驟)以便消 除和/或減少來自雜交(結(jié)合)的成像鏈的熒光。
[0060] 在另一個實施例中，這些方法利用對接鏈與成像鏈之間的較弱結(jié)合以便去除信 號。例如，雜交條件可改變，這樣使得在對接鏈或成像鏈之間形成的雙鏈體的熔點略高于室 溫(例如，25°C)或成像溫度。如上所述地進(jìn)行標(biāo)記步驟（即，其中成像鏈結(jié)合到其對應(yīng)的對 接鏈上的步驟)和成像步驟。作為一個實例，在對第一個靶標(biāo)進(jìn)行成像后，使該樣品經(jīng)受一 個變性條件?？墒褂靡环N具有例如較低鹽濃度，存在或增加變性劑(諸如甲酰胺)的濃度，或 增加的溫度的溶液，在緩沖液更換步驟中提供該變性條件（圖2)。該樣品可以可替代地或另 外地暴露于增加的溫度。上述的增加或減小是相對于在標(biāo)記步驟中存在的條件（即，當(dāng)成像 鏈結(jié)合到對接鏈上時）。在緩沖液更換的情況下，可洗滌該樣品，可重復(fù)該緩沖液更換，可再 次洗滌該樣品，并且然后將下一個成像鏈添加到該樣品。
[0061] 對于多路復(fù)用，在例如用于猝滅信號的光漂白或其他方法或者成像鏈滅活或去除 的每個步驟之后順序地向相同樣品施用正交成像鏈的不同儲庫，以便潛在地成像無限數(shù)目 的靶標(biāo)。不同于傳統(tǒng)的成像方法中多路復(fù)用受到顏色通道之間的光譜重疊限制，在此提供 的方法僅受到(對接鏈或可替代地成像鏈的）可能的正交核苷酸序列數(shù)目的限制。由于可以 容易地設(shè)計較大量的正交核苷酸序列，此方法具有僅通過使用單個熒光團(tuán)就達(dá)到的本質(zhì)上 可縮放的多路復(fù)用能力。此方法可以容易地與標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡檢術(shù)設(shè)置(例如，共聚焦或落射熒 光顯微鏡檢術(shù))整合，從而允許高通量地分析該樣品。
[0062] 這些方法具有在例如高通量篩選測定(諸如藥物篩選測定）中的適用性。此成像方 法允許在使用標(biāo)準(zhǔn)共聚焦或落射熒光顯微鏡檢術(shù)成像的同時，以一種超多路復(fù)用格式分析 大的細(xì)胞群(~1，〇〇〇-1〇,〇〇〇)或組織樣品。以一種高通量的方式從相同樣品中篩選大量靶 標(biāo)(諸如蛋白質(zhì)）將提供關(guān)于新藥或調(diào)節(jié)劑的信息，同時提供細(xì)胞異質(zhì)性信息。具有高通量 且超多路復(fù)用的成像能力的組織樣品的大規(guī)模篩選將適用于病理學(xué)分析，例如，在醫(yī)院或 其他服務(wù)提供商設(shè)置中。
[0063] 在此提供的方法還可以用于鑒定一個單一靶標(biāo)(例如，諸如例如，一種特定的蛋白 質(zhì)）的絕對量，或一個單一靶標(biāo)相對于一個或多個其他靶標(biāo)而言的量。
[0064] 另外，在此提供的方法可用于鑒定一個靶標(biāo)在一個樣品中或相對于樣品中的其他 靶標(biāo)的位置。
[0065] 因此，本披露提供一種方法，包括（1)使一個樣品同時與多個序列標(biāo)記的靶標(biāo)識別 部分接觸，（2)引入成像核酸(諸如成像鏈），這些成像核酸通過序列互補(bǔ)性識別序列標(biāo)記的 靶標(biāo)識別部分中的對接核酸(諸如對接鏈)亞組，（3)去除或滅活成像核酸或者猝滅來自成 像核酸的信號，并且(4)至少一次重復(fù)步驟(2)和任選地步驟(3)以便成像并且檢測一個或 多個另外的對接核酸。
[0066] 該方法可任選地包括用對接核酸(諸如對接鏈)來標(biāo)記多個靶標(biāo)識別部分以便形 成序列標(biāo)記的靶標(biāo)識別部分。
[0067] 本披露提供一種方法，包括（1)使一個有待針對一個或多個靶標(biāo)的存在進(jìn)行測試 的樣品與一個或多個靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體接觸，其中每個靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體連接至 一個對接鏈，并且其中具有不同特異性的靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體連接至不同對接鏈，（2)任 選地去除未結(jié)合的靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體，（3)使該樣品與具有互補(bǔ)于一個對接鏈的核苷 酸序列的經(jīng)標(biāo)記成像鏈接觸，（4)任選地去除未結(jié)合的成像鏈，（5)將該樣品成像以便檢測 結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像鏈的位置和數(shù)目，（6)猝滅來自結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像鏈的信號，并且（7)重 復(fù)步驟(3)-(6)，每次使用一個相對于全部其他經(jīng)標(biāo)記成像鏈來說具有獨特核苷酸序列的 經(jīng)標(biāo)記成像鏈。
[0068] 步驟(3)-(6)可重復(fù)一次或多次。例如，步驟(3)-(6)可重復(fù)1-10次或更多次。在一 些實施例中，步驟(3)-(6)重復(fù)1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。
[0069] 本披露進(jìn)一步提供一種方法，包括（1)使一個有待針對一個或多個靶標(biāo)的存在進(jìn) 行測試的樣品與一個或多個靶標(biāo)識別部分(諸如靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體)接觸，其中每個靶 標(biāo)識別部分連接至一個對接核酸，并且其中具有不同特異性的靶標(biāo)識別部分連接至不同對 接核酸，（2)任選地去除未結(jié)合的靶標(biāo)識別部分，（3)使該樣品與具有互補(bǔ)于一個對接核酸 的核苷酸序列的經(jīng)標(biāo)記成像核酸(諸如成像鏈)接觸，（4)任選地去除未結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像 核酸，（5)將樣品成像以便檢測結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像核酸的位置和數(shù)目，（6)將結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記 成像核酸從對接核酸去除，并且(7)重復(fù)步驟(3)-(6)，每次使用一個相對于全部其他經(jīng)標(biāo) 記成像核酸來說具有獨特核苷酸序列的經(jīng)標(biāo)記成像核酸。
[0070] 步驟(3)-(6)可重復(fù)一次或多次。例如，步驟(3)-(6)可重復(fù)1-10次或更多次。在一 些實施例中，步驟(3)-(6)重復(fù)1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。
[0071] 本披露進(jìn)一步提供一種方法，包括（1)使一個有待針對一個或多個靶標(biāo)的存在進(jìn) 行測試的樣品與一個或多個靶標(biāo)識別部分(諸如靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體)接觸，其中每個靶 標(biāo)識別部分連接至一個對接核酸(諸如對接鏈），并且其中具有不同特異性的靶標(biāo)識別部分 連接至不同對接核酸，（2)任選地去除未結(jié)合的靶標(biāo)識別部分，（3)使該樣品與具有互補(bǔ)于 一個對接核酸的核苷酸序列的經(jīng)標(biāo)記成像核酸(諸如成像鏈)接觸，（4)任選地去除未結(jié)合 的經(jīng)標(biāo)記成像核酸，（5)將樣品成像以便檢測結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像核酸的位置和數(shù)目，（6)通 過去除或修飾它們的信號發(fā)射部分而不完全去除成像核酸來滅活結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像核酸， 并且(7)重復(fù)步驟(3)-(6)，每次使用一個相對于全部其他經(jīng)標(biāo)記成像核酸來說具有獨特核 苷酸序列的經(jīng)標(biāo)記成像核酸。
[0072] 步驟(3)-(6)可重復(fù)一次或多次。例如，步驟(3)-(6)可重復(fù)1-10次或更多次。在一 些實施例中，步驟(3)-(6)重復(fù)1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。
[0073] 在一些實施例中，在此提供的方法包括一個以下步驟:使用一種除了鏈置換之外 的方法來去除結(jié)合到對接核酸(諸如對接鏈)上的成像核酸(諸如成像鏈）。
[0074] 在一些實施例中，在此提供的方法包括一個去除結(jié)合到對接核酸(諸如對接鏈)上 的成像核酸(諸如成像鏈)的步驟，其中該成像核酸在結(jié)合到對接核酸上之前發(fā)射信號（即， 這種信號未淬滅）。
[0075] 在一些實施例中，在此提供的方法包括一個去除結(jié)合到對接核酸(諸如對接鏈)上 的成像核酸(諸如成像鏈)的步驟，其中使用不包含淬滅劑的核酸去除該成像核酸。
[0076] 在每個前述方法中，對接核酸(包括對接鏈)可以是單鏈對接核酸或?qū)渔?，或?它可以是雙鏈對接核酸或?qū)渔湥蛘咚梢允遣糠蛛p鏈對接核酸或?qū)渔?例如，含有一 個單鏈和一個雙鏈區(qū)）。
[0077]在一些實施例中，在使用多個靶標(biāo)識別部分(包括多個結(jié)合配偶體）的情況下，該 多個可同時與樣品接觸并且因此與感興趣的靶標(biāo)接觸。靶標(biāo)識別部分(諸如結(jié)合配偶體)不 需要順序地與樣品接觸，雖然它們是可以的。
[0078]這些不同方法促進(jìn)用旋轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡進(jìn)行高通量成像。據(jù)估計，一次一種顏 色的全細(xì)胞3D成像過程將平均需要約30秒。此方法允許用兼容的10X或20X物鏡對大面積 (例如，高達(dá)mm規(guī)模)進(jìn)行成像。可實現(xiàn)約30-50微米的成像深度。在此提供的方法已被用于 染色肌動蛋白、Ki-67、網(wǎng)格蛋白、細(xì)胞角蛋白等等(數(shù)據(jù)未示出）。
[0079] 結(jié)合配偶體
[0080] 這些方法采用偶聯(lián)至核酸(例如，對接核酸(諸如對接鏈））的結(jié)合配偶體。這些可 以在此稱為結(jié)合配偶體-核酸偶聯(lián)物（"BP-ΝΑ偶聯(lián)物"）。它們還可被稱為序列標(biāo)記的靶標(biāo)識 另嘟分。如在此所使用的，"結(jié)合配偶體-核酸偶聯(lián)物，"或"BP-ΝΑ偶聯(lián)物，"是指一種連接(例 如，通過一種N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)接頭)至一個單鏈核酸(例如，DNA)對接鏈的分子。
[0081] 偶聯(lián)物的結(jié)合配偶體可以是對于一個感興趣的靶標(biāo)(諸如，生物分子(例如，蛋白 質(zhì)或核酸））具有親和力的任何部分(例如，抗體或適體）。在一些實施例中，結(jié)合配偶體是一 種蛋白質(zhì)。包含一種連接至對接鏈的蛋白質(zhì)(或肽)的BP-ΝΑ-偶聯(lián)物可以在此稱為"蛋白質(zhì)-核酸偶聯(lián)物"或"蛋白質(zhì)-NA偶聯(lián)物。"用于本發(fā)明偶聯(lián)物的蛋白質(zhì)的實例包括但不限于:抗 體(例如，單克隆抗體）、抗原結(jié)合抗體片段(例如，F(xiàn)ab片段）、受體、肽以及肽適體。其他結(jié)合 配偶體可根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行使用。例如，在此設(shè)想通過靜電（例如，靜電顆粒）、疏水性或磁性 (例如，磁性顆粒)相互作用結(jié)合到靶標(biāo)上的結(jié)合配偶體。
[0082] 如在此所使用的，"抗體"包括全長抗體和它的任何抗原結(jié)合片段(例如，"抗原結(jié) 合部分"）或單鏈。術(shù)語"抗體"包括但不限于一種包含通過二硫鍵相互連接的至少兩個重 (H)鏈和兩個輕(L)鏈的糖蛋白，或其抗原結(jié)合部分?？贵w可以是多克隆或單克隆的；異種 (xenogeneic)、同種異體(allogeneic)、或同基因的（syngeneic);或其修飾形式(例如，人 源化的、嵌合的）。
[0083] 如在此所使用的，一個抗體的"抗原結(jié)合部分"是指抗體的保留特異性結(jié)合到抗原 上的能力的一個或多個片段?？贵w的抗原結(jié)合功能可以由全長抗體的片段執(zhí)行。涵蓋于術(shù) 語抗體的"抗原結(jié)合部分"中的結(jié)合片段的實例包括（i)Fab片段，一種由Vh、V l、Cl以及(^結(jié) 構(gòu)域組成的單價片段；（ii)F(ab'）2片段，一種包含通過二硫橋在鉸鏈區(qū)處連接的兩個Fab 片段的二價片段；（iii)一種由Vh和Chi結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；（iv)-種由抗體的單臂的Vh和 結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段，（v)-種由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段（沃德（Ward)等人，自然 (Nature)341:544 546,1989);以及(vi)-個分離的互補(bǔ)性決定區(qū)（Q)R)，或(vii)可任選地 通過合成接頭連接的兩個或更多個分離的CDR的一個組合。此外，雖然Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域 VH和VL是通過獨立的基因編碼的，但是這兩個結(jié)構(gòu)域可以使用重組方法通過合成接頭接合， 該合成接頭能夠使其制成其中Vh和Vl區(qū)配對以形成單價分子的單蛋白質(zhì)鏈(稱為單鏈Fv (scFv);參見，例如伯德(Bird)等人，科學(xué)（Science)242:423 426，1988;和休斯頓(Huston) 等人，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl .Acad. Sci .USA)85:5879-5883，1988)。這類單鏈抗 體也涵蓋于術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"范圍內(nèi)。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)，獲 得這些抗體片段，并且按照與完整抗體相同的方式篩選所述片段的有用性。
[0084] 如在此所使用的，"受體"是指結(jié)合到配體(諸如，例如，肽或小分子(例如，低分子 量(〈900道爾頓)的有機(jī)或無機(jī)化合物））上的細(xì)胞來源的分子(例如，蛋白質(zhì)）。
[0085] 如在此所使用的，"肽適體"是指一種具有插入恒定支架蛋白質(zhì)的可變肽序列的分 子(參見例如，貝恩斯(Baines) 1C等人，今日藥物發(fā)現(xiàn)(Drug Discov.Today) 11:334-341， 2006) 〇
[0086] 在一些實施例中，BP-ΝΑ偶聯(lián)物的分子是一種核酸(諸如，例如，一種核酸適體）。如 在此所使用的，"核酸適體"是指一種可以形成能夠特異性結(jié)合到蛋白質(zhì)或其他細(xì)胞靶標(biāo)上 的二級和三級結(jié)構(gòu)的小RNA或DNA分子(參見例如，倪(Ni)X等人，當(dāng)今醫(yī)藥化學(xué)（Curr Med Chem) 18(27) :4206-4214,2011)。因此，在一些實施例中，BP-ΝΑ偶聯(lián)物可以是一種適體-核 酸偶聯(lián)物。
[0087] 本發(fā)明的一些實施例使用靶標(biāo)識別部分來鑒定和標(biāo)記靶標(biāo)。靶標(biāo)識別部分是特異 性識別樣品中感興趣的靶標(biāo)的試劑。靶標(biāo)識別部分的實例包括諸如在此列舉的那些的結(jié)合 配偶體。靶標(biāo)識別部分包括抗體、抗體片段以及諸如單鏈抗體、單鏈Fv結(jié)構(gòu)域、Fab結(jié)構(gòu)域、 納米抗體等的抗體衍生物、肽、適體、以及寡核苷酸(例如，以便在諸如熒光原位雜交或FISH 的過程中檢測感興趣的核酸）。
[0088]諸如對接鏈的對接核酸
[0089] 本發(fā)明的某些實施例可涉及對接核酸。對接核酸包括如在此描述的對接鏈。對接 核酸是能夠結(jié)合到具有互補(bǔ)序列的核酸(諸如，成像核酸)上的線性核酸。對接核酸可包含 或可由DNA、RNA或具有其他磷酸酯-糖主鏈(例如2 ' -0-甲基RNA、2 ' -氟(2 ' -f luoral )RNA、 LNA、XNA)或包含非磷酸酯-糖部分的主鏈(例如，肽核酸和嗎啉代)的核酸樣結(jié)構(gòu)構(gòu)成。核堿 基可包括天然發(fā)生的核堿基，諸如腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶、肌苷以及它們的衍生 物，以及非天然發(fā)生的核堿基，諸如丨8〇(：、丨8〇6、(1?以及(12。當(dāng)未結(jié)合到它的互補(bǔ)成像核酸上 時，對接核酸可以是單鏈而沒有穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)?？商娲兀瑢雍怂峥砂ㄖT如發(fā)夾環(huán)的 二級結(jié)構(gòu)（圖7,頂部）。對接核酸可以是多鏈復(fù)合物的一部分(圖7,底部）。
[0090] 如在此所使用的，"對接鏈"是指一種能夠穩(wěn)定地結(jié)合到它的互補(bǔ)成像鏈上的單鏈 核酸(例如，DNA)。穩(wěn)定的結(jié)合可以是對接鏈（以及相反的成像鏈）的長度的結(jié)果，或者它可 以是在其下發(fā)生雜交的具體條件(例如，鹽濃度、溫度等）的結(jié)果。在一些實施例中，對接鏈 的長度為約20至60個，或更多個核苷酸。對接鏈可以能夠結(jié)合到(具有相同序列和相同地標(biāo) 記的）一個或多個相同的成像鏈上。
[0091] 諸如成像鏈的成像核酸
[0092] 本發(fā)明的某些實施例可涉及成像核酸。成像核酸包括如在此描述的成像鏈。成像 核酸是可以（1)經(jīng)由序列特異的互補(bǔ)性與對接核酸相互作用，并且(2)通過共價或非共價相 互作用募集一個信號發(fā)射部分或多個信號發(fā)射部分拷貝的核酸。如在此說明的，成像核酸 可以是直鏈或支鏈的。一個成像核酸可經(jīng)由一個聚合結(jié)構(gòu)（圖8,頂部)或樹枝狀結(jié)構(gòu)（圖8， 底部)募集多個信號發(fā)射部分拷貝。例如，可以使用諸如在納澤米(Nazemi)A.等人，生物偶 聯(lián)物的化學(xué)：合成、表征與生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用（Chemistry of Bioconjugates:Synthesis, Characterization,and Biomedical Applications)，在線發(fā)布：2014年2月 13 日）中討論的 方法以及其中提供的參考來化學(xué)合成聚合或樹枝狀結(jié)構(gòu)?？商娲?，可以通過如例如在德 克斯(Dirks)R.等人，美國國家科學(xué)院院刊，2004; 1010(43) :15275-78 ;以及在烏姆(Um) s.Η.等人，自然研究步驟(Nat.Protocols)2006; 1:995-1000(所述參考各自通過引用結(jié)合 在此)中示出的DNA雜交來形成聚合或樹枝狀結(jié)構(gòu)。
[0093]成像核酸可包含或可由DNA、RNA或具有其他磷酸酯-糖主鏈(例如2'-0_甲基RNA、 2'-氟(2'-丨111〇^1)1?^、^^4~4)或包含非磷酸酯-糖部分的主鏈(例如，肽核酸和嗎啉代） 的核酸樣結(jié)構(gòu)構(gòu)成。核堿基可包括天然發(fā)生的核堿基，諸如腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧 啶、肌苷以及它們的衍生物，以及非天然發(fā)生的核堿基，諸如is 〇C、is〇G、dP以及dZ。
[0094] 在一些實施例中，成像核酸的長度為約30至約60個，或更多個核苷酸，包括30、35、 40、45、50、55或60核苷酸的長度。在一些實施例中，成像核酸的長度為30至40、30至50、40至 50、40至60、或50至60個核苷酸。
[0095] 當(dāng)未結(jié)合到它的互補(bǔ)對接核酸上時，成像核酸可以是單鏈而沒有穩(wěn)定的二級結(jié) 構(gòu)。可替代地，成像核酸可包括諸如發(fā)夾環(huán)的二級結(jié)構(gòu)（圖9,頂部）。成像核酸可以是多鏈復(fù) 合物的一部分(圖9,底部）。
[0096] 在一些實施例中，成像鏈可以是自淬滅的，這表明未結(jié)合的成像核酸可攜帶與信 號發(fā)射部分(諸如，熒光團(tuán)）極為接近的淬滅劑部分。為了實現(xiàn)這個目的，成像核酸可以被設(shè) 計為采取一個分子信標(biāo)樣的結(jié)構(gòu)（圖5)或一個半雙鏈體的結(jié)構(gòu)（圖6)。
[0097] 這種自淬滅變化可以用于簡化背景并且/或者避免洗滌步驟。另外地或可替代地， 結(jié)合與成像緩沖液可含有常規(guī)用于FI SH、RNA印跡法以及DNA印跡法中的添加劑(例如，帶負(fù) 電荷的聚合物(諸如葡聚糖硫酸鹽和肝素））以便減少非特異性結(jié)合。
[0098] 如在此所使用的"信號發(fā)射部分"是一個在某些條件下發(fā)射可檢測信號（諸如光 子、福射、正電子、電磁波、以及磁核共振)的部分。
[0099]如在此所使用的，"成像鏈"是一種長度為約30至約60個，或更多個核苷酸的單鏈 核酸(例如，DNA)。本發(fā)明的成像鏈互補(bǔ)于對接鏈并且穩(wěn)定地結(jié)合到對接鏈上。穩(wěn)定的結(jié)合 表明，成像鏈和對接鏈在測定的時長內(nèi)、或者至少30分鐘、或至少60分鐘、或至少2小時、或 更久保持彼此結(jié)合。這種結(jié)合可以是或不是可逆的或不可逆的。
[0100] 在一些實施例中，如果核酸保持彼此結(jié)合(或至少）30、35、40、45、50、55或60分鐘 (min)，則認(rèn)為對接核酸穩(wěn)定地結(jié)合到成像核酸(諸如成像鏈)上。在一些實施例中，如果核 酸保持彼此結(jié)合（或至少）30至60min、30至120min、40至60min、40至120min、或60至120min， 則認(rèn)為對接核酸穩(wěn)定地結(jié)合到成像核酸上。這種結(jié)合可以是或不是可逆的，或者可以是或 不是不可逆的。
[0101]如在此所使用的，"結(jié)合"是指至少兩個分子之間歸因于例如靜電、疏水性、離子 和/或氫鍵相互作用，任選地在生理條件下的一種締合。
[0102] 如果兩個核酸或核酸結(jié)構(gòu)域彼此堿基配對或結(jié)合以便經(jīng)由沃森-克里克(Watson-Crick)相互作用形成一種雙鏈核酸，則它們是彼此"互補(bǔ)的"。
[0103] 在一些實施例中，本發(fā)明的核酸(諸如對接核酸和成像核酸）以"完美互補(bǔ)"彼此結(jié) 合，"完美互補(bǔ)"指的是100%互補(bǔ)(例如，5' -ATTCGC-3'完美互補(bǔ)于5'GCGAAT-3'）。
[0104] 本發(fā)明的成像鏈可用一種可檢測的標(biāo)記(例如，一個熒光標(biāo)記，并且因此被認(rèn)為是 "熒光標(biāo)記的"）來進(jìn)行標(biāo)記。例如，在一些實施例中，成像鏈可包含至少一個（即，一個或多 個)熒光團(tuán)。根據(jù)本發(fā)明使用的熒光團(tuán)的實例包括但不限于:咕噸衍生物(例如，熒光黃素、 羅丹明、俄勒閃綠、伊紅以及得克薩斯紅）、花青衍生物(例如，花青、吲哚碳菁、氧雜碳菁、硫 雜碳菁以及部花青）、萘衍生物(例如，丹磺酰和普羅丹(prodan)衍生物）、香豆素衍生物、噁 二唑衍生物（例如，吡啶基噁唑、硝基苯并噁二唑以及苯并噁二唑）、芘衍生物（例如，瀑布 藍(lán)）、噁嗪衍生物(例如，尼羅紅、尼羅藍(lán)、甲酚紫以及噁嗪170)、吖啶衍生物（例如，原黃素、 吖啶橙以及吖啶黃）、芳基次甲基(ary lmethine)衍生物(例如，金胺、結(jié)晶紫以及孔雀綠）、 以及四吡咯衍生物(例如，撲吩、酞菁以及膽紅素）。
[0105] 可用諸如在此列舉或本領(lǐng)域已知的那些的一種可檢測標(biāo)記來共價地標(biāo)記包括成 像鏈的成像核酸。在一些情況下，包括成像鏈的成像核酸可包括2、3、4、或更多個可檢測的 標(biāo)記(諸如熒光團(tuán)）。
[0106] 包括成像鏈的正交成像核酸可包含一個不同的標(biāo)記(例如，紅色熒光團(tuán)、藍(lán)色熒光 團(tuán)、或綠色焚光團(tuán)），或者它們可以全部包含相同的標(biāo)記(例如，紅色焚光團(tuán)），即使它們的核 苷酸序列不同。
[0107] 諸如結(jié)合配偶體和對接鏈偶聯(lián)物的序列標(biāo)記的靶標(biāo)識別部分
[0108] 在一些實施例中，本發(fā)明的BP-ΝΑ偶聯(lián)物(例如，蛋白質(zhì)-核酸偶聯(lián)物)可包含一個 (例如，共價或非共價)將結(jié)合配偶體連接至對接鏈的中間接頭。該中間接頭可包含生物素 和/或鏈霉抗生物素蛋白。例如，在一些實施例中，一個抗體和一個對接鏈可各自被生物素 化(即，連接至少一個生物素分子)并且通過生物素結(jié)合至一個中間鏈霉抗生物素蛋白分子 來彼此連接。其他中間接頭可根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行使用。在一些實施例中，諸如其中分子是核酸 的那些實施例中，可能不需要中間接頭。例如，BP-ΝΑ偶聯(lián)物的對接鏈可以是一個核酸分子 (諸如，例如，一個核酸適體）的延伸(例如，5'或3'延伸）。類似的方法可用于產(chǎn)生如在此提 供的序列標(biāo)記的靶標(biāo)識別部分。
[0109] 在此提供多個BP-ΝΑ偶聯(lián)物(例如，蛋白質(zhì)-核酸偶聯(lián)物)和成像鏈。多個可以是相 同物種或不同物種的一個群體。相同物種的多個BP-ΝΑ偶聯(lián)物可包括全部結(jié)合到相同靶標(biāo) (例如，生物分子）（例如，相同表位或區(qū)域/結(jié)構(gòu)域)上的偶聯(lián)物。相反地，不同物種的多個 BP-ΝΑ偶聯(lián)物可包括偶聯(lián)物、或偶聯(lián)物的亞組，每個偶聯(lián)物或偶聯(lián)物的亞組結(jié)合到相同靶標(biāo) 上的不同表位上或結(jié)合到不同靶標(biāo)上。相同物種的多個成像鏈可包括具有相同核苷酸序列 和相同熒光標(biāo)記(例如，Cy2、Cy3或Cy4)的成像鏈。相反地，不同物種的多個成像鏈可包括具 有不同核苷酸序列（例如，DNA序列）和不同熒光標(biāo)記(例如，Cy2、Cy3或Cy4)，或者具有不同 核苷酸序列和相同熒光標(biāo)記(例如，都是Cy2)的成像鏈。在一個給定的多個BP-ΝΑ偶聯(lián)物中 的不同物種的數(shù)目受到結(jié)合配偶體(例如，抗體）的數(shù)目和具有不同核苷酸序列的對接鏈 (并且因此互補(bǔ)成像鏈)的數(shù)目的限制。在一些實施例中，多個BP-ΝΑ偶聯(lián)物(例如，蛋白質(zhì)-核酸偶聯(lián)物）包含至少 10、50、100、500、1000、2000、3000、4000、5000、104、50000、105、10 5、 106、107、108、109、10 1()、1011個BP-ΝΑ偶聯(lián)物。類似地，在一些實施例中，多個熒光標(biāo)記的成像 鏈包含至少 10、50、100、500、1000、2000、3000、4000、5000、104、50000、105、10 5、106、107、108、 10^1(^^10 11個熒光標(biāo)記的成像鏈。在一些實施例中，多個可含有1至約200個或更多個不同 物種的BP-ΝΑ偶聯(lián)物和/或成像鏈。例如，多個可以含有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、 25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200或更多個不同 的物種。在一些實施例中，多個可含有少于約5至約200個不同物種的BP-ΝΑ偶聯(lián)物和/或成 像鏈。例如，多個可以含有小于5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、 75、80、85、90、95、100、125、150、175或200個不同的物種。這些實施例適用于如在此提供的 序列標(biāo)記的靶標(biāo)識別部分。
[0110]信號或成像核酸滅活
[0111] 為了在在此提供的方法的一些中實現(xiàn)成像核酸滅活，可通過諸如但不限于升高溫 度;減小反離子(例如，游離Mg++)的濃度；引入或增大變性劑(例如甲酰胺、尿素、DMS0等）的 濃度；以及化學(xué)地、光化學(xué)地或酶促地裂解、修飾或降解成像鏈，或它們的任意組合的手段， 來將成像核酸(包括成像鏈)從靶標(biāo)識別部分(包括結(jié)合配偶體)中去除（圖3)。
[0112] 為了在在此提供的方法的一些中實現(xiàn)成像核酸滅活，可通過去除并且/或者修飾 該信號發(fā)射部分而不將成像核酸的全部核酸部分從對接鏈去除來滅活這些成像核酸(包括 成像鏈）。（圖4.)
[0113] 作為一個實例，可通過將成像鏈裂解成多個部分來促進(jìn)成像核酸的去除。在一些 實施例中，成像核酸包含一個化學(xué)可裂解部分，該化學(xué)可裂解部分可以通過引入作用于這 種可裂解部分上的化合物而裂解。此類化學(xué)可裂解部分的實例包括但不限于可以由某些基 于Pd的試劑裂解的烯丙基基團(tuán)（周（Ju)J.等人，美國科學(xué)院院報，2006年12月26日；103 (52): 19635-40,該參考通過引用結(jié)合在此）；可以由某些基于磷的試劑(諸如TCEP)裂解的 疊氮基基團(tuán)，（郭(Guo)J等人，美國科學(xué)院院報，2008年7月8日；105(27): 9145-50,該參考通 過引用結(jié)合在此）；可以由基于銀的試劑裂解的橋接硫代磷酸酯(瑪格(Mag)M.等人，核酸研 究(Nucleic Acids Res)，1991年4月11日；19(7) :1437-41，該參考通過引用結(jié)合在此）；可 由諸如DTT和TCEP的還原劑裂解的二硫鍵；以及可由諸如氫氧化物和咪唑的各種親核試劑 裂解的核糖。
[0114] 在一些實施例中，該成像核酸包含一種可以光化學(xué)地(例如，通過UV暴露)裂解的 可光裂解接頭。在一些實施例中，該成像核酸含有一個可以由一種酶裂解的部分。此類酶促 可裂解部分的實例包括但不限于可以由各種核糖核酸酶裂解的核糖核苷酸；可以由諸如 USER(新英格蘭生物實驗室(New England Biolabs))的酶組合裂解的脫氧尿苷；以及可以 由序列特異性切口酶或限制性內(nèi)切酶裂解的限制性酶切位點。在一些實施例中，該限制性 內(nèi)切酶可裂解成像核酸和對接核酸兩者。在仍然其他實施例中，可通過將成像核酸修飾成 一種使對接核酸結(jié)合以便形成一個具有降低的穩(wěn)定性(或降低的溶解溫度）的雙鏈體的形 式來促進(jìn)成像核酸的去除。
[0115] 作為一個實例，該成像核酸包含可以光異構(gòu)化的偶氮苯，其中不同異構(gòu)體不同地 影響成像核酸對于對接核酸的結(jié)合強(qiáng)度（淺沼（Asanuma)H.等人，應(yīng)用化學(xué)英語國際版 (Angew Chem Int Ed Engl)，2001 年7月 16日；40(14):2671-2673,該參考通過引用結(jié)合在 此）。在一些實施例中，該成像核酸包含一種脫氧尿苷，其中尿嘧啶基團(tuán)可由尿嘧啶-DNA糖 基化酶裂解。在去除尿嘧啶后，成像鏈的結(jié)合強(qiáng)度減弱。
[0116] 可替代地，可以通過將成像核酸與信號發(fā)射部分之間的接頭（如果存在這樣的接 頭)裂解來實現(xiàn)信號發(fā)射部分的去除。在此描述的化學(xué)物質(zhì)也可以用于此目的。
[0117] 可以通過化學(xué)地或光化學(xué)地修飾信號發(fā)射部分來實現(xiàn)該信號發(fā)射部分的滅活。例 如，當(dāng)該信號發(fā)射部分是一個熒光團(tuán)時，可以通過化學(xué)試劑（諸如例如過氧化氫，格迪斯 (Gerdes)M.等人，美國科學(xué)院院報2013年7月16日；110(29): 11982-87,該參考通過引用結(jié) 合在此)來將其漂白或?qū)ζ溥M(jìn)行光漂白（例如，使用如在舒伯特(SchuberOW.等人，自然生 物技術(shù)(Nat.Biotech. )2006;24:1270-78中描述的軟多波長激發(fā)，該參考通過引用結(jié)合在 此)。
[0118] 如在本領(lǐng)域中將理解的，"光漂白"是指一個染料或熒光團(tuán)分子的光化學(xué)改變，從 而使得它不能發(fā)出熒光。這是由熒光團(tuán)與周圍分子之間的共價鍵裂解或非特異性反應(yīng)而導(dǎo) 致的。在一些實施例中，可以通過降低曝光的強(qiáng)度或時間間隔，通過增大熒光團(tuán)的濃度，通 過降低輸入光的頻率并因此降低其光子能量，或者通過采用不太容易漂白的更加牢固的熒 光團(tuán)（例如Alexa Fluors或DyLight Fluors)，來控制由光漂白導(dǎo)致的活性損失。參見，例 如，Ghauharali R.等人，顯微鏡學(xué)雜志（Journal of Microscopy)2001; 198:88-100;和格 林(Eggeling)C.等人，分析化學(xué)(Analytical Chemistry) 1998;70:2651-59。
[0119] 因此，光漂白可用于去除、修飾或在一些情況下消滅來自信號發(fā)射部分的信號。可 通過將熒光團(tuán)暴露于具有適合波長、能量和持續(xù)時間的光的波長來進(jìn)行光漂白，以便永久 且不可逆地消滅熒光團(tuán)進(jìn)一步發(fā)射信號的能力。光漂白技術(shù)是本領(lǐng)域中已知的。
[0120] 還發(fā)現(xiàn)，與通常能夠在低于生理溫度的寬范圍溫度（即，0°C至37°C)下結(jié)合到它們 的靶標(biāo)上并且可以忍受鹽濃度的輕微變化（即，從10mM至1M的單價陽離子濃度;從0至10mM 的二價陽離子濃度）的抗體不同，短核酸雜交的親和力取決于溫度和鹽濃度。例如，在23°C 下，在具有5〇〇mM[Na+]和1 OmM[Mg++]濃度下，ssDNA 5 '-CATCTAAAGCC-3 '與它的反向互補(bǔ)鏈 5'-GGCTTTAGATG-3'之間的預(yù)測解離常數(shù)（使用參考PMID 15139820概述的參數(shù)集）是~ 90pM。換句話說，在此條件下，該結(jié)合是非常強(qiáng)的。在37°C下，在具有150mM[Na+]和0mM[Mg+ + ]下，此ssDNA對的預(yù)測解離常數(shù)高達(dá)~500nM。換句話說，在此條件下，該結(jié)合是相當(dāng)弱的。 這兩種條件的解離常數(shù)改變近4個數(shù)量級，盡管預(yù)期大多數(shù)抗體在兩種條件下都強(qiáng)力地結(jié) 合到它們的靶標(biāo)上。針對其他DNA序列觀察到類似的趨勢（圖10)。作為一個另外的實例，成 像條件可以是23°C、具有500mM[Na+]和10mM[Mg++]，并且染料滅活條件可以是37°C、具有 150mM[Na+]和0mM[Mg++]。
[0121] 在一些實施例中，被分析的樣品是培養(yǎng)的細(xì)胞、組織切片、或來自活生物體的其他 樣品。
[0122] 在一些實施例中，該樣品是固定(包括單獨固定)在一個固體表面(例如，玻璃載片 或蓋玻片)上的解離細(xì)胞。例如，樣品可以是血液中的細(xì)胞。例如，樣品可含有在血液中循環(huán) 的癌細(xì)胞(也稱為循環(huán)腫瘤細(xì)胞，或CTC)。樣品可以是在懸浮液中生長的細(xì)胞。樣品可以是 從一個固體組織散播的細(xì)胞。
[0123] 樣品
[0124] "樣品"可包括細(xì)胞（或一個細(xì)胞）、組織、或諸如血液(血清和/或血漿）、尿液、精 液、淋巴液、腦脊髓液或羊水的體液。樣品可得自（或來源于)任何來源，包括但不限于人類、 動物、細(xì)菌、病毒、微生物以及植物。在一些實施例中，樣品是細(xì)胞裂解物或組織裂解物。樣 品還可含有來自一個來源或不同來源的材料的混合物。樣品可以是一個空間區(qū)域或體積 (例如，一個陣列上的網(wǎng)格、或一個板或盤中的孔）。在一些實施例中，樣品包括一個或多個 靶標(biāo)、一個或多個BP-ΝΑ偶聯(lián)物、以及一個或多個成像鏈。這些細(xì)胞可以是散播的（或解離 的)細(xì)胞。
[0125] 靶標(biāo)
[0126] "靶標(biāo)"是希望觀察或量化并且存在其結(jié)合配偶體的任何部分。在一些實施例中， 靶標(biāo)可以是非天然存在的。在一些實施例中，靶標(biāo)可以是一種生物分子。如在此所使用的， "生物分子"是可由一個活生物體產(chǎn)生的任何分子，包括大的大分子，諸如蛋白質(zhì)、多糖、月旨 質(zhì)以及核酸(例如，DNA和RNA(諸如mRNA))，以及小分子，諸如初級代謝產(chǎn)物、次級代謝產(chǎn)物、 以及天然產(chǎn)物。生物分子的實例包括但不限于:〇嫩3祖、〇0嫩、或經(jīng)受逆轉(zhuǎn)錄的8祖的0嫩產(chǎn) 物、A23187(卡西霉素、鈣離子載體）、阿維菌素、松香酸、醋酸、乙酰膽堿、肌動蛋白、放線菌 素 D、腺苷、腺苷二磷酸(ADP)、腺苷一磷酸(AMP)、腺苷三磷酸(ATP)、腺苷酸環(huán)化酶、側(cè)金盞 花醇、腎上腺素(Adrenaline)、腎上腺素(epinephrine)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、水母發(fā) 光蛋白（Aequorin)、黃曲霉毒素、瓊脂、丙甲菌素、丙氨酸、白蛋白、醛固酮、糊粉 (Aleuroneha-毒蕈環(huán)肽、尿囊素、丙烯菊酯、α-鵝膏蕈堿(α-Amanatin)、氨基酸、淀粉酶、促 蛋白合成類固醇(Anabolic steroid)、茴香腦、血管緊張素原、茴香霉素、抗利尿素(ADH)、 阿拉伯糖、精氨酸、子囊霉素、抗壞血酸(維生素 C)、天冬酰胺、天冬氨酸、不對稱二甲基精氨 酸、心房鈉尿肽(ANP)、生長素、抗生物素蛋白、印楝素 A-C35H44016、細(xì)菌素、白僵菌素、荷苞 牡丹堿、膽紅素、生物聚合物、生物素(維生素 H)、布雷菲德菌素 A、布拉西諾內(nèi)酯、馬錢子堿、 尸胺、咖啡因、鈣化醇(維生素 D)、降鈣素、鈣調(diào)蛋白、鈣調(diào)蛋白、鈣網(wǎng)蛋白、樟腦-(C10H160)、 大麻酚、辣椒素、糖酶、碳水化合物、肉毒堿、角叉菜膠、酪蛋白、半胱天冬酶、纖維素酶、纖維 素-(C6H1005)、淺藍(lán)菌素、西曲溴銨(Cetrimide)-C19H42BrN、白屈菜赤堿、色霉素 A3、伴侶 蛋白、甲殼質(zhì)、氯醛糖、葉綠素、縮膽囊素(CCK)、膽固醇、膽堿、硫酸軟骨素、肉桂醛、檸檬 醛、檸檬酸、橘霉素、香茅醛、香茅醇、瓜氨酸、鈷胺素(維生素 Β12)、輔酶、輔酶Q、秋水仙堿、 膠原質(zhì)、毒芹堿、皮質(zhì)類固醇、皮質(zhì)酮、促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素(CRH)、皮質(zhì)醇、肌酸、肌酸 激酶、晶狀體蛋白、α-環(huán)糊精、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、環(huán)巴胺、環(huán)匹阿尼酸、半胱氨酸、胱氨酸、 胞啶、細(xì)胞松弛素、細(xì)胞松弛素 Ε、細(xì)胞色素、細(xì)胞色素 C、細(xì)胞色素 c氧化酶、細(xì)胞色素 c過氧 化物酶、細(xì)胞因子、胞嘧啶-C4H5N30、脫氧膽酸、D0N(脫氧雪腐鐮刀菌烯醇）、脫氧呋喃核糖、 脫氧核糖、脫氧核糖核酸（DNA)、右旋糖酐、糊精、DNA、多巴胺、酶、麻黃素、腎上腺素-C9H13N03、芥酸-CH3(CH2)7CH=CH(CH2)11C00H、赤蘚糖醇、促紅細(xì)胞生成素(EP0)、雌二醇、 丁子香酚、脂肪酸、纖維蛋白、纖連蛋白、葉酸（維生素 M)、促卵泡激素(FSH)、甲醛、甲酸、 Formnoci、果糖、伏馬菌素 B1、丙種球蛋白、半乳糖、丙種球蛋白、γ -氨基丁酸、γ -丁內(nèi)酯、 γ-羥基丁酸酯（GHB)、胃泌素、明膠、香葉醇、球蛋白、胰高血糖素、葡萄糖胺、葡萄糖-C6H1206、葡糖氧化酶、谷蛋白、谷氨酸、谷氨酰胺、谷胱甘肽、谷蛋白、甘油（丙三醇）、甘氨 酸、糖原、乙醇酸、糖蛋白、促性腺激素釋放激素(GnRH)、粒酶、綠色熒光蛋白質(zhì)、生長激素、 生長激素釋放激素(GHRH)、GTP酶、鳥嘌呤、鳥苷、鳥苷三磷酸(+GTP)、觸珠蛋白、蘇木精、血 紅素、蚯蚓血紅蛋白、血藍(lán)蛋白、血紅蛋白、血紅素蛋白、硫酸乙酰肝素、高密度脂蛋白、HDL、 組胺、組氨酸、組蛋白、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、HLA抗原、高半胱氨酸、激素、絨毛膜促性腺激素 (hCG)、人類生長激素、透明質(zhì)酸鹽、透明質(zhì)酸酶、過氧化氫、5-羥甲基胞嘧啶、羥基脯氨酸、 5-羥色胺、靛藍(lán)染料、吲哚、肌苷、肌醇、胰島素、胰島素樣生長因子、膜內(nèi)在蛋白、整合酶、整 合蛋白、內(nèi)含肽、干擾素、菊粉、離子霉素、紫羅酮、異亮氨酸、鐵硫簇、K252a、K252b、KT5720、 ΚΤ5823、角蛋白、激酶、乳糖酶、乳酸、乳糖、羊毛脂、月桂酸、瘦素、來普霉素 Β、亮氨酸、木質(zhì) 素、檸檬烯、芳樟醇、亞油酸、亞麻酸、脂肪酶、脂質(zhì)、脂質(zhì)錨定蛋白、硫辛酰胺、脂蛋白、低密 度脂蛋白LDL、促黃體生成素(LH)、番茄紅素、賴氨酸、溶菌酶、蘋果酸、麥芽糖、褪黑激素、膜 蛋白、金屬蛋白、金屬硫蛋白、蛋氣酸、含羞草氣酸、光神霉素 Α、絲裂霉素 C、單體、霉酸酸、肌 紅蛋白、肌球蛋白、天然酚類、核酸、赭曲霉毒素 Α、雌激素、寡肽、寡霉素、地衣酚、阿立新素、 鳥氨酸、草酸、氧化酶、催產(chǎn)素、P53、PABA、紫杉醇、棕櫚酸、泛酸(維生素 B5)、甲狀旁腺激素 (PTH)、副蛋白、摩西魚毒肽、小白菊內(nèi)酯、展青霉素、蕈青霉素、青霉酸、盤尼西林、青霉震顫 素 A、肽酶、胃蛋白酶、肽、表霉素、外周膜蛋白、Perosamine、苯乙胺、苯丙氨酸、磷酸肌酸、磷 酸酶、磷脂、苯丙氨酸、植酸、植物激素、多肽、多酚、多糖、撲啉、朊病毒、黃體酮、促乳素 (PRL)、脯氨酸、丙酸、魚精蛋白、蛋白酶、蛋白質(zhì)、類蛋白、腐胺、除蟲菊酯、吡哆醇或吡哆胺 (維生素 B6)、吡咯賴氨酸、丙酮酸、醌、根赤殼菌素、棉子糖、腎素、視黃醛、視黃醇(維生素 A)、視紫紅(視紫紅質(zhì)）、核黃素(維生素 B2)、呋喃核糖、核糖、核酶、蓖麻毒蛋白、RNA-核糖核 酸、RuBisCO、黃樟素、水楊醛、水楊酸、丹酸-4(3&1￥；[1101'；[11-4)-023!12808、阜苷、分泌素、硒 代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、含硒蛋白質(zhì)、絲氨酸、絲氨酸激酶、血清素、糞臭素、信號識別顆 粒、生長抑素、山梨酸、角鯊烯、星形孢菌素、硬脂酸、雜色曲霉素、留醇、番木鱉堿 (Strychnine)、蔗糖(糖）、糖類(一般來說）、超氧化物、T2毒素、鞣酸、丹寧酸、酒石酸、?；?酸、河豚毒素、奇甜蛋白、拓?fù)洚悩?gòu)酶、酪氨酸激酶、?；撬?、睪酮、四氫大麻酚(THC)、河豚毒 素、毒胡蘿卜素、奇甜蛋白、硫胺素(維生素 B1)_C12H17C1N40S · HC1、蘇氨酸、促血小板生成 素、胸苷、胸腺嘧啶、三氮菌素 C、促甲狀腺激素(TSH)、促甲狀腺素釋放激素(TRH)、甲狀腺素 (T4)、生育酚(維生素 E)、拓?fù)洚悩?gòu)酶、三碘甲腺原氨酸(T3)、跨膜受體、曲古抑菌素 A、促激 素、胰蛋白酶、色氨酸、微管蛋白、衣霉素、酪氨酸、泛激素、尿嘧啶、尿素、脲酶、尿酸-C5H4N403、尿苷、繳氨酸、繳氨霉素、f凡綁定蛋白（Vanabins )、加壓素、震顫真菌毒素 (Verruculogen)、維生素(一般來說）、維生素 A(視黃醇）、維生素 B、維生素 Bl(硫胺素）、維生 素 B2(核黃素）、維生素 B3(煙酸或尼克酸）、維生素 B4(腺嘌呤）、維生素 B5(泛酸）、維生素 B6 (吡哆醇或吡哆胺）、維生素 B12(鈷胺素）、維生素 C(抗壞血酸）、維生素 D(鈣化醇）、維生素 E (生育酚）、維生素 F、維生素 H(生物素）、維生素 K(萘醌）、維生素 Μ(葉酸）、渥曼青霉素以及木 糖。
[0127]在一些實施例中，一個靶標(biāo)可以是一個蛋白質(zhì)靶標(biāo)，諸如例如，一種細(xì)胞環(huán)境的蛋 白質(zhì)（例如，細(xì)胞內(nèi)的或膜蛋白）。蛋白質(zhì)的實例包括但不限于:纖維狀蛋白質(zhì)，諸如細(xì)胞支 架蛋白質(zhì)（例如，肌動蛋白、arp2/3、冠蛋白、肌養(yǎng)蛋白、FtsZ、角蛋白、肌球蛋白、伴肌動蛋 白、血影蛋白、tau蛋白、肌聯(lián)蛋白、原肌球蛋白、微管蛋白以及Jj父原質(zhì)），以及細(xì)胞外基質(zhì)蛋 白（例如，膠原質(zhì)、彈性蛋白、底板反應(yīng)蛋白（f-spondin)、皮卡丘素(pikachurin)、以及纖連 蛋白）；球狀蛋白質(zhì)，諸如血漿蛋白質(zhì)（例如，血清淀粉樣蛋白P成分和血清白蛋白）、凝血因 子(例如，補(bǔ)體蛋白質(zhì)、C1-抑制劑以及C3-轉(zhuǎn)化酶、因子VIII、因子XIII、纖維蛋白、蛋白質(zhì)C、 蛋白質(zhì)S、蛋白質(zhì)Z、蛋白質(zhì)Z相關(guān)蛋白酶抑制劑、凝血酶、血管假性血友病因子），以及急性期 蛋白質(zhì)，諸如C反應(yīng)蛋白質(zhì)；血紅素蛋白；細(xì)胞粘附蛋白（例如，|丐粘蛋白、室管|旲蛋白 (ependymin)、整合蛋白、Ncam以及選擇蛋白）；跨膜運輸?shù)鞍踪|(zhì)(例如，CFTR、血型糖蛋白D和 混雜酶(scramblase))，諸如離子通道(例如，配體門控離子通道，諸如煙堿型乙酰膽堿受體 和GABAa受體，以及電壓門控離子通道，諸如鉀、鈣和鈉通道），同向運輸/反向運輸?shù)鞍踪|(zhì) (例如，葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白）；激素和生長因子(例如，表皮生長因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長因 子(FGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、肽類激素（諸如胰島素、胰島素樣生長因子以及催產(chǎn) 素）以及類固醇激素(諸如雄激素、雌激素和黃體酮）；受體，諸如跨膜受體(例如，G蛋白偶聯(lián) 受體、視紫紅)和細(xì)胞內(nèi)受體(例如，雌激素受體）;DNA結(jié)合蛋白質(zhì)(例如，組蛋白、魚精蛋白、 CI蛋白）；轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物(例如，(3-1^(：、？(^?2^(??3、1^〇0以及？53);免疫系統(tǒng)蛋白質(zhì)（例如，免 疫球蛋白、主要組織相容性抗原以及T細(xì)胞受體）；營養(yǎng)物儲存/轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)(例如，鐵蛋白）； 伴侶蛋白；以及酶。
[0128] 在一些實施例中，靶標(biāo)可以是一種核酸靶標(biāo)，諸如，例如，細(xì)胞環(huán)境的核酸。如關(guān)于 靶標(biāo)、對接鏈、以及成像鏈在此使用的，"核酸"是指具有任何長度的核苷酸的聚合物形式， 諸如脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或它們的類似物。例如，核酸可以是DNA、RNA、或經(jīng)受逆 轉(zhuǎn)錄的RNA的DNA產(chǎn)物。核酸的非限制性實例包括:基因或基因片段的編碼或非編碼區(qū)、由連 鎖分析限定的基因座、外顯子、內(nèi)含子、信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)移RNA、核糖體RNA、核酶、cDNA、重 組核酸、支化核酸、質(zhì)粒、載體、具有任何序列的分離DNA、具有任何序列的分離RNA、核酸探 針、以及引物。核酸的其他實例包括但不限于:cDNA、適體、肽核酸（叩祖"）、2'-5'0嫩(一種 具有縮短主鏈的合成材料，該主鏈具有匹配DNA的A構(gòu)象的堿基間隔；2'-5'DNA通常將不會 與為B形式的DNA雜交，但它將容易地與RNA雜交）、鎖核酸（"LNA"）、以及具有修飾主鏈的核 酸(例如，天然存在的核酸的堿基修飾或糖修飾形式）。核酸可包含修飾的核苷酸，諸如甲基 化的核苷酸和核苷酸類似物(嘌呤和嘧啶的"類似"形式在本領(lǐng)域中是熟知的）。如果存在對 核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾，那么在組裝聚合物之前或之后進(jìn)行。核酸可以是一種單鏈、雙鏈、部分 單鏈、或部分雙鏈的DNA或RNA。
[0129] 在一些實施例中，核酸(例如，核酸靶標(biāo))是天然存在的。如在此所使用的，"天然存 在"是指一種在沒有人為干預(yù)的情況下，存在于在自然界中存在的生物體或病毒中的核酸。 在一些實施例中，核酸天然存在于一種生物體或病毒中。在一些實施例中，核酸是基因組 DNA、信使RNA、核糖體RNA、微小RNA、前微小RNA( pre-mi cr〇-RNA)、原微小RNA(pr〇-micr〇-RNA)、病毒DNA、病毒RNA或piwi-RNA。在一些實施例中，核酸靶標(biāo)不是一種合成DNA納米結(jié)構(gòu) (例如，包含通過沃森-克里克相互作用彼此雜交以形成2-D或3-D納米結(jié)構(gòu)的兩個或更多個 核酸的二維(2-D)或三維(3-D)DNA納米結(jié)構(gòu)）。
[0130] 在此描述的核酸對接鏈和成像鏈可以是以上描述的核酸(例如，DNA、RNA、修飾核 酸、核酸類似物、天然存在的核酸、合成核酸）中的任意一種。
[0131] 組合物
[0132] 在此提供的組合物包含至少一個或至少兩個(例如，多個)本發(fā)明的BP-ΝΑ偶聯(lián)物 (例如，蛋白質(zhì)-核酸偶聯(lián)物）ΑΡ-ΝΑ偶聯(lián)物可結(jié)合到一個感興趣的靶標(biāo)(例如，生物分子)上 并且/或者穩(wěn)定結(jié)合到一個互補(bǔ)的熒光標(biāo)記的成像鏈上。組合物可包含多個相同物種或不 同物種的BP-ΝΑ偶聯(lián)物。在一些實施例中，一種組合物可包含至少10、50、100、500、1000、 2000、3000、4000、5000、10 4、50000、105、105、106、107、10 8、109、101()、1011個8?-嫩偶聯(lián)物。在一 些實施例中，一種組合物可包含至少 1〇、50、100、500、1000、2000、3000、4000、5000、104、 5000(^10^10^10^10^10^10^1(^^10 11個互補(bǔ)的熒光標(biāo)記的成像鏈。在一些實施例中， 一種組合物可含有1至約200個或更多個不同物種的BP-ΝΑ偶聯(lián)物和/或成像鏈。例如，一種 組合物可以含有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、 75、80、85、90、95、100、125、150、175、200或更多個不同的物種。在一些實施例中，一種組合 物可含有少于約5至約200個不同物種的BP-ΝΑ偶聯(lián)物和/或成像鏈。例如，一種組合物可以 含有小于5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、 125、150、175或200個不同的物種。
[0133] 應(yīng)當(dāng)理解，組合物中的互補(bǔ)的熒光標(biāo)記的成像鏈的數(shù)目可小于、等于或大于組合 物中BP-ΝΑ偶聯(lián)物的數(shù)目。
[0134]試劑盒
[0135] 本發(fā)明進(jìn)一步提供包括一種或多種本發(fā)明組分的試劑盒。試劑盒可包括，例如， BP-ΝΑ偶聯(lián)物和/或熒光標(biāo)記的成像鏈。試劑盒還可包括用于產(chǎn)生BP-ΝΑ偶聯(lián)物或用于標(biāo)記 成像鏈的組分。例如，試劑盒可包括結(jié)合配偶體(例如，抗體）、對接鏈和中間接頭(諸如，例 如，生物素和鏈霉抗生物素蛋白分子）、和/或成像鏈。試劑盒可以用于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯 知曉的目的，包括以上描述的那些。
[0136] 試劑盒可包括其他試劑，以及例如，用于進(jìn)行雜交反應(yīng)的緩沖液。試劑盒還可包括 用于使用試劑盒組分、和/或用于制作和/或使用BP-ΝΑ偶聯(lián)物和/或經(jīng)標(biāo)記成像鏈的說明 書。
[0137] 應(yīng)用
[0138] 本發(fā)明的BP-ΝΑ偶聯(lián)物(例如，蛋白質(zhì)-核酸偶聯(lián)物或抗體-核酸偶聯(lián)物)可以尤其 在其中使用現(xiàn)有的靶標(biāo)檢測技術(shù)的任何測定中使用。
[0139] 典型地，測定包括以下檢測測定:包括診斷測定、預(yù)后測定、患者監(jiān)測測定、篩選測 定、生物戰(zhàn)測定、法醫(yī)分析測定、產(chǎn)前基因診斷測定等。該測定可以是一種體外測定或一種 體內(nèi)測定。本發(fā)明提供以下優(yōu)勢:可以使用本發(fā)明的方法從一個單一樣品同時分析許多不 同的靶標(biāo)，即使是當(dāng)其中此類靶標(biāo)使用現(xiàn)有技術(shù)成像方法在空間上不可分辨(并且因此空 間上難辨認(rèn)的)時。這允許例如在一個樣品上進(jìn)行幾個診斷試驗。
[0140] BP-ΝΑ偶聯(lián)物還可以用于簡單地觀察一個區(qū)域或區(qū)。
[0141] 可將本發(fā)明的方法應(yīng)用于分析得自或來源于患者的樣品，以便確定一個病變的細(xì) 胞類型是否存在于該樣品中并且/或者對該疾病進(jìn)行分期。例如，可以根據(jù)在此描述的任何 方法來測定一個血液樣品，以便確定樣品中一個癌變細(xì)胞類型的標(biāo)記物的存在和/或量，由 此對該癌癥進(jìn)行診斷或分期。
[0142] 可替代地，在此描述的這些方法可以用于通過分別確定樣品中細(xì)菌或病毒的標(biāo)記 物的存在和/或量來診斷病原體感染，例如，由細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌和病毒引起的感染。因此，使用本 發(fā)明的組合物和方法檢測的靶標(biāo)可以是患者標(biāo)記物(諸如一種癌癥標(biāo)記物)或被一種外部 試劑感染的標(biāo)記物，諸如細(xì)菌或病毒標(biāo)記物。
[0143] 本發(fā)明的定量成像方法可用于例如，量化其豐度指示生理狀態(tài)或疾病病狀的靶標(biāo) (例如，靶標(biāo)生物分子)（例如，被上調(diào)或下調(diào)作為一種疾病狀態(tài)的結(jié)果的血液標(biāo)記物）。
[0144] 另外，本發(fā)明的組合物和方法可用于提供有助于確定患者療程的預(yù)后信息。例如， 可以從來自患者的甚至一個小的樣品來準(zhǔn)確地量化用于腫瘤的一個具體標(biāo)記物的量。對于 某些疾病(像乳腺癌），某些蛋白質(zhì)(諸如Her2-n eU)的過量表達(dá)表明將需要一種更加積極的 療程。
[0145] 本發(fā)明的方法還可以用于確定擾動(包括化合物、突變、溫度改變、生長激素、生長 因子、疾病、或培養(yǎng)條件的改變)對于不同靶標(biāo)的影響，由此鑒定其存在、缺乏或水平指示具 體生物學(xué)狀態(tài)的靶標(biāo)。在一些實施例中，本發(fā)明用于闡明和發(fā)現(xiàn)疾病狀態(tài)的組分和通路。例 如，存在于一個疾病組織與"正常"組織中的靶標(biāo)的量的比較允許說明涉及疾病的重要靶 標(biāo)，由此鑒定用于發(fā)現(xiàn)/篩選可以用于治療疾病的新型藥物候選物的靶標(biāo)。
[0146] 所分析的樣品可以是一個生物樣品，諸如血液、唾液、淋巴、粘液、糞便、尿液等。該 樣品可以是一種環(huán)境樣品，諸如水樣品、空氣樣品、食物樣品等?？梢允褂媒Y(jié)合反應(yīng)的被固 定的一種或多種組分進(jìn)行該測定。因此，靶標(biāo)或BP-ΝΑ偶聯(lián)物可以是固定的?？梢允褂媒Y(jié)合 反應(yīng)的非固定的一種或多種組分進(jìn)行該測定。鑒于由本發(fā)明的BP-ΝΑ偶聯(lián)物和熒光標(biāo)記的 成像鏈所提供的多路復(fù)用潛力，這些測定可涉及基本上同時檢測一個樣品中的多個靶標(biāo)。 作為一個實例，一種測定可用于檢測一種具體細(xì)胞類型(例如，基于一種特定的細(xì)胞表面受 體)和在該具體細(xì)胞類型中的一種具體基因突變。以此方式，作為一個實例，最終用戶可以 能夠確定一種具體類型的多少細(xì)胞攜帶感興趣的突變。
[0147] 不同實施例
[0148] 本披露提供包括但不限于以下編號實施例的多個實施例：
[0149] 1. 一種方法，包括
[0150] (1)使一個有待針對一個或多個靶標(biāo)的存在進(jìn)行測試的樣品與一個或多個靶標(biāo)特 異性結(jié)合配偶體接觸，其中每個靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體連接至一個對接鏈，并且其中具有 不同特異性的靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體連接至不同對接核鏈，
[0151] (2)任選地去除未結(jié)合的靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體，
[0152] (3)使該樣品與具有互補(bǔ)于一個對接鏈的核苷酸序列的經(jīng)標(biāo)記成像鏈接觸，
[0153] (4)任選地去除未結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像鏈，
[0154] (5)將該樣品成像以便檢測結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像鏈的位置和數(shù)目，
[0155] (6)猝滅來自結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像鏈的信號，以及
[0156] (7)重復(fù)步驟(3)-(6)，每次使用一個相對于全部其他經(jīng)標(biāo)記成像鏈來說具有獨特 核苷酸序列的經(jīng)標(biāo)記成像鏈。
[0157] 2.如實施例1所述的方法，其中該樣品在步驟(1)中與多于一個的靶標(biāo)特異性結(jié)合 配偶體接觸。
[0158] 3.如實施例1或2所述的方法，其中該靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體是一種抗體或抗體片 段。
[0159] 4.如實施例1-3中任一項所述的方法，其中這些經(jīng)標(biāo)記成像鏈?zhǔn)潜幌嗤貥?biāo)記的。
[0160] 5.如實施例1-3中任一項所述的方法，其中這些經(jīng)標(biāo)記成像鏈各自包含一個不同 的標(biāo)記。
[0161] 6.如實施例1-5中任一項所述的方法，其中這些經(jīng)標(biāo)記成像鏈?zhǔn)菬晒鈽?biāo)記的成像 鏈。
[0162] 7.如實施例1-6中任一項所述的方法，其中該一個或多個靶標(biāo)是蛋白質(zhì)。
[0163] 8.如實施例1-7中任一項所述的方法，其中該樣品是細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或組織裂解 物。
[0164] 9.如實施例1-8中任一項所述的方法，其中使用共聚焦或落射熒光顯微鏡檢術(shù)在 步驟(5)中將該樣品成像。
[0165] 10.如實施例1-9中任一項所述的方法，其中步驟(6)中的猝滅信號包括光漂白。
[0166] 11.-種組合物，包含：
[0167] 結(jié)合到多于一個的靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體上的一個樣品，每個結(jié)合配偶體結(jié)合到 一個對接鏈上，以及
[0168] 至少一個穩(wěn)定地結(jié)合到一個經(jīng)標(biāo)記成像鏈上的對接鏈。
[0169] 12. -種方法，包括
[0170] (1)使一個有待針對一個或多個靶標(biāo)的存在進(jìn)行測試的樣品與一個或多個靶標(biāo)特 異性結(jié)合配偶體接觸，其中每個靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體連接至一個對接核酸，并且其中具 有不同特異性的靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體連接至不同對接核酸，
[0171] (2)任選地去除未結(jié)合的靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體，
[0172] (3)使該樣品與具有互補(bǔ)于一個對接核酸的核苷酸序列的經(jīng)標(biāo)記成像核酸接觸，
[0173] (4)任選地去除未結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像核酸，
[0174] (5)將該樣品成像以便檢測結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像核酸的位置和數(shù)目，
[0175] (6)將結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像核酸從對接核酸去除，并且
[0176] (7)重復(fù)步驟(3)-(6)，每次使用一個相對于全部其他經(jīng)標(biāo)記成像核酸來說具有獨 特核苷酸序列的經(jīng)標(biāo)記成像核酸。
[0177] 13.如實施例12所述的方法，其中該樣品在步驟（1)中與多于一個的靶標(biāo)特異性結(jié) 合配偶體接觸。
[0178] 14.如實施例12或13所述的方法，其中該靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體是一種抗體或抗 體片段。
[0179] 15.如實施例12或13所述的方法，其中該靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體是天然或工程化 的配體、小分子、適體、肽或寡核苷酸。
[0180] 16.如實施例12-15中任一項所述的方法，其中這些經(jīng)標(biāo)記成像核酸是被相同地標(biāo) 記的。
[0181] 17.如實施例12-15中任一項所述的方法，其中這些經(jīng)標(biāo)記成像核酸各自包含一個 不同的標(biāo)記。
[0182] 18.如實施例12-17中任一項所述的方法，其中這些經(jīng)標(biāo)記成像核酸是熒光標(biāo)記的 成像核酸。
[0183] 19.如實施例12-18中任一項所述的方法，其中該一個或多個靶標(biāo)是蛋白質(zhì)。
[0184] 20.如實施例12-19中任一項所述的方法，其中該樣品是細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或組織 裂解物。
[0185] 21.如實施例12-20中任一項所述的方法，其中使用共聚焦或落射熒光顯微鏡檢術(shù) 在步驟(5)中將該樣品成像。
[0186] 22.如實施例12-21中任一項所述的方法，其中這些經(jīng)標(biāo)記成像核酸是通過減小鹽 濃度、添加變性劑、或提高溫度從對接核酸去除的。
[0187] 23.如實施例22所述的方法，其中該鹽是Mg++。
[0188] 24.如實施例22所述的方法，其中該變性劑是甲酰胺、尿素或DMS0。
[0189] 25.如實施例12-21中任一項所述的方法，其中在一個競爭核酸的存在下，不通過 鏈置換將經(jīng)標(biāo)記成像核酸從對接核酸去除。
[0190] 26.如實施例12-21中任一項所述的方法，其中通過化學(xué)法、光化學(xué)法或酶促法裂 解、修飾或降解經(jīng)標(biāo)記成像核酸，將經(jīng)標(biāo)記成像核酸從對接核酸去除。
[0191 ] 27.如實施例12-21中任一項所述的方法，其中當(dāng)經(jīng)標(biāo)記成像核酸結(jié)合到其對應(yīng)的 對接核酸上時，在成像核酸或?qū)雍怂嵘喜淮嬖趩捂渽^(qū)。
[0192] 28.如實施例12-21中任一項所述的方法，其中該經(jīng)標(biāo)記成像核酸不是自淬滅的。
[0193] 2 9 .如實施例12 - 2 8中任一項所述的方法，其中該未結(jié)合的對接核酸是部分雙鏈 的。
[0194] 30.如實施例12-28中任一項所述的方法，其中該未結(jié)合的成像核酸是部分雙鏈 的。
[0195] 31.如實施例12-28中任一項所述的方法，其中該成像核酸是一個分子信標(biāo)或者包 括一個發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)。
[0196] 32.如實施例12-27和29-31中任一項所述的方法，其中該成像核酸是一個分子信 標(biāo)或者包括一個自淬滅的發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)。
[0197] 33.如實施例12-28中任一項所述的方法，其中該成像核酸是一個半雙鏈體。
[0198] 34.如實施例33所述的方法，其中該半雙鏈體是自淬滅的。
[0199] 35.如實施例12-34中任一項所述的方法，其中該對接核酸包括一個發(fā)夾二級結(jié) 構(gòu)。
[0200] 36.如實施例12-35中任一項所述的方法，其中該成像核酸是通過一個樹枝狀結(jié)構(gòu) 或一個聚合結(jié)構(gòu)結(jié)合到多個信號發(fā)射部分上。
[0201] 34. -種方法，包括
[0202] (1)使一個有待針對一個或多個靶標(biāo)的存在進(jìn)行測試的樣品與一個或多個靶標(biāo)特 異性結(jié)合配偶體接觸，其中每個靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體連接至一個對接核酸，并且其中具 有不同特異性的靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體連接至不同對接核酸，
[0203] (2)任選地去除未結(jié)合的靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體，
[0204] (3)使該樣品與具有互補(bǔ)于一個對接核酸的核苷酸序列的經(jīng)標(biāo)記成像核酸接觸，
[0205] (4)任選地去除未結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像核酸，
[0206] (5)將該樣品成像以便檢測結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像核酸的位置和數(shù)目，
[0207] (6)通過去除或修飾它們的信號發(fā)射部分而不完全去除成像核酸來滅活結(jié)合的經(jīng) 標(biāo)記成像核酸，并且
[0208] (7)重復(fù)步驟(3)-(6)，每次使用一個相對于全部其他經(jīng)標(biāo)記成像核酸來說具有獨 特核苷酸序列的經(jīng)標(biāo)記成像核酸。
[0209] 35.如實施例34所述的方法，其中該樣品在步驟（1)中與多于一個的靶標(biāo)特異性結(jié) 合配偶體接觸。
[0210] 36.如實施例34或35所述的方法，其中該靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體是一種抗體或抗 體片段。
[0211] 37.如實施例34或35所述的方法，其中該靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體是天然或工程化 的配體、小分子、適體、肽或寡核苷酸。
[0212] 38.如實施例34-37中任一項所述的方法，其中這些經(jīng)標(biāo)記成像核酸是被相同地標(biāo) 記的。
[0213] 39.如實施例34-37中任一項所述的方法，其中這些經(jīng)標(biāo)記成像核酸各自包含一個 不同的標(biāo)記。
[0214] 40.如實施例34-39中任一項所述的方法，其中這些經(jīng)標(biāo)記成像核酸是熒光標(biāo)記的 成像核酸。
[0215] 41.如實施例34-40中任一項所述的方法，其中該一個或多個靶標(biāo)是蛋白質(zhì)。
[0216] 42.如權(quán)利要求34-41中任一項所述的方法，其中該樣品是細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或組 織裂解物。
[0217] 43.如實施例34-42中任一項所述的方法，其中使用共聚焦或落射熒光顯微鏡檢術(shù) 在步驟(5)中將該樣品成像。
[0218] 44 .如實施例34-43中任一項所述的方法，其中該未結(jié)合的對接核酸是部分雙鏈 的。
[0219] 45.如實施例34-43中任一項所述的方法，其中該未結(jié)合的成像核酸是部分雙鏈 的。
[0220] 46.如實施例34-45中任一項所述的方法，其中該成像核酸是一個分子信標(biāo)或者包 括一個發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)。
[0221] 47.如實施例34-45中任一項所述的方法，其中該成像核酸是一個分子信標(biāo)或者包 括一個自淬滅的發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)。
[0222] 48.如實施例34-45中任一項所述的方法，其中該成像核酸是一個半雙鏈體。
[0223] 49.如實施例48所述的方法，其中該半雙鏈體是自淬滅的。
[0224] 50.如實施例34-49中任一項所述的方法，其中該對接核酸包括一個發(fā)夾二級結(jié) 構(gòu)。
[0225] 51.如實施例34-50中任一項所述的方法，其中該成像核酸是通過一個樹枝狀結(jié)構(gòu) 或一個聚合結(jié)構(gòu)結(jié)合到多個信號發(fā)射部分上。
[0226] 等效形式
[0227] 盡管已經(jīng)在此描述并展示幾個發(fā)明實施例，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將容易想象用 于執(zhí)行功能和/或獲得結(jié)果和/或在此描述的優(yōu)點中的一個或多個的多種其他裝置和/或結(jié) 構(gòu)，并且此類變型和/或修改中的每一個被視為是在在此描述的發(fā)明實施例的范圍內(nèi)。更一 般地說，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易理解，在此描述的所有參數(shù)、尺寸、材料以及配置意味著 為示例性的，并且實際參數(shù)、尺寸、材料和/或配置將取決于發(fā)明傳授內(nèi)容所用于的一種或 多種具體應(yīng)用。本領(lǐng)域的技術(shù)人員僅僅使用常規(guī)實驗將認(rèn)識到或能夠確認(rèn)在此描述的具體 發(fā)明實施例的許多等效物。因此，應(yīng)了解，前述實施方案是僅藉助于實例來呈現(xiàn)，并且在所 附權(quán)利要求書和其相等形式的范圍內(nèi)，發(fā)明實施例可以按與具體地描述和要求不同的方式 實踐。本披露的發(fā)明實施例涉及在此描述的每個單獨特征、系統(tǒng)、物品、材料、套件和/或方 法。此外，如果此類特征、系統(tǒng)、物品、材料、套件和/或方法并不相互矛盾，兩個或更多個此 類特征、系統(tǒng)、物品、材料、套件和/或方法的任意組合包括在本披露的發(fā)明范圍內(nèi)。在此限 定并使用的所有定義應(yīng)當(dāng)被理解成凌駕于所限定術(shù)語的字典定義、通過引用而結(jié)合的文件 中的定義、和/或一般含義。
[0228] 在此披露的所有參考文獻(xiàn)、專利和專利申請都相對于每個被引用的主題通過引用 而結(jié)合，這在某些情況下可以包括文件的全部內(nèi)容。
[0229] 除非清楚地作相反指示，否則在說明書中和在權(quán)利要求中，如在此使用的不定冠 詞"一個/種)"（a/an)應(yīng)當(dāng)理解為意思指"至少一個(種)"。
[0230] 在說明書中和在權(quán)利要求中，如在此使用的短語"和/或"應(yīng)當(dāng)理解為意思指如此 聯(lián)在一起的要素中的"任何一個或兩個"，即，要素在一些情形中聯(lián)合地存在并且在其他情 形中分離性地存在。用"和/或"列出的多個元素應(yīng)當(dāng)以相同的方式來解釋，即，這樣結(jié)合的 元素中的"一個或多個"。除了由"和/或"從句具體識別的元素，其他元素可以任選地存在， 無論是與具體識別的那些元素相關(guān)還是不相關(guān)。因此，作為非限制性實例，當(dāng)結(jié)合開放式語 言諸如"包括"使用時，對"A和/或B"的提及可以在一個實施例中僅指A(任選地包括除了B的 元素）；在另一個實施例中，僅指B(任選地包括除了A的元素）；在又一個實施例中，指A和B (任選地包括其他元素）；等等。
[0231] 在說明書中和在權(quán)利要求中，如在此使用的"或"應(yīng)理解為具有與如以上所定義的 "和/或"相同的含義。例如，當(dāng)分隔一個清單中的項目時，"或"或"和/或"應(yīng)當(dāng)解釋為包容性 的，即，包括多個元素或元素清單中的至少一個，而且包括其中的多于一個，以及任選地，另 外的未列出的項目。僅相反地清楚指示的術(shù)語，諸如"……中的僅一個"或"……中的恰好一 個"，或者當(dāng)用于權(quán)利要求中時，"由……組成"將指恰好包括一些或一列元素中的一個元 素?？傮w而言，如在此使用的術(shù)語"或"當(dāng)前面加有排他性的術(shù)語，諸如"任何一個"、"……中 一個"、"……中僅一個"或"……中只有一個"時，應(yīng)當(dāng)僅解釋為指示排他性的替代形式（BP， "一個或另一個，但非兩者主要由……組成"當(dāng)用于權(quán)利要求中時，應(yīng)具有如在專利法 領(lǐng)域中所用的其普通含義。
[0232] 在說明書中和在權(quán)利要求中，如在此所使用，關(guān)于具有一個或多個要素的清單的 短語"至少一個"應(yīng)理解為意思指選自該要素清單中的任一個或多個要素的至少一個要素， 但未必包括在該要素清單內(nèi)具體地列出的每一個要素中的至少一個，并且不排除該要素清 單中多個要素的任何組合。這一定義還允許，可以任選地存在除該短語"至少一個"所指元 素清單內(nèi)具體地鑒別出的元素外的元素，無論是與具體地鑒別出的那些元素相關(guān)還是不相 關(guān)。因此，作為非限制性實例，"A和B中的至少一個"（或等效地，"A或B中的至少一個"，或等 效地"A和/或B中的至少一個"）在一個實施例中可以是指至少一個、任選地包括多于一個A， 而不存在B(并且任選地包括除了B的元素）；在另一個實施例中，可以是指至少一個、任選地 包括多于一個B，而不存在A(并且任選地包括除了A的元素）；在又一個實施例中，可以是指 至少一個、任選地包括多于一個A，以及至少一個、任選地包括多于一個B(并且任選地包括 其他兀素）；等等。
[0233] 還應(yīng)當(dāng)理解，除非明確指出相反，在包括多于一個步驟或動作的在此所要求保護(hù) 的任何方法中，方法的步驟或動作的順序不一定限于其中方法的步驟或動作被列舉的順 序。
[0234] 在權(quán)利要求中，以及在以上說明書中，所有過渡性短語，如"包含"、"包括"、"攜 帶"、"具有"、"含"、"涉及"、"持有"、"由……構(gòu)成"等應(yīng)理解為開放性的，即，意思指包括但 不限于。只有過渡性短語"由……組成"和"主要由……組成"應(yīng)當(dāng)各自地為封閉或半封閉式 過渡性短語，如美國專利局專利審查程序手冊(United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures)，第2111.03節(jié)中所述。
【主權(quán)項】
1. 一種方法，包括 (1) 使一個有待針對一個或多個靶標(biāo)的存在進(jìn)行測試的樣品與一個或多個靶標(biāo)特異性 結(jié)合配偶體接觸，其中每個靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體連接至一個對接鏈，并且其中具有不同 特異性的靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體連接至不同對接核鏈， (2) 任選地去除未結(jié)合的靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體， (3) 使該樣品與具有互補(bǔ)于一個對接鏈的核苷酸序列的經(jīng)標(biāo)記成像鏈接觸， (4) 任選地去除未結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像鏈， (5) 將該樣品成像以便檢測結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像鏈的位置和數(shù)目， (6) 猝滅來自該結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像鏈的信號，并且 (7) 重復(fù)步驟(3)-(6)，每次使用一個相對于全部其他經(jīng)標(biāo)記成像鏈來說具有獨特核苷 酸序列的經(jīng)標(biāo)記成像鏈。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中該樣品在步驟（1)中與多于一個的靶標(biāo)特異性結(jié)合配 偶體接觸。3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中該靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體是一種抗體或抗體片段。4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中這些經(jīng)標(biāo)記成像鏈?zhǔn)潜幌嗤貥?biāo)記的。5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中這些經(jīng)標(biāo)記成像鏈各自包含一個不同的標(biāo)記。6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中這些經(jīng)標(biāo)記成像鏈?zhǔn)菬晒鈽?biāo)記的成像鏈。7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中該一個或多個靶標(biāo)是蛋白質(zhì)。8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中該樣品是一種細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或組織裂解物。9. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中使用共聚焦或落射熒光顯微鏡檢術(shù)在步驟(5)中將該 樣品成像。10. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(6)中的猝滅信號包括光漂白。11. 一種組合物，包含： 結(jié)合到多于一個的靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體上的一個樣品，每個結(jié)合配偶體結(jié)合到一個 對接鏈上，以及 至少一個穩(wěn)定地結(jié)合到一個經(jīng)標(biāo)記成像鏈上的對接鏈。12. -種方法，包括 (1) 使一個有待針對一個或多個靶標(biāo)的存在進(jìn)行測試的樣品與一個或多個靶標(biāo)特異性 結(jié)合配偶體接觸，其中每個靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體連接至一個對接核酸，并且其中具有不 同特異性的靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體連接至不同對接核酸， (2) 任選地去除未結(jié)合的靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體， (3) 使該樣品與具有互補(bǔ)于一個對接核酸的核苷酸序列的經(jīng)標(biāo)記成像核酸接觸， (4) 任選地去除未結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像核酸， (5) 將該樣品成像以便檢測結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像核酸的位置和數(shù)目， (6) 通過改變溫度和/或緩沖條件將該結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像核酸從該對接核酸去除，并且 (7) 重復(fù)步驟(3)-(6)，每次使用一個相對于全部其他經(jīng)標(biāo)記成像核酸來說具有獨特核 苷酸序列的經(jīng)標(biāo)記成像核酸。13. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中該樣品在步驟(1)中與多于一個的靶標(biāo)特異性結(jié)合 配偶體接觸。14. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中該靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體是一種抗體或抗體片段。15. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中該靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體是一種天然或工程化的 配體、小分子、適體、肽或寡核苷酸。16. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中這些經(jīng)標(biāo)記成像核酸是被相同地標(biāo)記的。17. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中這些經(jīng)標(biāo)記成像核酸各自包含一個不同的標(biāo)記。18. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中這些經(jīng)標(biāo)記成像核酸是熒光標(biāo)記的成像核酸。19. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中該一個或多個靶標(biāo)是蛋白質(zhì)。20. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中該樣品是一種細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或組織裂解物。21. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中使用共聚焦或落射熒光顯微鏡檢術(shù)在步驟(5)中將 該樣品成像。22. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中這些經(jīng)標(biāo)記成像核酸是通過減小鹽濃度、添加變性 劑、或提高溫度從這些對接核酸去除的。23. 如權(quán)利要求22所述的方法，其中該鹽是Mg++。24. 如權(quán)利要求22所述的方法，其中該變性劑是甲酰胺、尿素或DMSO。25. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中在一個競爭核酸的存在下，不通過鏈置換將這些經(jīng) 標(biāo)記成像核酸從這些對接核酸去除。26. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中該未結(jié)合的對接核酸是部分雙鏈的。27. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中該未結(jié)合的成像核酸是部分雙鏈的。28. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中該成像核酸是一個分子信標(biāo)或者包括一個發(fā)夾二 級結(jié)構(gòu)。29. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中該成像核酸是一個分子信標(biāo)或者包括一個自淬滅 的發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)。30. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中該成像核酸是一個半雙鏈體。31. 如權(quán)利要求30所述的方法，其中該半雙鏈體是自淬滅的。32. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中該對接核酸包括一個發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)。33. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中該成像核酸是通過一個樹枝狀結(jié)構(gòu)或一個聚合結(jié) 構(gòu)結(jié)合到多個信號發(fā)射部分上。34. 一種方法，包括 (1) 使一個有待針對一個或多個靶標(biāo)的存在進(jìn)行測試的樣品與一個或多個靶標(biāo)特異性 結(jié)合配偶體接觸，其中每個靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體連接至一個對接核酸，并且其中具有不 同特異性的靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體連接至不同對接核酸， (2) 任選地去除未結(jié)合的靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體， (3) 使該樣品與具有互補(bǔ)于一個對接核酸的核苷酸序列的經(jīng)標(biāo)記成像核酸接觸， (4) 任選地去除未結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像核酸， (5) 將該樣品成像以便檢測結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記成像核酸的位置和數(shù)目， (6) 通過去除或修飾它們的信號發(fā)射部分而不完全去除成像核酸來滅活這些結(jié)合的經(jīng) 標(biāo)記成像核酸，并且 (7) 重復(fù)步驟(3)-(6)，每次使用一個相對于全部其他經(jīng)標(biāo)記成像核酸來說具有獨特核 苷酸序列的經(jīng)標(biāo)記成像核酸。35. 如權(quán)利要求34所述的方法，其中該樣品在步驟(1)中與多于一個的靶標(biāo)特異性結(jié)合 配偶體接觸。36. 如權(quán)利要求34所述的方法，其中該靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體是一種抗體或抗體片段。37. 如權(quán)利要求34所述的方法，其中該靶標(biāo)特異性結(jié)合配偶體是一種天然或工程化的 配體、小分子、適體、肽或寡核苷酸。38. 如權(quán)利要求34所述的方法，其中這些經(jīng)標(biāo)記成像核酸是被相同地標(biāo)記的。39. 如權(quán)利要求34所述的方法，其中這些經(jīng)標(biāo)記成像核酸各自包含一個不同的標(biāo)記。40. 如權(quán)利要求34所述的方法，其中這些經(jīng)標(biāo)記成像核酸是熒光標(biāo)記的成像核酸。41. 如權(quán)利要求34所述的方法，其中該一個或多個靶標(biāo)是蛋白質(zhì)。42. 如權(quán)利要求34所述的方法，其中該樣品是一種細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或組織裂解物。43. 如權(quán)利要求34所述的方法，其中使用共聚焦或落射熒光顯微鏡檢術(shù)在步驟(5)中將 該樣品成像。44. 如權(quán)利要求34所述的方法，其中該未結(jié)合的對接核酸是部分雙鏈的。45. 如權(quán)利要求34所述的方法，其中該未結(jié)合的成像核酸是部分雙鏈的。46. 如權(quán)利要求34所述的方法，其中該成像核酸是一個分子信標(biāo)或者包括一個發(fā)夾二 級結(jié)構(gòu)。47. 如權(quán)利要求34所述的方法，其中該成像核酸是一個分子信標(biāo)或者包括一個自淬滅 的發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)。48. 如權(quán)利要求34所述的方法，其中該成像核酸是一個半雙鏈體。49. 如權(quán)利要求48所述的方法，其中該半雙鏈體是自淬滅的。50. 如權(quán)利要求34所述的方法，其中該對接核酸包括一個發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)。51. 如權(quán)利要求34所述的方法，其中該成像核酸是通過一個樹枝狀結(jié)構(gòu)或一個聚合結(jié) 構(gòu)結(jié)合到多個信號發(fā)射部分上。
【文檔編號】C12N15/115GK105980855SQ201580006969
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2015年3月11日
【發(fā)明人】尹鵬, S·阿加斯蒂, 陳曦, R·容曼
【申請人】哈佛學(xué)院院長及董事