一種全程c反應(yīng)蛋白測(cè)定試劑盒及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種全程C反應(yīng)蛋白測(cè)定試劑盒及其應(yīng)用，該試劑盒包括如下組分：M試劑、R1試劑、R2試劑、堿性預(yù)處理液、預(yù)激發(fā)液和激發(fā)液，M試劑含有0.5～1mg/mL的包被了第一抗體的磁性微粒、0.5～1％酪蛋白和0.5～1％牛血清白蛋白，溶劑為pH＝7.0～8.0的磷酸鹽緩沖液，其中第一抗體的包被量為5～15μg/mg磁性微粒；R1試劑為濃度為10～20mM的HCl溶液；R2試劑含有包被了第二抗體的吖啶酯、0.5～1％酪蛋白和0.5～1％牛血清白蛋白，溶劑為pH＝7.0～8.0的磷酸鹽緩沖液，其中第二抗體的包被量為5～15μg/mL吖啶酯；堿性預(yù)處理液為濃度為20～50mM的NaOH溶液；本發(fā)明的試劑盒在反應(yīng)過程中加入強(qiáng)堿，對(duì)蛋白進(jìn)行破壞，然后再加入強(qiáng)酸進(jìn)行中和，可以試劑的檢測(cè)范圍達(dá)到0.02mg/L～100mg/L，使試劑能達(dá)到檢測(cè)C反應(yīng)蛋白全程的要求。
【專利說明】
-種全程C反應(yīng)蛋白測(cè)定試劑盒及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種全程C反應(yīng)蛋白測(cè)定試劑 盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 免疫分析技術(shù)現(xiàn)在在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用非常廣泛，并已經(jīng)在臨床診斷、環(huán)境 及衛(wèi)生檢測(cè)、法醫(yī)鑒定、食品安全等諸多領(lǐng)域中已經(jīng)成為必備的常規(guī)技術(shù)手段，發(fā)揮著不可 替代的作用，具有巨大的市場(chǎng)。而免疫分析試劑所采用的信號(hào)系統(tǒng)對(duì)于免疫分析試劑的性 能起著決定性的作用，從放射免疫分析巧IA)到酶聯(lián)免疫吸附分析巧LISA)再到化學(xué)發(fā)光 免疫分析（CLIA)，免疫分析技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步，主要就是信號(hào)系統(tǒng)的進(jìn)步和革命，免疫分析 技術(shù)使用抗原和抗體W及它們的各種結(jié)合物運(yùn)一免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)并沒有變化，因此如何獲 得更強(qiáng)、更靈敏W及更穩(wěn)定的信號(hào)就顯得致關(guān)重要。
[0003] C-反應(yīng)蛋白（C-Reactive protein, CRP)是一種能與肺炎鏈球菌C多糖體反應(yīng)形 成復(fù)合物的急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，分子量為105500D，半衰期19小時(shí)；由含有五個(gè)相同的未糖 基化的多膚亞單位組成，每個(gè)亞單位含有187個(gè)氨基酸，運(yùn)些亞單位間通過非共價(jià)鍵連結(jié) 成環(huán)狀的五聚體，并有一個(gè)鏈間二硫鍵。血清CRP由肝臟合成，白細(xì)胞介素化、6 W及腫瘤 壞死因子是其合成的最重要的調(diào)節(jié)因子；1930年，Tillett和化ancis首次在急性大葉性肺 炎患者的血清中發(fā)現(xiàn)一種能在Ca"+存在時(shí)與肺炎球菌細(xì)胞壁中的C多糖發(fā)生特異性沉淀反 應(yīng)的物質(zhì)。1941年，Ave巧等測(cè)知它是一種蛋白質(zhì)，故稱為C反應(yīng)蛋白（CRP)。
[0004] 傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為CRP是一種非特異的炎癥標(biāo)志物，但近十年的研究掲示了 CRP直接 參與了炎癥與動(dòng)脈粥樣硬化等屯、血管疾病，并且是屯、血管疾病最強(qiáng)有力的預(yù)示因子與危險(xiǎn) 因子。因此CRP含量就可W作為兩種疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并且參考值范圍不同，具體如下： 陽0化]CRP在健康人血清中濃度很低（< 3mg/L)，而在細(xì)菌感染或組織損傷時(shí)，其濃度顯 著升高。
[0006] CRP值為10~50mg/L表示輕度炎癥，例如局部細(xì)菌性感染（如膀脫炎、支氣管炎、 脈腫）、手術(shù)和意外創(chuàng)傷、屯、肌梗死、深靜脈血栓、非活動(dòng)性結(jié)締組織病、許多惡性腫瘤和多 數(shù)病毒感染。
[0007] CRP值升為lOOmg/L左右表示較嚴(yán)重的疾病，它的炎癥程度必要時(shí)需靜脈注射。
[0008] CRP值大于lOOmg/l，表示嚴(yán)重的疾病過程并常表示細(xì)菌感染的存在。
[0009] 而現(xiàn)有技術(shù)中的試劑盒均不能同時(shí)囊括上述參考范圍，造成了應(yīng)用的限制，增加 了診斷分析成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷提供一種全程C反應(yīng)蛋白測(cè)定試劑盒。
[0011] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述試劑盒的檢測(cè)方法。 陽012] 本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：
[0013] 一種全程C反應(yīng)蛋白測(cè)定試劑盒，包括如下組分：
[0014] M試劑，含有0. 5~Img/mL的包被了第一抗體的磁性微粒、0. 5~1%酪蛋白和 0. 5~1%牛血清白蛋白，溶劑為抑=7. 0~8. 0的憐酸鹽緩沖液，其中第一抗體的包被量 為5~15 Ji g/mg磁性微粒； 陽01引 Rl試劑，濃度為10~20mM的肥1溶液；
[0016] R2試劑，含有包被了第二抗體的日丫晚醋、0. 5~1%酪蛋白和0. 5~1%牛血清白 蛋白，溶劑為抑=7. 0~8. 0的憐酸鹽緩沖液，其中第二抗體的包被量為5~15 y g/mL叮 晚醋；
[0017] 堿性預(yù)處理液，濃度為20~50mM的化OH溶液；
[0018] 預(yù)激發(fā)液和激發(fā)液
[0019] 上述第一抗體和第二抗體均為能與C反應(yīng)蛋白特異性反應(yīng)的單克隆抗體。
[0020] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述Rl試劑為濃度IOmM的肥1溶液。
[0021] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述堿性預(yù)處理液為濃度20mM的化OH溶液。
[0022] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述M試劑的制備方法為：將所述第一抗體與 磁性微?；旌嫌谝?5. 0~6. 0的2-嗎嘟乙橫酸緩沖液中，于25°C~37°C包被1~化， 在加入pH = 8. 0~9. 0的0. 1 %~0. 5%牛血清白蛋白的憐酸鹽緩沖液終止1~化，將其 中包被后的磁性微粒分離后分散于抑=7. 0~8. 0的憐酸鹽緩沖液中，再加入酪蛋白和牛 血清白蛋白，即得M試劑。
[0023] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述包被了抗體的叮晚醋的制備方法為：將所 述第二抗體與叮晚醋混合于抑=8. 0~9. 0的憐酸鹽緩沖液中，于25°C~37°C包被1~ 池，在加入抑=8. 0~9. 0的含0. 1 %~0. 5%牛血清白蛋白的Tris緩沖液終止1~化， 得母液，將該母液用抑=7. 0~8. 0的憐酸鹽緩沖液稀釋至1:100~500,即得R2試劑。
[0024] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述預(yù)激發(fā)液為1% (w/v)過氧化氨溶液。
[0025] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述激發(fā)液為Imol/L氨氧化鋼溶液。
[00%] -種應(yīng)用上述全程C反應(yīng)蛋白測(cè)定試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的方法，包括如下步驟：
[0027] (1)用100~120 y L堿性預(yù)處理液處理20~30 y L樣本； 陽02引 似按1:2~3:5~7的體積比在反應(yīng)孔中依次加入預(yù)處理后的樣本、M試劑和Rl 試劑，解育15~20min ;
[0029] (3)步驟（2)的解育結(jié)束后，用含0. 05~0. 08%的吐溫20憐酸鹽緩沖液洗涂，再 加入20~25 y LR2試劑，解育10~15min ;
[0030] (4)步驟（3)的解育結(jié)束后，用含0. 05~0. 08%的吐溫20憐酸鹽緩沖液洗涂，加 入預(yù)激發(fā)液100~200 y以進(jìn)行預(yù)激發(fā)；
[00川 妨去除預(yù)激發(fā)液，加入激發(fā)液100~200 y L，進(jìn)行激發(fā)和檢測(cè)。
[0032] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述步驟（2)中M試劑和Rl試劑的加樣間隔為 0 ~ 4min〇
[0033] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的試劑盒在反應(yīng)過程中加入強(qiáng)堿，對(duì)蛋白進(jìn)行破壞， 然后再加入強(qiáng)酸進(jìn)行中和，可W試劑的檢測(cè)范圍達(dá)到0. 02mg/L~lOOmg/L，使試劑能達(dá)到 檢測(cè)C反應(yīng)蛋白全程的要求。
【具體實(shí)施方式】
[0034] W下通過【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步的說明和描述。
[0035] 下述實(shí)施例中的全程C反應(yīng)蛋白測(cè)定試劑盒，其特征在于：包括如下組分：
[0036] M試劑，含有0. 5~Img/mL的包被了第一抗體的磁性微粒、0. 5~1%酪蛋白和 0. 5~1%牛血清白蛋白，溶劑為抑=7. 0~8. 0的憐酸鹽緩沖液，其中第一抗體的包被量 為5~15 Ji g/mg磁性微粒，上述磁性微粒購自Thermo,為納米級(jí)的超順磁顆粒，其核屯、為 Pe3〇4,該試齊Ij制備方法為：將巧f述第一抗體與磁性微?；旌嫌趐H = 5. 0~6. 0的2-嗎嘟乙 橫酸緩沖液中，于25°C~37°C包被1~化，在加入pH = 8. 0~9. 0的0. 1 %~0. 5%牛血 清白蛋白的憐酸鹽緩沖液終止1~化，將其中包被后的磁性微粒分離后分散于抑=7. 0~ 8. 0的憐酸鹽緩沖液中，再加入酪蛋白和牛血清白蛋白，即得；
[0037] Rl試劑，濃度為10~20mM的肥1溶液； 陽03引 R2試劑，含有包被了第二抗體的日丫晚醋、0. 5~1%酪蛋白和0. 5~1%牛血清白 蛋白，溶劑為抑=7. 0~8. 0的憐酸鹽緩沖液，其中第二抗體的包被量為5~15 y g/mL叮 晚醋，該試劑的制備方法為：將所述第二抗體與叮晚醋混合于抑=8. 0~9. 0的憐酸鹽緩 沖液中，于25°C~37°C包被1~化，在加入pH = 8.0~9.0的含0. 1 %~0.5%牛血清白 蛋白的Tris緩沖液終止1~化，得母液，將該母液用抑=7. 0~8. 0的憐酸鹽緩沖液稀釋 至1:100~500,即得； W39] 堿性預(yù)處理液，濃度為20~50mM的化OH溶液；
[0040] 預(yù)激發(fā)液，為1 % (w/v)過氧化氨溶液 [0041 ] 和激發(fā)液，為Imol/L氨氧化鋼溶液
[0042] 上述第一抗體和第二抗體均為能與C反應(yīng)蛋白特異性反應(yīng)的單克隆抗體，其中第 一抗體為10C11，第二抗體為7D9,均購自廈口萬泰滄海生物技術(shù)有限公司。
[0043] 上述全程C反應(yīng)蛋白測(cè)定試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的方法，包括如下步驟：
[0044] (1)用100~120 y L堿性預(yù)處理液處理20~30 y L樣本； W45] 似按1:2~3:5~7的體積比在反應(yīng)孔中依次加入預(yù)處理后的樣本、M試劑和Rl 試劑，解育15~20min ;
[0046] (3)步驟（2)的解育結(jié)束后，用含0. 05~0. 08%的吐溫20憐酸鹽緩沖液洗涂，再 加入20~25 y LR2試劑，解育10~15min ;
[0047] (4)步驟（3)的解育結(jié)束后，用含0. 05~0. 08%的吐溫20憐酸鹽緩沖液洗涂，加 入預(yù)激發(fā)液100~200 y以進(jìn)行預(yù)激發(fā)； W48] 妨去除預(yù)激發(fā)液，加入激發(fā)液100~200 y L，進(jìn)行激發(fā)和檢測(cè)。 陽049] 實(shí)施例1 陽化日]分別選用50mM化0H、2 % SDS、IOOmM邸TA及2M鹽酸脈作為樣本預(yù)處理液加入優(yōu) 化后的檢測(cè)系統(tǒng)，評(píng)價(jià)梯度稀釋的C反應(yīng)蛋白抗原，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度如下表1所示：
[0051] 表1不同預(yù)處理液對(duì)C反應(yīng)蛋白檢測(cè)的影響
[0052]
[0054] 由表1可知，選用50mM化OH作為樣本預(yù)處理液時(shí)線性擬合r為0. 9925,優(yōu)于其他 預(yù)處理液；且將M試劑加入2 % SDS、IOOmM邸TA及2M鹽酸脈作為預(yù)處理液處理的樣本后， 磁微粒出現(xiàn)非常明顯的沉淀現(xiàn)象，而且不能再混勻，而50mM化OH也有沉淀，但是較輕微且 能再混勻，所W選用50mM化OH作為樣本預(yù)處理液。 陽〇5引 實(shí)施例2
[0056] 為了解決磁微粒的沉淀現(xiàn)象，所W需對(duì)堿預(yù)處理后的樣本加入酸性的Rl試劑進(jìn) 行中和。加入M試劑后分別加入20 y L IOOmM肥l、20mM肥1及IOmM肥1，評(píng)價(jià)梯度稀釋的 C反應(yīng)蛋白抗原，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度如下表2所示：
[0057] 表2不同濃度肥1對(duì)C反應(yīng)蛋白檢測(cè)的影響
[0058]
[0059] 在上述3個(gè)濃度中，選用20mM肥1及IOmM肥1作為Rl試劑時(shí)，線性擬合r較優(yōu)， 均大于0. 9900 ;且由于使用IOmM肥I作為Rl試劑時(shí)可W使反應(yīng)不出現(xiàn)磁微粒沉淀現(xiàn)象。 W60] 實(shí)施例3
[OOW] 加入M試劑后，分別間隔lmin、2min、3min及4min加入Rl試濟(jì)I，W馬上加入為對(duì) 照組，分別評(píng)價(jià)梯度稀釋的C反應(yīng)蛋白抗原，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度如下表3所示：
[0062] 表3不同加樣間隔對(duì)C反應(yīng)蛋白檢測(cè)的影響
[0063]
W65] 表3結(jié)果顯示，4min內(nèi)完成Rl試劑的加入對(duì)試劑的檢測(cè)性能影響都不大，能滿足 實(shí)際操作的要求。
[0066] 實(shí)施例4
[0067] 使用優(yōu)化后的檢測(cè)體系檢測(cè)稀釋的C反應(yīng)蛋白抗原，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度如下表4所 示： W側(cè)表4 C反應(yīng)蛋白抗原的檢測(cè)結(jié)果
[0069]
[0070] 分別W表4中樣本濃度（W 10為底的對(duì)數(shù)）為X軸，W測(cè)定結(jié)果均值（W 10為 底的對(duì)數(shù)）為Y軸進(jìn)行多項(xiàng)回歸分析，得到一級(jí)、二級(jí)與=級(jí)多項(xiàng)式，多項(xiàng)式方程如表5所 示：
[0071] 表5多項(xiàng)式回歸方程
陽勺1 陽
[0074] 對(duì)回歸方程進(jìn)行線性檢驗(yàn)就是對(duì)每個(gè)非線性系數(shù)作t檢驗(yàn)，判斷回歸系數(shù)與零是 否有顯著性差異。BO與Bl不反映非線性，故不需對(duì)其進(jìn)行檢驗(yàn)。 W巧]4. 1系數(shù)B3t檢驗(yàn)
[0076] 對(duì)3批試劑的B3做t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)方法如下：
[0077] 計(jì)算統(tǒng)計(jì)量t，計(jì)算公式為：
[0078] t = Bi/沈 i
[0079] 其中，SEi為每個(gè)非線性系數(shù)的斜率標(biāo)準(zhǔn)誤，使用GraphPad Prism進(jìn)行分析計(jì)算， 結(jié)果如表6所示：
[0080] 表6 B3檢驗(yàn)結(jié)果
[0081]
[0082] 由公式壯=L*R-R壯計(jì)算自由度，L為樣本數(shù)，R為每個(gè)樣本的測(cè)定次數(shù)，R壯為 回歸自由度，即回歸方程中系數(shù)（包括BO)的個(gè)數(shù)。 陽083] 根據(jù)W上公式對(duì)表6中的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，111 = 5. 362,當(dāng)壯=28時(shí)查表得， a ^.。日尸2. 048,所W 111 H <a ^.。日>，表示試劑非線性系數(shù)B3與零有顯著性差異，數(shù)據(jù)組 被認(rèn)為具有非線性。因此應(yīng)對(duì)該試劑進(jìn)行臨床標(biāo)準(zhǔn)的線性與非線性檢驗(yàn)。
[0084] 4. 2臨床標(biāo)準(zhǔn)的線性與非線性檢驗(yàn)
[00化]臨床標(biāo)準(zhǔn)的線性檢驗(yàn)中使用了兩個(gè)統(tǒng)計(jì)量，ADL(偏離直線平均差異average deviation from linearity)與 F*c1:Bnd(百分區(qū)界 percent bound)，F(xiàn)*c1:Bnd 取 5%。如 ADL 小于所要求的臨界判斷值，則可認(rèn)為數(shù)據(jù)組具有臨床可接受的線性，所擬合出的最適非線 性多項(xiàng)式無臨床意義。 W86] 計(jì)算ADL值，計(jì)算公式為：
[0087：
[00蝴其中，P(X)為最優(yōu)擬合二階或S階方程的擬合值，a+bx為擬合一階方程的擬合 值，L為樣本數(shù)，；為總平均濃度（全部測(cè)量數(shù)據(jù)的平均值）。
[0089] 測(cè)量數(shù)據(jù)的精密度可直接影響多項(xiàng)式回歸分析的結(jié)果，為提高統(tǒng)計(jì)功效，需對(duì)數(shù) 據(jù)組進(jìn)行精密度檢驗(yàn)。用最優(yōu)擬合方程的回歸標(biāo)準(zhǔn)誤（O)與總平均濃度（C )的百分比 代表不精密度。
[0090] 計(jì)算最優(yōu)擬合方程的回歸標(biāo)準(zhǔn)誤（O )，計(jì)算公式為：
[0091]
[0092]
[0093] 陽094] 其中，yi為各個(gè)測(cè)量值，P(Xi)為最優(yōu)擬合方程的擬合值，n為樣本數(shù)乘W重復(fù)次 數(shù)化X時(shí)，d為最優(yōu)擬合方程的階數(shù)，0.為總平均濃度，L為樣本數(shù)，R為重復(fù)測(cè)量的次數(shù)， C為常數(shù)。
[0095] 根據(jù)W上公式分別對(duì)表4~5中的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表7所示：
[0096] 表7線性檢驗(yàn)及不精密度分析結(jié)果表
[0097] 陽
[0099] 試劑二階與S階回歸方程的不精密度分別為0.3%、1. 1%，二階與S階回歸方程 的
分別為1%，均滿^
判斷式，說明數(shù)據(jù)的精密度好 可作線性評(píng)價(jià)。一般設(shè)定ADL小于5%為臨床允許誤差，試劑二階與S階回歸方程的ADL分 別為1. 6%、1. 1 %，可認(rèn)為該數(shù)據(jù)組具有臨床可接受的線性。 陽100] 綜上所述，本試劑盒樣本濃度在0. 02mg/L~200mg/L的范圍內(nèi)具有臨床可接受的 線性。 陽101] 實(shí)施例5 陽102] 使用優(yōu)化后的檢測(cè)體系檢測(cè)梯度稀釋的C反應(yīng)蛋白抗原作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后檢測(cè) 收集的21例臨床樣本，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線換算濃度值后與臨床背景值進(jìn)行相關(guān)性評(píng)價(jià)，結(jié)果如 表8所不： 陽103] 表8臨床樣本檢測(cè)結(jié)果 陽 104]
陽106] 通過相關(guān)性評(píng)價(jià)，兩者相關(guān)性方程為y = I. 0217X+0. 0452,相關(guān)系數(shù)r為0. 9860， 說明二者有較好的相關(guān)性。 陽107] W上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實(shí)施的范圍，即 依本發(fā)明專利范圍及說明書內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種全程C反應(yīng)蛋白測(cè)定試劑盒，其特征在于：包括如下組分： Μ試劑，含有0. 5~lmg/mL的包被了第一抗體的磁性微粒、0. 5~1%酪蛋白和0. 5~ 1 %牛血清白蛋白，溶劑為pH = 7. 0~8. 0的磷酸鹽緩沖液，其中第一抗體的包被量為5~ 15 μ g/mg磁性微粒； R1試劑，濃度為10~20mM的HC1溶液； R2試劑，含有包被了第二抗體的吖啶酯、0. 5~1 %酪蛋白和0. 5~1 %牛血清白蛋白， 溶劑為pH = 7. 0~8. 0的磷酸鹽緩沖液，其中第二抗體的包被量為5~15 μ g/mL吖啶酯； 堿性預(yù)處理液，濃度為20~50mM的NaOH溶液； 預(yù)激發(fā)液和激發(fā)液； 上述第一抗體和第二抗體均為能與C反應(yīng)蛋白特異性反應(yīng)的單克隆抗體。2. 如權(quán)利要求1所述的一種全程C反應(yīng)蛋白測(cè)定試劑盒，其特征在于：所述R1試劑為 濃度10mM的HC1溶液。3. 如權(quán)利要求1所述的一種全程C反應(yīng)蛋白測(cè)定試劑盒，其特征在于：所述堿性預(yù)處 理液為濃度20mM的NaOH溶液。4. 如權(quán)利要求1所述的一種全程C反應(yīng)蛋白測(cè)定試劑盒，其特征在于：所述Μ試劑的 制備方法為：將所述第一抗體與磁性微?；旌嫌趐H = 5. 0~6. 0的2-嗎啉乙磺酸緩沖液 中，于25°C~37°C包被1~3h，在加入pH = 8. 0~9. 0的0. 1%~0. 5%牛血清白蛋白的 磷酸鹽緩沖液終止1~3h，將其中包被后的磁性微粒分離后分散于pH = 7. 0~8. 0的磷酸 鹽緩沖液中，再加入酪蛋白和牛血清白蛋白，即得Μ試劑。5. 如權(quán)利要求1所述的一種全程C反應(yīng)蛋白測(cè)定試劑盒，其特征在于：所述包被了抗 體的吖啶酯的制備方法為：將所述第二抗體與吖啶酯混合于pH = 8. 0~9. 0的磷酸鹽緩沖 液中，于25°C~37°C包被1~3h，在加入pH = 8. 0~9. 0的含0. 1%~0. 5%牛血清白蛋 白的Tris緩沖液終止1~3h，得母液，將該母液用pH = 7. 0~8. 0的磷酸鹽緩沖液稀釋至 1:100~500,即得R2試劑。6. 如權(quán)利要求1至5中任一權(quán)利要求所述的一種全程C反應(yīng)蛋白測(cè)定試劑盒，其特征 在于：所述預(yù)激發(fā)液為1% (w/V)過氧化氫溶液。7. 如權(quán)利要求6所述的一種全程C反應(yīng)蛋白測(cè)定試劑盒，其特征在于：所述激發(fā)液為 lmol/L氫氧化鈉溶液。8. -種應(yīng)用權(quán)利要求1至7中任一權(quán)利要求所述的全程C反應(yīng)蛋白測(cè)定試劑盒進(jìn)行檢 測(cè)的方法，其特征在于：包括如下步驟： (1) 用100~120 μ L堿性預(yù)處理液處理20~30 μ L樣本； (2) 按1:2~3:5~7的體積比在反應(yīng)孔中依次加入預(yù)處理后的樣本、Μ試劑和R1試 劑，孵育15~20min ; (3) 步驟（2)的孵育結(jié)束后，用含0. 05~0. 08%的吐溫20磷酸鹽緩沖液洗滌，再加入 20~25 μ LR2試劑，孵育10~15min ; (4) 步驟（3)的孵育結(jié)束后，用含0. 05~0. 08%的吐溫20磷酸鹽緩沖液洗滌，加入預(yù) 激發(fā)液100~200 μ L，進(jìn)行預(yù)激發(fā)； (5) 去除預(yù)激發(fā)液，加入激發(fā)液100~200 μ L，進(jìn)行激發(fā)和檢測(cè)。9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述步驟（2)中Μ試劑和R1試劑的加樣間
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK105988003SQ201510042477
【公開日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2015年1月28日
【發(fā)明人】魏淑英, 黃緣緣, 翁祖星, 徐飛海, 孫旭東, 葛勝祥
【申請(qǐng)人】廈門萬泰凱瑞生物技術(shù)有限公司, 廈門大學(xué)