一種掃描電鏡的樣品制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種掃描電鏡的樣品制備方法，該方法步驟包括以下步驟：糞樣處理；尼龍袋包裹洗滌；培養(yǎng)皿靜置洗滌；高速水流沖洗；換水；吸水干燥；樣品臺準備；樣品噴金鍍膜。通過干燥、碾破、浸泡、尼龍袋包裹洗滌、高速水流沖洗、吸水，干燥，鍍金等工藝，制備的掃描電鏡樣品干凈無雜質，無砂礫沉淀，殘渣損失小，分布均勻，肉眼觀察殘渣樣品清晰，掃描電鏡觀察時殘渣結構清晰完整，視野干凈，圖像立體感強，有利于開展反芻動物消化后糞便中未消化牧草殘渣超微結構的觀察和研究，對于直觀了解和評價反芻動物消化道微生物對粗飼料纖維結構的降解及提高秸稈飼料利用率有重要意義。
【專利說明】
一種掃描電鏡的樣品制備方法
技術領域
[0001]本發(fā)明屬于顯微觀察樣品技術領域，涉及一種掃描電鏡的樣品制備方法，具體地說，涉及一種經(jīng)反芻動物消化后糞便中牧草殘渣在掃描電鏡(SEM)觀察樣本的制備方法。
【背景技術】
[0002]近年來，隨著經(jīng)濟社會的快速發(fā)展以及人民生活水平的不斷提高，我國畜牧業(yè)得到了快速的發(fā)展。因此，對牧草資源的數(shù)量和品質要求不斷提高，有關研究正在蓬勃開展。在這種大的發(fā)展趨勢下，牧草利用率的提高正不斷成為研究熱點，各種促進牧草消化率的技術層出不窮。目前牧草消化程度的研究結果大多只是用數(shù)量指標來體現(xiàn)并進行相互比較，如消化率、瘤胃降解率，瘤胃消失率等，普遍缺乏能直觀反映牧草經(jīng)過反芻動物消化道的纖維結構及其細胞壁變化的直觀影像資料。為了更為直觀地揭示牧草纖維經(jīng)反芻動物消化道消化后被動物利用的程度，也為研發(fā)提高牧草消化率的技術和產(chǎn)品提供更為確切的圖像資料，本發(fā)明提出了一種經(jīng)反芻動物消化后糞便中牧草殘渣的掃描電鏡(SEM)觀察樣品制備方法。通過本發(fā)明闡述的方法可以得到上述的圖像資料。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]本發(fā)明的目的在于克服上述技術存在的反芻動物糞便中未消化牧草殘渣難以分離和分辨的缺陷，提供一種掃描電鏡的樣品制備方法，通過干燥、碾破、浸泡、尼龍袋包裹洗滌、高速水流沖洗、吸水，干燥，鍍金等工藝，制備的掃描電鏡樣品干凈無雜質，無砂礫沉淀，殘渣損失小，分布均勻，肉眼觀察殘渣樣品清晰，掃描電鏡觀察時殘渣結構清晰完整，視野干凈，圖像立體感強，有利于開展反芻動物消化后糞便中未消化牧草殘渣超微結構的觀察和研究，對于直觀了解和評價反芻動物消化道微生物對粗飼料纖維結構的降解及提高秸桿飼料利用率有重要意義。
[0004]其具體技術方案為:
[0005]—種掃描電鏡的樣品制備方法，包括以下步驟:
[0006]步驟1、糞樣處理:將采用集糞袋收集來的4?5粒完整的羊糞樣置于研缽中，輕敲碾破成粒狀，注意碾破過程中不要用力過大，盡量保持動物消化后牧草殘渣纖維結構的原狀和完整性；
[0007]步驟2、尼龍袋包裹洗滌:將碾破的糞樣用事先準備好的260目尼龍布包裹起來，扎緊，置于水龍頭下，用自來水浸濕，然后將其放置在干凈的培養(yǎng)皿中，加水使之完全淹沒，浸泡約10?15分鐘；期間不斷用玻璃棒輕輕撥動包裹糞樣的尼龍布，使糞樣中的可溶解物不斷溶解濾出尼龍布;每2?3分鐘換一次水；
[0008]步驟3、培養(yǎng)皿靜置洗滌:將步驟2中浸泡好的糞樣取出，輕輕擠出多余污水;然后展開尼龍布，用裝滿水的注射器水流沖洗粘在尼龍布上的濾渣到培養(yǎng)皿中；繼續(xù)給培養(yǎng)皿中加水，攪動，繼續(xù)溶解殘渣中雜質;此時細砂，泥土等難溶顆粒物會逐步沉淀而草樣殘渣則漂浮于上面，靜置2?3分鐘，用不帶針頭注射器輕吸漂浮于培養(yǎng)皿表面的草樣，重復2?3次；
[0009]步驟4、高速水流沖洗:繼續(xù)用不帶針頭注射器吸入除去細砂和泥土的牧草殘渣和水，然后迅速將其重新推入培養(yǎng)皿中，反復多次，利用高速水流深度清洗糞樣牧草殘渣表面；
[0010]步驟5、換水:將洗滌的牧草殘渣用尼龍布過濾，濾去污水，培養(yǎng)皿重新加入干凈水;重新用注射器沖洗粘在尼龍布上的牧草殘渣于培養(yǎng)皿中；多次重復步驟4和步驟5，直至洗滌水澄清不再帶有微黃色為止;最后一次換水時使用蒸餾水；
[0011 ] 步驟6、吸水干燥:用濾紙吸干培養(yǎng)皿中多余水分;盛有牧草殘渣的培養(yǎng)皿室溫下放置48小時，使其自然變干，并保證上樣品臺時完全干燥，集中殘渣；
[0012]步驟7、樣品臺準備:將導電雙面膠帶粘貼到樣品臺上，用指尖輕粘上述干燥好的殘渣樣，保證黏貼面殘渣均勻分布，沒有重疊和損傷殘渣，按順序貼牢在膠帶上；
[0013]步驟8、樣品噴金鍍膜:新鮮樣品自身就可導電，而經(jīng)過干燥的生物樣品不能導電；這種不導電的樣品在SEM下觀察時，會產(chǎn)生電荷積累而影響觀察穩(wěn)定性;干燥的樣品用離子噴金儀msp-ls需在樣品表面噴一層金膜；
[0014]進一步，把噴金后制得的掃描電鏡樣品用S3400NHITACHI掃描電鏡進行觀察，圖像模式為SE，加速電壓1.00KV-2.0OKV，樣品臺傾斜度為O，亮度對比度為自動加手動，聚焦手動，放大倍數(shù)根據(jù)自己要觀察目的而定，。觀察到的殘渣結構干凈、清晰完整，立體感強。
[0015]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果:
[0016]本發(fā)明操作步驟簡單方便，成本低，制備的掃描電鏡樣品結構清晰，有利于開展消化后牧草殘渣超微結構的觀察和研究，這對于定性和定量了解和評價反芻動物瘤胃微生物對粗飼料纖維結構的降解和家畜對農(nóng)區(qū)作物秸桿高效利用有重要意義。
【具體實施方式】
[0017]下面結合具體實施方案對本發(fā)明的技術方案作進一步詳細地說明。
[0018]實施例1
[0019]一種掃描電鏡的樣品制備方法，包括以下步驟:
[0020]步驟1、糞樣處理:將采用集糞袋收集來的4粒完整的羊糞樣置于研缽中，輕敲碾破成粒狀，注意碾破過程中不要用力過大，盡量保持動物消化后牧草殘渣纖維結構的原狀和完整性；
[0021]步驟2、尼龍袋包裹洗滌:將碾破的糞樣用事先準備好的260目尼龍布包裹起來，扎緊，置于水龍頭下，用自來水浸濕，然后將其放置在干凈的培養(yǎng)皿中，加水使之完全淹沒，浸泡約10分鐘；期間不斷用玻璃棒輕輕撥動包裹糞樣的尼龍布，使糞樣中的可溶解物不斷溶解濾出尼龍布;每2分鐘換一次水；
[0022]步驟3、培養(yǎng)皿靜置洗滌:將步驟2中浸泡好的糞樣取出，輕輕擠出多余污水;然后展開尼龍布，用裝滿水的注射器水流沖洗粘在尼龍布上的濾渣到培養(yǎng)皿中；繼續(xù)給培養(yǎng)皿中加水，攪動，繼續(xù)溶解殘渣中雜質;此時細砂，泥土等難溶顆粒物會逐步沉淀而草樣殘渣則漂浮于上面，靜置2分鐘，用不帶針頭注射器輕吸漂浮于培養(yǎng)皿表面的草樣，重復2次；
[0023]步驟4、高速水流沖洗:繼續(xù)用不帶針頭注射器吸入除去細砂和泥土的牧草殘渣和水，然后迅速將其重新推入培養(yǎng)皿中，反復多次，利用高速水流深度清洗糞樣牧草殘渣表面；
[0024]步驟5、換水:將洗滌的牧草殘渣用尼龍布過濾，濾去污水，培養(yǎng)皿重新加入干凈水;重新用注射器沖洗粘在尼龍布上的牧草殘渣培養(yǎng)皿中；多次重復步驟4和步驟5，直至洗滌水澄清不再帶有微黃色為止;最后一次換水時使用蒸餾水；
[0025]步驟6、吸水干燥:用濾紙吸干培養(yǎng)皿中多余水分;盛有牧草殘渣的培養(yǎng)皿室溫下放置48小時，使其自然變干，并保證上樣品臺時完全干燥，集中殘渣；
[0026]步驟7、樣品臺準備:將導電雙面膠帶粘貼到樣品臺上，用指尖輕粘上述干燥好的殘渣樣，保證黏貼面殘渣均勻分布，沒有重疊和損傷殘渣，按順序貼牢在膠帶上；
[0027]步驟8、樣品噴金鍍膜:新鮮樣品自身就可導電，而經(jīng)過干燥的生物樣品不能導電；這種不導電的樣品在SEM下觀察時，會產(chǎn)生電荷積累而影響觀察穩(wěn)定性;干燥的樣品用離子噴金儀msp-ls需在樣品表面噴一層金膜；
[0028]把噴金后制得的掃描電鏡樣品用S3400NHITACHI掃描電鏡進行觀察，圖像模式為SE，加速電壓1.00KV-2.0OKV，樣品臺傾斜度為O，亮度對比度為自動加手動，聚焦手動，放大倍數(shù)根據(jù)自己要觀察目的而定。觀察到的殘渣結構干凈、清晰完整，立體感強。
[0029]實施例2
[0030]—種掃描電鏡的樣品制備方法，包括以下步驟:
[0031]步驟1、糞樣處理:將采用集糞袋收集來的5粒完整的羊糞樣置于研缽中，輕敲碾破成粒狀，注意碾破過程中不要用力過大，盡量保持動物消化后牧草殘渣纖維結構的原狀和完整性；
[0032]步驟2、尼龍袋包裹洗滌:將碾破的糞樣用事先準備好的260目尼龍布包裹起來，扎緊，置于水龍頭下，用自來水浸濕，然后將其放置在干凈的培養(yǎng)皿中，加水使之完全淹沒，浸泡約15分鐘；期間不斷用玻璃棒輕輕撥動包裹糞樣的尼龍布，使糞樣中的可溶解物不斷溶解濾出尼龍布;每3分鐘換一次水；
[0033]步驟3、培養(yǎng)皿靜置洗滌:將步驟2中浸泡好的糞樣取出，輕輕擠出多余污水;然后展開尼龍布，用裝滿水的注射器水流沖洗粘在尼龍布上的濾渣到培養(yǎng)皿中；繼續(xù)給培養(yǎng)皿中加水，攪動，繼續(xù)溶解殘渣中雜質;此時細砂，泥土等難溶顆粒物會逐步沉淀而草樣殘渣則漂浮于上面，靜置3分鐘，用不帶針頭注射器輕吸漂浮于培養(yǎng)皿表面的草樣，重復3次；
[0034]步驟4、高速水流沖洗:繼續(xù)用不帶針頭注射器吸入除去細砂和泥土的牧草殘渣和水，然后迅速將其重新推入培養(yǎng)皿中，反復多次，利用高速水流深度清洗糞樣牧草殘渣表面；
[0035]步驟5、換水:將洗滌的牧草殘渣用尼龍布過濾，濾去污水，培養(yǎng)皿重新加入干凈水;重新用注射器沖洗粘在尼龍布上的牧草殘渣培養(yǎng)皿中；多次重復步驟4和步驟5，直至洗滌水澄清不再帶有微黃色為止;最后一次換水時使用蒸餾水；
[0036]步驟6、吸水干燥:用濾紙吸干培養(yǎng)皿中多余水分;盛有牧草殘渣的培養(yǎng)皿室溫下放置48小時，使其自然變干，并保證上樣品臺時完全干燥，集中殘渣；
[0037]步驟7、樣品臺準備:將導電雙面膠帶粘貼到樣品臺上，用指尖輕粘上述干燥好的殘渣樣，保證黏貼面殘渣均勻分布，沒有重疊和損傷殘渣，按順序貼牢在膠帶上；
[0038]步驟8、樣品噴金鍍膜:新鮮樣品自身就可導電，而經(jīng)過干燥的生物樣品不能導電；這種不導電的樣品在SEM下觀察時，會產(chǎn)生電荷積累而影響觀察穩(wěn)定性;干燥的樣品用離子噴金儀msp-ls需在樣品表面噴一層金膜；
[0039]把噴金后制得的掃描電鏡樣品用S3400NHITACHI掃描電鏡進行觀察，圖像模式為SE，加速電壓1.00KV-2.0OKV，樣品臺傾斜度為O，亮度對比度為自動加手動，聚焦手動，放大倍數(shù)根據(jù)自己要觀察目的而定，最小能看50倍，甚至更小。觀察到的殘渣結構干凈、清晰完整，立體感強。
[0040]以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實施方式】，本發(fā)明的保護范圍不限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發(fā)明披露的技術范圍內(nèi)，可顯而易見地得到的技術方案的簡單變化或等效替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
【主權項】
1.一種掃描電鏡的樣品制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟1、糞樣處理:將采用集糞袋收集來的4?5粒完整的羊糞樣置于研缽中，輕敲碾破成粒狀，注意碾破過程中不要用力過大，盡量保持動物消化后牧草殘渣纖維結構的原狀和完整性； 步驟2、尼龍袋包裹洗滌:將碾破的糞樣用事先準備好的260目尼龍布包裹起來，扎緊，置于水龍頭下，用自來水浸濕，然后將其放置在干凈的培養(yǎng)皿中，加水使之完全淹沒，浸泡10?15分鐘；期間不斷用玻璃棒輕輕撥動包裹糞樣的尼龍布，使糞樣中的可溶解物不斷溶解濾出尼龍布;每2?3分鐘換一次水； 步驟3、培養(yǎng)皿靜置洗滌:將步驟2中浸泡好的糞樣取出，輕輕擠出多余污水;然后展開尼龍布，用裝滿水的注射器水流沖洗粘在尼龍布上的濾渣到培養(yǎng)皿中；繼續(xù)給培養(yǎng)皿中加水，攪動，繼續(xù)溶解殘渣中雜質;此時細砂，泥土難溶顆粒物會逐步沉淀而草樣殘渣則漂浮于上面，靜置2?3分鐘，用不帶針頭注射器輕吸漂浮于培養(yǎng)皿表面的草樣，重復2?3次；步驟4、高速水流沖洗:繼續(xù)用不帶針頭注射器吸入除去細砂和泥土的牧草殘渣和水，然后迅速將其重新推入培養(yǎng)皿中，反復多次，利用高速水流深度清洗糞樣牧草殘渣表面；步驟5、換水:將洗滌的牧草殘渣用尼龍布過濾，濾去污水，培養(yǎng)皿重新加入干凈水;重新用注射器沖洗粘在尼龍布上的牧草殘渣培養(yǎng)皿中；多次重復步驟4和步驟5，直至洗滌水澄清不再帶有微黃色為止;最后一次換水時使用蒸餾水； 步驟6、吸水干燥:用濾紙吸干培養(yǎng)皿中多余水分;盛有牧草殘渣的培養(yǎng)皿室溫下放置48小時，使其自然變干，并保證上樣品臺時完全干燥，集中殘渣； 步驟7、樣品臺準備:將導電雙面膠帶粘貼到樣品臺上，用指尖輕粘上述干燥好的殘渣樣，保證黏貼面殘渣均勻分布，沒有重疊和損傷殘渣，按順序貼牢在膠帶上； 步驟8、樣品噴金鍍膜:新鮮樣品自身就可導電，而經(jīng)過干燥的生物樣品不能導電；這種不導電的樣品在SEM下觀察時，會產(chǎn)生電荷積累而影響觀察穩(wěn)定性;干燥的樣品用離子噴金儀msp-ls需在樣品表面噴一層金膜。2.根據(jù)權利要求1所述的種掃描電鏡的樣品制備方法，其特征在于，把噴金后制得的掃描電鏡樣品用S3400N HITACHI掃描電鏡進行觀察，圖像模式為SE，加速電壓1.0OKV-2.0OKV，樣品臺傾斜度為O，亮度對比度為自動加手動，聚焦手動，放大倍數(shù)根據(jù)自己要觀察目的而定，最小能看50倍。
【文檔編號】G01N1/34GK106018027SQ201610365082
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月27日
【發(fā)明人】焦婷, 吳建平, 肖元明, 王娟, 梁建勇
【申請人】甘肅農(nóng)業(yè)大學